专利名称：整合酶融合蛋白及其在整合基因治疗中的用途的制作方法
1.发明领域本发明涉及整合酶融合蛋白及其有关整合基因治疗载体的用途。
2.发明背景设计用于基因治疗的整合载体并且特别是基于逆转录病毒的载体因为其与逆转录病毒基因治疗试验相关的副作用而具有非常不良的声誉，所述的逆转录病毒基因治疗试验旨在治疗罹患X-连锁重症联合免疫缺陷(X-SCID)的儿童。尽管所述的治疗是明显有益的，但是十分之二的接受治疗的儿童由于逆转录病毒基因组靠近癌基因的整合而发生了白血病样疾病(Marshall，2003)。这些不良影响引起了对整合载体安全性的极大关注。
杂合载体能够进行靶向转基因整合。杆状病毒-腺相关病毒载体(Palombo等人，1998)在大约41％的情形中靶向转基因整合入AAVS1位点，并且Ad-AAV杂合体具有3-35％的效率(Recchia等人，1999)。设计用来通过瞬时Rep表达介导定点整合的AAV载体达到42％的靶向效率(Satoh等人，2000)。需要更有效的并且安全的基因治疗载体用于靶向转基因整合。
研究逆转录病毒整合机制的最早的体外实验使用直接分离自经感染的细胞的整合前复合物(preintegration complexes，PIC)(Brown等人，1987；Farnet & Haseltine，1990；Lee & Coffin，1990)。最近的实验使用重组纯化的不同逆转录病毒的IN(整合酶)蛋白结合模拟病毒DNA分子末端的合成的短寡核苷酸底物。在最适条件下，这些实验表明纯化的整合酶独自能够催化整合的主要步骤，即3’末端加工和3’末端连接(链转移)反应(Bushman & Craigie，1991；Craigie等人，1990；Katz等人，1990)。
IN的3′末端加工活性需要纯化的蛋白和含有来自U5或U3 LTR末端的序列的放射性标记的双链寡核苷酸(Chow，1997；Brown，1997)。凝胶电泳是常规用于将变短的产物与底物分离的。利用类似的组合物可以进行3′末端连接(链转移)反应，但是底物进经常被“预加工”，即缺乏在3′修饰步骤中切割的二核苷酸。体外IN不识别整合靶标的特异特征，因此所述的靶标可以是与底物相同的分子或是环状质粒DNA。可以通过在凝胶电泳中出现比导入DNA长的产物来检测连接反应。任选地可以首先进行酚-氯仿提取和乙醇沉淀所述的整合产物，然后其可用作PCR模板(Chow，1997)。除了便于检测不同大小的产物，也可以使用PCR来方便整合位点的测序，以揭示可能的整合热点和HIV-1 DNA整合产生的特征性5bp重复。对于wt HIV-1 IN，连接位点非常随机，因此，产物的长度也可能变化较大(Chow，1997；Brown，1997)。
两个病毒DNA末端协同整合(3′末端连接或链转换)入靶DNA在体外较难实现。通常上述的体外实验产生一个DNA末端连接到靶DNA的一条链(半位点整合，half-site integration)(Chow，1997；Brown，1997)。可以使用分离的PIC对协同整合进行比较精确的研究，所述的PIC(除了IN外)提供全位点整合(full-site integration)所需的辅助酶(见下文)。使用环状质粒DNA作为整合靶，并且所述的事件可以通过重组产物中可选择标记的存在或通过southern印迹法进行测定。该测定非常类似于体内逆转录病毒的整合，因为重组HIV-1 IN已经显示需要病毒编码的核壳(NC)蛋白(Carteau等人，1999)或宿主来源的HMG-I(Y)(Hindmarsh等人，1999)进行有效的体外全位点整合。尽管一致认为体外全位点整合至少需要病毒NC(例如Brown，1997；Carteau等人，1999)，但是Sinha等人(2002)表明单独使用重组IN可能获得体外两个供体末端的全位点整合，无需任何细胞或病毒蛋白辅因子。他们得出如下的结论使重组野生型IN介导全位点整合的关键因素是在IN纯化中和在整合实验中避免了高IN浓度。但是，组成全位点整合产物的反应终产物涉及每个靶DNA协同插入两个LTR末端(U5和U3 LTR)，无论LTR是来自相同的底物分子或来自两个单独的底物分子。此协同整合产物不可与形成前病毒的逆转录病毒基因组的全位点整合产物相比。
HIV病毒粒子相关蛋白Vpr和Vpx可以用作载体通过其作为异源融合蛋白反式(in trans)表达将蛋白(病毒的或非病毒的)递送至病毒颗粒(Wu等人，1995，1996a和b，1997)。蛋白与HIV-1 Vpr的融合将蛋白靶向产生病毒的细胞中新形成的病毒，通过Vpr和Gag中p6蛋白的C末端之间的相互作用(Kondo & Gottlinger，1996；Lu等人，1995)。因此可以在IN缺失的HIV-1病毒粒子(Wu等人，1995)中实现整合酶(IN)功能的互补，并且能将IN融合蛋白(例如IN-LexA)引入类似的IN-缺陷病毒粒子(Holmes-Son & Chow，2000)。而且反式包装(trans-packaged)的整合酶融合蛋白能够介导正确的整合并恢复IN缺陷病毒的感染性(Holmes-Son & Chow，2002)。
3发明简述体外系统中使用病毒整合前复合物或具有短寡核苷酸的纯化的IN(整合酶蛋白)有助于揭示整合反应中的重要问题以及抑制逆转录病毒感染靶细胞的可能途径。已经将HIV-1整合酶与序列特异DNA结合蛋白融合来测试指导逆转录病毒整合的可能性。体外融合蛋白活性的测试表明该序列特异的蛋白与IN一起能够在或靠近被融合于IN的蛋白质识别的位点处整合底物序列。
特定的实施方案是新颖的融合蛋白，其由HIV-1 IN和序列特异的归巢核酸内切酶(homing endonuclease)I-PpoI(或源自H98A的I-PpoI突变体)组成，所述的归巢核酸内切酶I-PpoI可能促进基因治疗载体的安全和靶向整合。这可能是有用的，因为归巢核酸内切酶I-PpoI识别并切割其存在于真核细胞保守的28S rDNA重复中的归巢位点。设计HIV-1 IN来介导逆转录病毒样底物序列的整合，同时设计I-PpoI使整合靶向进入真核细胞基因组丰富的rDNA基因座中。
更一般地，本发明涉及用于包含逆转录病毒样核酸的转基因在真核基因组中的靶向整合的方法，其中结合核酸的限制性酶靶向基因组，而转基因被引入所述的结合位点，其中所述的限制性酶特异于丰富rDNA基因座中的位点，并与介导转基因引入的整合酶融合。
转基因的性质并不重要，其是任何能够提供用于基因治疗的基于逆转录病毒的载体的转基因。该类转基因是已知的。术语″逆转录病毒样″是指任何可与目的整合酶相容的核酸。例如，所述的整合酶来自逆转录病毒(Retroviridae)科(例如，鼠逆转录病毒，慢性病毒属如HIV，SIV，FIV，EIAV，CAEV，BIV，VMV)。
根据本发明，任何真核细胞的基因组原则上可以被修饰，但是本方法特别适用于人类。本发明目的在于指导整合而非基因产物，例如在基因组中的核糖体位点或其他位点，所述的基因组有许多拷贝(即冗余的)的所述位点。如果每个基因组有许多拷贝的靶基因，这具有下列优势，即整合过程可能是更有效(许多靶标)、安全的(因为不需要所有的基因组核糖体基因拷贝)以及降低的重要基因相互干扰的可能性，从而降低插入突变。核酸内切酶例如I-PpoI将在这些多重位点特异性切割。另一合适的酶是CreI。
可以根据所需的目的选择整合酶。通常其是慢性病毒整合酶，例如HIV-1整合酶。
融合蛋白，至少在其特定实施方案中，以及编码它的多核苷酸是新颖的。所述的蛋白可以通过用包含所述多核苷酸的表达载体转化合适的宿主并在该宿主中或从该宿主表达该蛋白来制备。优选的宿主是杆状病毒。
例证性的新融合蛋白IN-I-PpoI用于基因治疗应用。新融合蛋白能够催化逆转录病毒样DNA被靶向整合进人基因组的有益的基因座。此处所报道的研究也包括制备用于体外测试IN-I-PpoI融合蛋白活性所需的DNA构建体。归巢核酸内切酶I-PpoI识别并切割存在于人28S rDNA中的其靶位点(Monnat等人，1999)。其与HIV-1 IN结合将IN介导的治疗基因靶向整合入人体中的其rDNA位点。以前已经报道从酵母rDNA中的I-PpoI位点的异源基因表达(Lin&Vogt，2000)；这表明可作为来自真核细胞的rDNA的pol I转录本表达功能性蛋白。
4A发明描述本发明将通过优选的实施方案举例说明。这涉及制备测试新融合蛋白的整合活性和靶向能力所需的成分，所述的融合蛋白由HIV-1 IN和HE I-PpoI或I-PpoI突变形式H98A组成。目的包括1-产生表达IN-I-PpoI和IN-H98A融合蛋白以及wt HIV-1 IN(对照IN)所需的DNA构建体2-设计并产生侧接LTR的整合底物3-制备含有I-PpoI识别序列的整合靶质粒4-在细菌宿主中制备新融合蛋白。
一些一般方面是多肽整合酶，特别是慢性病毒整合酶，DNA连接，特别是有关人类rDNA，活性；编码它的多核苷酸和载体；其在转化的宿主中的表达和制备；用于给药的含有它的组合物以及其在治疗中的应用，特别是在靶向基因整合中的应用。
考虑到体外整合测试的可能的最后结果，设计在此所述的工作以提供用于测试融合蛋白IN-I-PpoI的靶向能力的第一步的最少的成分。可能的半位点整合产物可以表明HIV-1整合酶在嵌合重组融合蛋白中保持其活性。靶DNA质粒上的整合位点的分析可以清楚地表明融合至HIV-1整合酶的蛋白的靶向可能性。另外，可以通过使用I-PpoI识别位点质粒pPPOsite的简单的切割实验测定融合至IN的I-PpoI或其突变形式(I-PpoI-)H98A的内切核苷酸活性。如果体外整合实验必须产生全位点整合产物，则在整合底物中包含标记基因(EGFP)以促进这些事件的筛选。在任一情况中，可以通过PCR或RE消化来筛选整合，或者可以在整合底物中引入放射性标记用于通过放射自显影的快速观察。
图1中提供了预期的体外整合过程的概况。
在图1中，(A)是～2650bp的HIV-1供体DNA底物的图示。实体框代表EGFP(增强的绿色荧光蛋白)表达盒。(B)是使用受体DNA(pPPOsite和作为对照的pBluescript II)、整合供体DNA(来自pB2LTR+EGFP的底物)和纯化的HIV-1 IN(cIN)、IN-I-PpoI或IN-H98A蛋白的体外整合反应的图示。可能的产物包括来自两个供体DNA末端的协同整合(左侧)和来自两个或多个(中间)或一个(右侧)供体DNA分子通过一个末端整合事件的非协同整合的那些产物。
为了研究用融合蛋白IN-I-PpoI或IN-H98A可能实现的定向整合，制备了具有I-PpoI识别位点的整合靶质粒。采用来自先前使用I-PpoI的研究的识别位点的15bp序列(Mannino等人，1999；Monnat等人，1999；Ellison & Vogt，1993；Argast等人，1998)。所述的识别位点如下产生杂交两条互补的寡核苷酸G515和G517(附录I，表I-4)，然后将接头克隆到pBluescript(Stratagene)的EcoRV位点。通过I-PpoI(Promega)切割和测序验证接头的插入。无I-PpoI识别位点的pBluescript计划用作体外整合测试的对照质粒以显示在wtHIV-1 IN(本研究中为cIN)和蛋白IN-I-PpoI以及IN-H98A的整合模式中的可能差异。
同其他逆转录病毒整合酶一样，HIV-1整合酶识别位于长末端重复(LTR)的U3和U5区域的病毒DNA末端的特定特征(Brown，1997)。LTR末端被认为是通过逆转录病毒的整合机制的顺式识别所需的唯一病毒序列。在鼠和禽逆转录病毒的LTR的外缘存在短的不完全反向重复(Reicin等人综述，1995)。与位于逆转录病毒DNA末端的最外面的位置3和4的接近末端的CA(位置1和2是3’末端加工的核苷酸)一起，这些序列对于体外和体内正确的前病毒整合是必须和充分的。但是，CA二核苷酸内部的序列对最佳IN活性也是重要的(Brin & Leis，2002a；Brin & Leis，2002b；Brown，1997)。已经表明HIV-1 LTR的末端15bp对于体外正确的3’末端加工和链转换反应是至关重要的(Reicin等人，1995；Brown，1997)。HIV-1 IN使用长底物比短底物更有效表明结合相互作用从病毒DNA末端向内延伸至少14-21bp。Brin和Leis(2002a)分析了HIV-1 LTR的特定特征，并指出IN催化的协同DNA整合对U3和U5 LTR识别序列二者都需要，尽管U5 LTR对于IN体外加工是更加有效的底物(Bushman & Craigie，1991；Sherman等人，1992)。对于协同DNA整合机制需要IN识别序列的位置17-20，但是HIV-1 IN可以容忍从不变的接近末端的CA二核苷酸延伸的U3和U5末端的相当大的变异(Brin & Leis，2002b)。
为了本研究，采用了来自Brin和Leis(2002a)(其曾使用小供体DNA底物用于体外协同整合)的病毒LTR的野生型20bp HIV-1 IN识别位点。设计脱氧寡核苷酸使EGFP表达盒能够被克隆在pBluescript含有的5′和3′LTR之间。另外，设计5′和3′LTR含有唯一的ScaI位点，使得能够进行正确平末端LTR-EGFP-LTR(2LTR-EGFP)整合底物构建体的消化。平末端的整合底物而不是预加工的被产生是因为其能够检测3’末端加工以及IN催化的链转换反应。将EGFP标记基因插入LTR之间以促进可能被转化入细菌并在生物测定中被选择的全位点整合产物的识别(Brin & Leis，2002a)。从中克隆EGFP表达盒的构建体pBVboostFG+EGFP携带用于在昆虫细胞、哺乳动物细胞和细菌中蛋白表达的启动子。在克隆到pBluescript中的LTR-EGFP中保留所有这些启动子以方便可能的宿主转换用于以后的体外整合子的生物学测定。
以前已经表明HIV-1整合酶当融合至DNA结合蛋白时保留其活性，并被其融合的序列特异性蛋白靶向(Bushman，1994；Bushman，1995；Goulaouic & Chow，1996；Pavletich & Pabo，1991；Bushman & Miller，1997；Holmes-Son & Chow，2000)。在本研究中，将HIV-1整合酶基因(AF029884，克隆HXB2)与归巢内切核酸酶I-PpoI(M38131)以及将其与I-PpoI突变形式H98A融合。还亚克隆了单一形式的wt HIV-1 IN以提供用于以后的体外测试的对照。通过将cDNA亚克隆入pBluescript实现IN与其融合配偶体的融合。随后，将IN-I-PpoI，IN-H98A和cIN的cDNA转移到pBVboostFG，其是与基于GatewayTMcloning technology(Invitrogen)的噬菌体λ重组体系(Landy，1989)的重组克隆相容的通用表达载体。将构建体IN-I-PpoI，IN-H98A和cIN克隆入该载体的优点在于载体驱动的克隆基因在多种细胞中表达的多功能性。另外，将cDNA克隆入该载体简单并具有以下优点，即可以容易地从存在于pBVboostFG的构建体产生杆状病毒杆粒。杆状病毒是一直被用于在昆虫细胞中表达重组基因的节肢动物病毒，最近被作为哺乳动物细胞基因递送载体(Kost & Condreay，2002；Hüser & Hofmann，2003)。
因为可以在以前的研究中获得催化活性的细菌表达的HIV-1z IN，首先在大肠杆菌中制备IN和其融合构建体IN-I-PpoI和IN-H98A。使用两种细菌菌株发现合适的表达宿主。对照(wt)整合酶和融合构建体IN-H98A蛋白在大肠杆菌菌株BL21(DE3)和BL21-AI中的表达导致两种重组蛋白的高蛋白表达水平，如通过特异性抗整合酶和抗多组氨酸抗体的免疫印迹染色所观察的。融合蛋白IN-I-PpoI的表达很难实现，只在免疫印迹中检测到少量的蛋白。
可能的解释是融合蛋白IN-I-PpoI具有比wt I-PpoI多的序列简并性(也许由于IN的非特异性DNA结合)，或者其具有对细菌有害的新的酶促活性。在细菌实验后，在测试表达的昆虫细胞中没有发现生长抑制。这些结果表明新融合蛋白IN-I-PpoI包含一些酶活性，也许增强的DNA切割催化作用，并表明表达构建体本身是功能性的。另外，在昆虫细胞中表达IN-I-PpoI获得的好结果克服了与细菌中制备问题相关的问题。
通过定点转位机制(Landy，1989；Bac-to-Bac BaculovirusExpression system，Invitrogen；Luckow等人，1993)将pBVboostFG包含的cIN，IN-I-PpoI和IN-H98A的cDNA转移到杆状病毒基因组制备重组杆状病毒基因组(来自Autographa californica nuclearpolyhedrosis virus；AcMNP)。然后在昆虫细胞中驱动蛋白产生，其证明是成功的。可将纯化的蛋白以及整合底物引入不同细胞的核中以观察细胞DNA的整合形式。具内切核酸活性的I-PpoI可能对真核细胞有毒性，因为低于40％的人细胞(HT-1080纤维肉瘤细胞)在持续15-18天的I-PpoI表达后存活(Monnat等人，1999)。在转染HE编码质粒后，在人细胞中表达的I-PpoI能够在24-48小时后切割大约10％的在28SrDNA中的其归巢位点(Monnat等人，1999)。如果当与HIV-1 IN融合时内切核酸非活性形式的H98A的活性也太高，其应该提供某种手段以靶向整合入无归巢核酸内切酶催化的位点切割的rDNA中。另外，应当能设计具有降低的DNA切割活性或修饰的序列特异性的I-PpoI酶，因为已知该酶的结构和活性位点残基(Jurica &Stoddard，1999；Galburt等，2000；Chevalier & Stoddard，2001)。可将靶向类似HIV-1DNA的底物序列整合的融合蛋白引入到IN突变的HIV-1病毒粒子中，例如使用Bushman and Miller(1997)的反式方法。也可用相同的方法测试杆状病毒杂和体。
在本发明的一个实施方案中，在“其天然环境中”即与已知有助于整合过程的其他HIV-1蛋白一起使用IN融合蛋白。在与IN融合蛋白融合的HIV-1 Vpr的帮助下，IN-I-PpoI和其突变形式IN-H98A被靶向到新形成的HIV-1病毒颗粒。新形成的病毒出芽后，Vpr被病毒蛋白酶从融合蛋白上切割下来。因此可以通过使用细胞培养物和动物中的含有新融合整合酶的慢性病毒测试靶向的转基因整合，或者体外通过提取含有IN-I-PpoI/IN-H98A的整合前复合物(PIC)并使用其代替在前述的体外整合测定中的重组制备的蛋白质进行测试。
在本实施方案的一个实例中，通过基于megaprimer的方法将IN催化核心结构域的氨基酸D64(天门冬氨酸)突变为V(缬氨酸)。已知该突变消除了IN活性。将突变的片段克隆到慢性病毒产生质粒pMDLg/pRRE。
将IN-I-PpoI和IN-H98A基因克隆进真核表达质粒，并将HIV-1Vpr基因(来自pLR2P；Beatrice Hahn，UAB)克隆在融合基因前端。Vpr基因之后是蛋白酶切割位点，以允许在反式-包装后将Vpr从IN-融合蛋白去除。
根据标准方法制备慢性病毒载体，除了将IN-H98A编码表达质粒加入到转染的4质粒DNA混合物中。在这些初步的反式-包装测试中，使用wt IN编码pMDLg/pRRE制备病毒。
成功地将Vpr-IN-H98A融合蛋白反式-包装入新的慢性病毒载体颗粒中。
4b材料和方法4.1DNA操作的一般方法
4.1.1PCR使用附录II中所列的程序用热循环仪(PTC-200 Peltier ThermalCycler，MJ Research)进行PCR反应。在附录I中描述了用于扩增不同模板的引物。使用Pfu-聚合酶(MBI Fermentas)扩增HIV-1整合酶I-PpoI及其突变形式I-PpoIh98a的基因。使用FailSafeTMPCR PreMixselection Kit(Epicentre)进行GW-PCR(小节4.3.1)。在检查不同克隆构建体的菌落PCR(4.1.9)和其他PCR反应中使用DyNAzymeTMIIDNA聚合酶(Finnzymes)及其建议的缓冲液。
4.1.2AGE和凝胶提取在整个研究中，通过将0.8至1克的琼脂糖(Promega)溶解于100ml TBE-或TAE-缓冲液中制备用于琼脂糖凝胶电泳(AGE)的凝胶(0.8或1％凝胶，w/v)。在制胶前加入溴化乙锭(EtBr)至终浓度0.4μg/ml。在70-120伏(V)下跑胶1至4小时，然后用UV-透射仪(M-20UVP，Upland，CA，USA)观察DNA。
为了进行DNA凝胶提取，制备0.8％TBE或TAE凝胶。使用解剖刀从凝胶切下欲被提取的DNA条带。使用凝胶提取试剂盒(GenEluteTMAgarose Spin Columns，SIGMA)根据生产商的指示提取薄片中的DNA。
4.1.3DNA纯化、浓缩和沉淀使用WizardPlus DNA Clean Up Kit(Promega)或Na-Ac-乙醇沉淀法(Sambrook & Russell，2001)纯化和浓缩不同来源(来自凝胶提取物、PCR、消化等)的DNA。通常将DNA洗脱并溶解于30-50μl的灭菌的无核酸内切酶的水中。通过分光光度法确定洗脱物中DNA的浓度及其纯度。
4.1.4DNA浓度测量将样品稀释于无菌水或TE中(1∶100)进行DNA浓度测量。通过测量260nm(和280nm)处的吸光度来分光光度法测定样品中DNA的浓度，假设50ng/ml的溶液的A260值为1。样品的纯度也通过260nm和280nm的吸光度值的比值(A260/A280)来测定，假设纯DNA溶液的该比值为～1.8(Sambrook & Russell，2001)。使用UV/可见光分光光度计(Ultrospec 2000，Pharmacia Biotech)进行吸光度的测量。
4.1.5DNA消化使用来自New England Biolabs(NEB)或MBI Fermentas的限制性酶(RE)及其相应的缓冲液进行本研究中的所有消化反应。根据生产商建议的每种酶的适宜温度和缓冲液条件进行消化反应。将消化中的DNA浓度调整为大约0.1-0.5μg/μl。对于每μg的DNA使用至少1U(单位)的酶，但是RE占低于10％消化反应体积。消化反应通常进行2小时或过夜(o/n)。
当通过RE消化(限制性分析)来验证来自不同克隆的质粒制备物时，反应通常如下所示组成，在对于每种酶合适的温度温育1-2小时并在1％TBE凝胶(w/v)上分离。
2μl质粒DNA2μl 10X RE缓冲液2μl 10X BSA(只用于特定NEB酶)0.5μl每种RE加H2O至20μl4.1.6DNA连接将插入物连接进线性化载体涉及在相邻的5′-磷酸和3′-羟基残基之间形成新的磷酸二酯键。在本研究中，通常使用5-15U的噬菌体T4 DNA连接酶(MBI)、1X T4连接酶缓冲液、可变量((50-150ng)的经消化的载体和至少3X摩尔过量于载体DNA的插入DNA进行连接反应。在无菌的Eppendorf管中混和所有的连接成分，并使用无菌的无核酸内切酶的水使反应体积为10或15μl。粘末端连接通常在室温(RT，22℃)温育30-60分钟，而平末端连接在16℃温育过夜(o/n)。通常在插入物连接的同时进行背景连接对照(水替代插入DNA)以确定非重组子的背景水平。
4.1.7细菌转化使用连接混合物的稀释物(大约500和250pg DNA/μl)转化感受态大肠杆菌(E.coli)DH5α细胞(Gibco)，每30μl感受态细菌使用1μl的每一稀释物。转化前通过在65℃温育连接混合物10分钟使T4 DNA-连接酶失活。通过热冲击方法如下进行转化在预冷的eppendorf管中将稀释的连接混合物与DH5α细胞混和，轻轻震荡并置于冰上30分钟。将细菌在+42℃水浴中进行热冲击40秒，然后置于冰上2分钟。然后在细菌上加入1xSOC(80μl)使细胞在震荡孵育器中恢复1小时(37℃，250rpm)。将细胞涂布于LB(Luria-Bertani)-琼脂平板上，供有该平板适当的抗生素用于转化的细菌的选择。如果使用重组的pBluescript克隆的蓝/白颜色选择，在平板的表面上涂布50μl 2％X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷)，令其吸收30-60分钟后进行细菌涂板。将30μl的pBluescript中lacZ基因的诱导剂IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)直接与涂板的细菌混和。
除了连接对照反应，也同时进行阳性和阴性转化对照，对其进行与连接混和反应相同的处理。阳性转化对照包含用完整的质粒DNA转化的细菌，阴性对照转化用无菌水代替任何的DNA。阳性对照表明转化反应过程有效进行，而阴性对照用于显示转化过程中可能的DNA污染。琼脂平板在37℃温育o/n。
4.1.8质粒DNA的纯化和分析转化的第二天，从LB平板上选择单一白色菌落并接种入5ml的补充有适当抗生素的1xLB中。细菌在震荡培养器中(250rpm，+37℃)生长12-16小时提高质粒的产量。在第二天，收集2-5ml的每一细菌培养物并使用小量质粒制备试剂盒(WizardPlus SVMinipreps DNA Purification System，Promega)根据生产商的规程分离质粒DNA。通过不同的限制酶消化和琼脂糖凝胶电泳确定质粒制备物。通过将细菌o/n培养物与99+％甘油(Sigma)等量混和制备每一成功克隆的甘油贮存物，然后贮存于-20℃。
4.1.9菌落PCR(colony PCR)有时，首先通过菌落PCR而不是小量质粒制备来确证克隆成功。菌落PCR，使用细菌菌落作为模板进行PCR来快速检测克隆成功。对于每组被测试的菌落，制备PCR预混合物(master mix)(参见以下)。将预混合物等分于无菌的eppendorf管中，通过用吸管头轻触菌落并然后在PCR管中冲洗引入作为模板的细菌(小心不要挑取整个菌落)。或者，将菌落悬浮于50μl的含有适当抗生素的1X LB中，令其在震荡培养器(37℃，250rpm)中生长2小时，然后使用2μl的培养物进行修正的菌落PCR反应。在后一方法中，可以在96孔板上同时筛选大量菌落。使用程序DPESKE(附录II)进行PCR，反应条件如下所述。PCR产物在1％的TBE凝胶中通过AGE进行检测。
一个20μl的PCR反应的组成如下15μl(或13μl)PCR等级的水，2μl 10x Dynazyme PCR缓冲液(含MgCl2)1μl DMSO(二甲亚砜，终浓度5％)0.5μl dNTPs(10mM)，0.5μl引物T30.5μl引物T7(用于pBluescript的标准引物)0.5μl-(1U)DyNAzymeTMII DNA聚合酶(Finnzymes)(2μl细菌培养物或挑取的克隆作为模板)4.1.10通过寡脱氧核糖核苷酸杂交制备DNA接头在100μl无菌的无核酸内切酶的水或TE中混和等量的合成的互补寡脱氧核糖核苷酸(1nmol)。该溶液在95℃温育10min以使链变性，并使其在加热块(block)中缓慢冷却至室温(RT)。缓慢冷却确保所述链正确退火而没有任何非互补配对或不希望的二级结构构象。
4.1.11重组构建体的序列验证在DNA Synthesis and Sequencing Facility of the A.I VirtanenInstitute for Molecular Sciences，Kuopio用两台自动DNA测序仪(ALF and ALFexpress，Pharmacia)对所有DNA构建体进行测序。对每个测序反应需要1微克的模板DNA。测序不同样品使用的引物列于表4.6-I中。使用DNAMAN(version 5.2.9，Lynnon BioSoft)分析所有的测序结果。
4.2制备表达构建体IN-I-PpoI，IN-H98A和cIN首先PCR扩增HIV-1整合酶(Groarke，Hughes，Dutko；Hong等人，1993；Sioud & Drilca，1991)、I-PpoI(Muscarella & Vogt 1989，Muscarella等人，1990)和I-PpoIh98a的基因(Arnheim & Erlich1992)，然后亚克隆入EcoRV消化的pBluescript。融合亚克隆的基因产生构建体pIP(IN-I-PpoI)和pIH(IN-H98A；参见图4.5-I的质粒图谱)。使用GATEWAYTMCloning Technology(GibcoBRL，LifeTechnologies)修饰这些基因融合体并转入表达(目的)载体pBVboostFG。
4.2.1将IN、cIN、I-PpoI和H98A基因亚克隆入pBluescript分别从质粒pLJS10、pCNPpo6和pCNPpo6h98a获得HIV-1 IN，I-PpoI和I-PpoIh98a基因的cDNA。质粒pLJS10获自AIDS Researchand Reference Reagent Program，Division of AIDS，NIAID，NIHpLJS10来自JM Groarke，JV Hughes和FJ Dutko博士。质粒pCNPpo6和pCNPpo6h98a由University of Washington，Seattle的RaymondJ.Monnat Jr.教授惠赠。
基于获自质粒提供者和GenBank(登录号IN-AF029884；I-PpoI-M38131；I-PpoI(h98a)-1CYQ-C)的序列信息设计用于每种基因的特异寡核苷酸引物(附录I)。除了3′IN(合成于TAG CopenhagenA/S)的所有引物在DNA Synthesis and Sequencing Facility of theA.I Virtanen Institute for Molecular Sciences，Kuopio使用ABIDNA合成仪合成。在引物中包含用于克隆目的的限制性酶位点(附录I)。
PCR反应组成如下，并且使用程序DS2006(附录II)进行该PCR反应来扩增基因IN、cIN、I-PpoI和H98A。使用引物F992和3′IN扩增IN；使用F992和3′cIN扩增cIN。使用相同的引物组(F987和G7)来扩增I-PpoI和H98A，因为后者的点突变不与引物序列一致。所有的插入物在40μl组成如下的反应中使用重组Pfu聚合酶(MBIFermentas)进行扩增27μl PCR等级的水4μl 10X用于重组Pfu聚合酶的缓冲液(+MgSO4)1μl DMSO(二甲亚砜，终浓度2，5％)1μl dNTPs(10mM)2μl 5′引物(20μM)2μl 3′引物(20μM)1μl Pfu聚合酶(2，5U)2μl模板DNA(1∶100稀释的pLJS10、pCNPpo6和pCNPpo6h98a)通过将反应的等分部分在1％的TBE凝胶上进行AGE检测PCR反应。然后将剩余的PCR产物荷载至0.8％TAE凝胶上，从中提取正确的PCR产物。如4.1所述对相应于目的PCR产物的条带进行凝胶提取和纯化。分光光度法对洗脱物中的DNA的浓度和纯度进行测定(4.1.4)。
通过Pfu聚合酶扩增的PCR产物具有平末端，所以平末端克隆用于将IN、cIN、I-PpoI和H98A基因亚克隆入噬粒(phagemid)pBluescript(pBluescriptII SK-/+，Stratagene)。用平末端切割酶EcoRV(MBI)消化pBluescript使其线性化。+37℃温育2小时后，通过将等分部分在1％的TBE凝胶上检测所述的消化。为了将线性化的载体与残余量的完整未消化的超螺旋DNA分离，用GenEluteTMAgarose Spin Columns进行凝胶提取全部样品，并用DNA Clean Up Kit纯化。
通过将每种连接混合物(100ng载体，2μl T4连接酶(10U)，1μl10X T4连接酶缓冲液，100-125ng的插入DNA(凝胶提取和纯化的PCR产物)和3,5μl H2O)于+16℃温育o/n将IN、cIN、I-PpoI和H98A平末端连接入EcoRV消化的pBluescript。
如4.1.7节所述，将连接混合物转化进感受态大肠杆菌DH5α细胞。将细菌涂板于供有氨苄青霉素(75μg/ml)和50μl X-gal的LB平板上。涂板前将30μl的IPTG与细菌混和。平板在37℃孵育o/n。第二天，从LBamp平板上选择白色分离的克隆，在5ml LBamp培养基中培养，并如4.1.8节所述对培养物进行质粒制备。通过限制酶分析和凝胶电泳对质粒制备物进行鉴定。用EcoRI(NEB)消化IN和cIN的小量制备物。正确的制备物通过用PacI和XbaI(NEB)(PacI和SfiI用于cIN克隆)消化进一步验证，所述的位点是在PCR过程中引入IN基因。类似地，用BamHI消化以及SpeI-SfiI双消化(NEB)验证含I-PpoI或H98A的质粒。所有的消化如前所述通过AGE检测。pBluescript中正确的克隆对于整合酶命名为pBIN，对于对照整合酶命名为pBcIN，对于I-PpoI命名为pBIPpoI以及对于H98A命名为pBH98A。
4.2.2由IN和I-PpoI/H98A产生融合基因通过基于限制酶的亚克隆获得两个基因(IN与I-PpoI或H98A)的融合体(Sambrook & Russel，2001)。首先，通过不同的RE-消化推测pBluescript中插入物的方向。IN基因以下列方向存在于pBluescript中，即通过XbaI-消化后，其3′末端与质粒分离，但其5′末端仍与质粒连接。用SpeI消化I-PpoI和H98A后其与质粒分离。
pBIN用XbaI消化产生粘末端(可以连接在一起的交错排列的切割末端)用于SpeI消化的pBIPpoI或pBH98A片段的插入。将2μl的SAP(虾碱性磷酸酶，1un/μl)加入到pBIN-消化反应中以最小化背景水平，即防止未连接的pBIN质粒自身连接，而只转化连接混合物。用SpeI从质粒上消化下I-PpoI和H98A插入物，并由0.8％TBE凝胶提取所述的片段。使用前述相同的条件(4.1.6节)将纯化的I-PpoI和H98A片段各自连接线性化的、纯化的pBIN。如4.1.7节所述转化连接混合物。不从所得到的菌落提取质粒DNA，而是通过菌落PCR(4.1.9)验证成功的克隆。将给出希望结果的菌落接种5ml的LBamp，如4.1.8节所述小量制备。通过PvuII消化和AGE验证小量制备物。由消化的样品推测两个cDNA彼此的方向。正确取向的克隆对于整合酶-I-PpoI融合体命名为pIP，而对于整合酶-H98A融合体命名为pIH。测序验证每种构建体的一个克隆(4.6)。
4.2.3突变校正克隆pIP5和pIH5的测序显示在IN基因的位置212处的一个无义突变，其在pBcIN5克隆中不存在。利用pBcIN5如下修复pIP5和pIH5用PacI和Af1II从pIP5和pIH5消化下527bp的片段，并用来自pBcIN5的对应的但未突变的片段替换。凝胶提取pIP5和pIH5的质粒主链，弃掉含有突变的插入片段。分离并纯化从pBcIN切割的正确的片段，然后用于连接进消化后的pIp和pIH质粒。如前4.1所述进行连接、转化和质粒分离。可以只通过测序验证成功的克隆。用列于表4.6-I的引物测序名为pkorj.IP3，pkorj.IH7的克隆。
4.2.4表达载体的构建为了将融合基因IN-I-PpoI和IN-H98A以及c-IN克隆转换入能够在细菌、昆虫和哺乳动物细胞中表达的构建体，将所有的插入物亚克隆进新的表达载体。首先使用基于重组的GATEWAYTM克隆技术(GibcoBRL，Life Technologies)通过基于重组的BP反应将GW-PCR修饰的基因引入供体质粒pDONRTM(Invitrogen)中。再次通过LR反应将基因从该质粒转到修饰的目的载体pBVboostFG中，其中具有用于转基因在不同生物体中表达所必需的启动子元件。在融合基因的5′末端引入聚组氨酸标签(6X His)。
4.2.4.1Gateway(GW)-PCR为了通过GATEWAY重组技术产生pkorj.IP3，pkorj.IH7和pBcIN5的进入克隆，将DNA元件(attB1和attB2)通过PCR引入基因的5′末端。设计引物(附录I，表I-2)以含有序列attB1和attB2，并进一步修饰5′引物使其含有六个另外的组氨酸编码密码子以有助于以后的蛋白质纯化。使用FailSafeTMPCR PreMix selection Kit(Epicentre)，使用该试剂盒包含的缓冲液A至L(含有dNTP、不同量的MgCl2以及具甜菜碱的FailSafe PCR Enhancer的缓冲的盐溶液)、FailSafe PCR酶混合物(DNA聚合酶)以及程序GW-2701或GW-cIN(附录II)进行PCR。对于50μl的PCR反应使用1-3ng的每种模板(pkorj.IP3，pkorj.IH7或pBcIN)。如前所述，产物用0.8％TBE凝胶进行的胶提取，并通过乙醇沉淀浓缩。
4.2.4.2通过BP和LR反应构建最终的表达载体根据生产商的规程对质粒pkorj.IP3，pkorj.IH7和pBcIN5进行BP反应，并将产物转化大肠杆菌DH5α细胞(4.1.7)。如4.1.8中所述进行质粒制备。所得的供体质粒制备物(进入克隆)通过PvuII(MBI)消化进行验证，然后其用作下面LR反应的模板。类似地，根据生产商的指示进行将转基因从供体载体转入目的载体(在本研究中为pBVboostFG)的LR反应，并转化入DH5α细胞。通过PvuII消化验证所得克隆的质粒制备物。使用引物G502，G550，G449和G448(附录I，表I-3)通过测序验证最终目的载体中的基因构建体。正确的克隆命名为pDIP2，pDIH1和pDcIN1用于细菌蛋白制备(4.6)。
4.3制备整合靶质粒(pPPOsite)采取来自以前使用酶的研究(Mannino等人，1999；Monnat等人.，1999；Ellison & Vogt，1993；Argast等人，1998)的I-PpoI核酸内切酶的切割位点的序列。为制备含有单一特异性I-PpoI切割位点的质粒，将含有I-PpoI识别序列的双链寡核苷酸插入pBluescript的EcoRV位点。构成该识别位点的两种5′磷酸化的15聚体互补的寡核苷酸链G515和G517(附录I，表I-4)退火形成双链位点(I-Ppo-oligo)。等量混和所述的链并如4.1.10节所述进行杂交。
如前所述用EcoRV消化pBluescript并用SAP(2U)处理，如4.1所述凝胶提取和纯化。使用比消化的质粒(225ng)15X摩尔过量的插入物(17.5ng)将接头I-Ppo-oligo连接至线性化的且纯化的质粒，反应混合物在+16℃温育过周末(o/we)。利用如前所述的热冲击法将稀释的连接混合物转化DH5α细胞。如4.1.7节所述，从选择的细菌菌落的生长培养物进行小量质粒制备，并用I-PpoI(Promega)消化验证。
4.4产生整合底物(pB2LTR+EGFP)为了产生用于体外研究的整合底物，产生类似病毒长末端重复末端的双链供体DNA。首先，对于两种LTR(3′和5′LTR)，基于获自使用HIV-1整合酶的体外实验的研究的序列信息(Brin和Leis，2002a)合成两种互补的并且5′磷酸化的30聚体寡脱氧核苷酸。等摩尔量(100pmol)的5′和3′LTR(分别为G604+G605和G569+G570，附录I，表I-4)互补寡核苷酸如4.1.10所述进行退火。
用SpeI消化pBluescript，如前所述由0.8％TBE凝胶提取并纯化。然后将线性化的质粒用Kpn I消化并用SAP(2U)处理，凝胶提取和纯化。在标准的15μl连接反应中使用200ng的载体，所述的反应含有2.5μl的3′LTR制备物(25ng)。在室温进行连接30分钟，然后加入0.5μl T4连接酶缓冲液(10X)，1μl T4 DNA连接酶，1μlH2O和2.5μl的5′LTR制备物(25ng)将体积增加至20μl。再继续连接反应30分钟，之后使连接酶失活并将混合物转化DH5α细胞(4.1.7)。在第二天，对浅蓝色克隆进行质粒制备，其用ScaI消化验证。在将标记基因盒插入在LTR之间前，通过测序验证这些pB2LTR质粒制备物(#1)之一。
从pBVboostFG+EGFP中SphI消化下欲被插入在LTR序列之间的2561bp的EGFP(增强绿色荧光)盒，如前所述进行凝胶提取盒纯化。pB2LTR#1(含有5′和3′LTR)也用SphI消化并用SAP处理。在15μl的连接反应中将EGFP标记基因盒连接至经消化和纯化的pB1，所述的连接反应包含110ng消化的质粒、3倍其摩尔量的EGFP插入物(大约280ng)、12.5U T4 DNA连接酶和1.5μl of 10X T4 DNA连接酶缓冲液。连接反应首先在室温进行1小时，然后继续在冰箱中(+8℃)o/we。将稀释的连接混合物及其对照转化DH5α大肠杆菌细胞。选择10个所得的白色菌落进行质粒制备，其用ScaI消化进行检测。正确的克隆命名为pB2LTR+EGFP(1-10号)并通过ScaI消化和测序验证。
4.5重组构建体的序列验证测序不同质粒所用的引物列于附录I中。用表4.5-I中所列的四个引物对质粒pIP5和pIH5(来自4.2.3)以及它们的校正形式pkorj.IP3和pkorj.IH7(来自4.2.4)进行测序。用T7和T3引物对pBcIN5、pPPOsite6以及pB2LTR+E6克隆进行测序。用引物G502、G550、G448和G449对pBVBoostFG中的表达克隆pDIP2和pDIH1进行测序。用引物G502和G550对pDcIN进行测序。使用DNAMAN(version 5.2.9，Lynnon BioSoft)分析所有的测序结果。所有的DNA构建体除了表达质粒在附图2中进行了说明。
表4.5-I用于测序不同DNA构建体的引物。引物序列列于附录I中。
4.6细菌蛋白表达使用感受态大肠杆菌菌株BL21(DE3)(Stratagene)和BL21-AITMOne Shot(Invitrogen life technologies，catalogue no.C6070-03)作为表达宿主用于蛋白质制备。在蛋白表达实验过程中采取感染后0h、1h和3h的时间点，并对每个测试的克隆制备甘油贮存物。通过SDS-PAGE(4.7.1)和Western印迹(4.7.2)分析蛋白产生。
4.6.1分析规模的细菌蛋白制备首先在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中进行蛋白制备。用表达载体pDIP2、pDIH1和pDcIN1和pINSD.His转化细菌。带His标签的HIV-1IN编码质粒pINSD.His通过AIDS Research and Reference ReagentProgram，Division of AIDS，NIAID，NIH从Dr.Robert CraigiepINSD.His获得。如下进行转化在转化的前一天将来自甘油贮存物或未转化的菌落的细菌涂布在LB平板上以产生“新鲜的平板”并获得活菌落。第二天，使用10μl接种环挑取分离的菌落并悬浮于100μl冰冷的(+4℃)CaCl2中。悬浮的细菌在冰上温育15分钟使其成为感受态用于DNA摄取。将DNA加入悬浮液中(大约50-100ng，0.5-1μl)，之后将混合物再在冰上温育30分钟。然后，细胞在42℃热冲击45秒，并立即置于冰上2分钟。向细胞中加入450μl S.O.C，然后使其在震荡培养器(37℃，230rpm)中恢复30-60分钟。在LBg平板(LB平板补充有庆大霉素)上涂板不同量的转化混合物(50-150μl)并在37℃o/n温育过夜。
第二天，从每个转化的构建体选择几个菌落并在37℃，250rpm条件下培养于5ml的供有庆大霉素(7μg/ml)的1X LB中直至OD600(600nm处的培养物的光密度)达到0.6-1.0。从这些初始培养物中取200μl用于接种3.8ml新鲜LBg(1∶20稀释初始培养物)。在所有实验中将未转化的BL21(DE3)样品用作表达样品的对照。
接种的培养物在37℃，250rpm下生长1.5至3小时，直至它们达到mid-log期(0D600≈0.4)。加入IPTG至终浓度1mM诱导蛋白质产生。诱导前从每个培养物收获1ml样品(未诱导的，0h)。在诱导后1h和3h(或每个整小时，直至4小时)收集另外的1ml样品。收获后，立即通过离心(4000xg，2min)沉淀所有的样品，悬浮于20-60μl的无菌水中并稀释于4X SDS-PAGE样品缓冲液中。然后将样品95℃加热5分钟裂解细胞并储存于-20℃直至通过SDS-PAGE分析。一部分样品此时不煮沸但立即储存于-20℃。
也在大肠杆菌菌株BL21-AITMOne Shot(Invitrogen)中测试了蛋白质产生。每个构建体pDIP2，pDIH1和pDcIN1的转化使用一瓶或半瓶(50或25μl)的BL21-AITM。根据4.1.7节所述的基本转化程序进行转化。对每个构建体选择3个转化子(菌落)，如针对BL21(DE3)所述培养初始培养物。使用200μl的这些培养物接种3,8ml的新鲜LBg(1∶20稀释初始培养物)。未转化的BL21-AI样品用作对照。接种的BL21-AI培养物在37℃或30℃，250rpm下生长1.5至3小时，直至培养物的OD600至大约0.4。加入L-阿拉伯糖(20％贮存液，Invitrogen)至终浓度0.2％和IPTG至终浓度1mM、0.1mM或0.01mM诱导蛋白质产生。另外，测试了生长培养基中葡萄糖对IN-I-PpoI(来自pDIH)蛋白产生的影响。加入葡萄糖至终浓度0.1％，其他所有步骤如前所述进行。除了测试低生长温度对蛋白降解的影响时(30℃)以外，表达培养物通常在37℃生长。收集蛋白产生样品并如BL21(DE3)样品一样进行处理。
4.7蛋白表征收获后立即制备用于SDS-PAGE的细菌蛋白表达样品。在上样凝胶前，在95℃加热样品5分钟，并置于冰上。在硝酸纤维素滤膜上印迹SDS-PAGE凝胶(Western印迹)，通过特异灵敏的抗体染色鉴定印迹的蛋白。基于缀合于二抗的碱性磷酸酶活性利用抗体检测蛋白质(Blake等人，1984)。
4.7.1.SDS-PAGE使用Mini Protean IITM或Mini Protean IIIITM装置(BIO-RAD)进行SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)。首先灌注10％的电泳胶(running gel)和4％的成层凝胶(stacking gel)(附录IV；Sambrook & Russell，2001)。在积层凝胶的孔中上样10μl分子量标记(SeeBluePre-Stained Standard，Invitrogen)和20-50μl样品以及对照。凝胶首先用100V电泳10-20分钟使样品迁移通过浓缩胶(成层胶)。然后将电压升高至180V(或对于Mini Protean IIITM装置为200V)，凝胶再进行电泳约60分钟。
4.7.2免疫印迹(Western印迹)使用BIO-RAD Mini Trans-Blot装置根据生产商的指示将SDS-PAGE分离的蛋白质转移到硝酸纤维素膜(BIO-RAD Trans-BlotTransfer Medium Pure Nitrocellulose Membrane，＝0.2μm)。在冷Kodak缓冲液中在100V进行转移1小时，之后，将印迹在0.5M TBS缓冲液中浸泡5分钟。通过用Ponceau S染料溶液使其覆盖印迹染色膜(RT，5分钟，搅拌)显现滤膜上的所有蛋白。用蒸馏水洗涤膜数次而终止反应。然后将膜转到封闭溶液中(5％脱脂奶粉(NFDM)，在TBS缓冲液中新鲜配制)并在旋转震荡器上室温搅拌60分钟或4℃过夜。
本研究中使用的一抗是(1)HIV-1整合酶肽的抗血清aa 23-34(NIH AIDS Research & Reference Reagent Program，catalogue#757)和(2)小鼠的单克隆抗多组氨酸-碱性磷酸酶缀合物(SIGMA)。(1)的二抗是山羊抗兔IgG(H+L)-AP缀合物(BIO-RAD)。在抗体检测阶段的所有温育在旋转振荡器上进行。
封闭后，用TBS-Tween冲洗印迹5分钟，并在一抗溶液(在TBSTween中新鲜配制的1∶2000的抗IN和抗Histag(在5％的NFDM中)，每张膜10ml)室温温育1小时。如果使用抗整合酶染色，用TBS-Tween洗涤未结合的一抗(4×5分钟)。然后将印迹在酶联免疫二抗溶液(于5％NFDM-TBS-Tween中的山羊抗兔IgG，1∶3000)中室温温育1小时。再次用TBS-Tween冲洗膜(4×5分钟)以消除未结合的二抗。当使用抗多组氨酸抗体染色时，在一抗探查后用TBS-Tween冲洗印迹(4×5分钟)，不使用二抗。
在蛋白质比色检测前，通过温育持续大约5分钟在APA缓冲液中平衡膜。如下进行检测将滤膜在NBT/BCIP底物溶液(RocheDiagnostics GmbH，Mannheim，Germany)、16μl/ml的NBT/BCIP(于APA缓冲液中)、每张滤膜5ml中于室温温育5-15分钟。通过用去离子水洗涤膜数次终止颜色反应。干燥滤膜并对染色结果进行分析。
5结果5.1制备cIN、IN-I-PpoI和IN-H98A的表达构建体质粒pLJS10包含HIV-1整合酶基因(IN)(Hong等人，1993；Sioud& Drilca，1991)。质粒pCNPpo6包含编码粘菌多头绒泡菌(PhysarumPolycephalum)的归巢核酸内切酶I-PpoI的真核内含子的基因(Muscarella & Vogt，1989；Muscarella等人，1990)。质粒pCNPpo6h98a中的I-PpoI基因(I-PpoI)带有将98位氨基酸残基组氨酸替换为丙氨酸的突变。酶活性位点的组氨酸98(H98)是有效催化DNA断裂的关键，其突变位丙氨酸极大降低了该蛋白质的核酸内切酶活性(Mannino等人，1999)。因此，本篇将H98A突变、核酸内切活性丧失的I-PpoI基因称作H98A。质粒pLJS10、pCNPpo6和pCNPpo6h98a未经预先核实其序列便投入使用。
5.1.1亚克隆IN、I-PpoI、H98A和cIN基因如4.2.1节所述PCR扩增HIV-1整合酶、I-PpoI和H98A基因。设计用于PCR扩增的引物(附录I，表I-1)，以便在基因的5′和3′端引入新的RE位点。制备两种形式的IN基因，其中之一在PCR生成的3′-XbaI-末端连接5′-SpeI末端的I-PpoI和H98A(IN)，另一则表达为不带融合部分(cIN；对照IN)。在1％TBE凝胶上检查PCR反应。整合酶基因的PCR产物长870bp，I-PpoI和H98A基因产物为570bp。
为了将PCR产物亚克隆到pBluescript(Stratagene)，将该质粒用平端切割酶EcoRV消化、凝胶提取并纯化。凝胶提取经消化的载体通常可大大降低非重组的亲本载体所致背景水平。Pfu聚合酶生成的平端PCR产物缺少将插入物连入线性化质粒所需的5′磷酸，因而未使用SAP。凝胶提取的线性化的pBluescript长2961bp。
如4.2.2小节所述，将PCR扩增的插入物IN、cIN、I-PpoI和H98A连接到经EcoRV消化的pBluescript。选择噬菌体T4DNA连接酶(MBI)，因其既能连接平端、也能连接粘性DNA片段(Sambrook和Russel，2001)。将IN、cIN、I-PpoI和H98A与EcoRV消化的pBluescript的连接混合物转化大肠杆菌(E.coli)DH5α细胞。转化前将连接混合物加热到65℃10分钟以灭活连接酶。热灭活步骤可以提高转化子数目两个数量级(Michelsen，1995)。如前所述，利用限制性分析(4.1.5)和AGE确认从所得菌落小量制备物的所有构建体。
为筛选包含IN和cIN的克隆，首先用EcoRI消化小量制备物。通过TBE胶观察，预期成功的克隆出现大小为465和3366bp的两条带(图5.1.1-III，泳道3-5)。使用RE PacI和XbaI，或者对于cIN克隆使用PacI和SfiI双酶切，进一步确认得到预期结果的小量制备物。这些位点是在PCR反应中被引入插入物末端的。通过分离出IN和cIN基因所对应的870bp片段可以观察到正确的克隆。
类似地，利用BamHI消化质粒制备物来检查包含I-PpoI或H98A的质粒。预期正确克隆出现336和3202bp两条带。利用插入的特异性限制酶SpeI和SfiI双酶切，产生570bp大小的I-PpoI或H98A插入物，来对克隆进一步确认。对于pBluescript中插入物的正确克隆，整合酶命名为pBIN，对照整合酶为pBcIN，I-PpoI为pBIPpoI，H98A为pBH98A。每种正确克隆挑选一个，用于制备融合基因构建体。
5.1.2制备融合基因IN-I-PpoI和IN-H98A将位于pBIN中的IN基因与来自pBIPpoI和pBH98A的I-PpoI和H98A片段融合。根据RE消化来推断基因在其相应质粒中的定位。pBIN经XbaI消化，发现其5′端连接到质粒，基因3′端随质粒线性化而游离。考虑到将I-PpoI和H98A片段融合到整合酶3′端，这种定位最为有利。相反，pBIPpoI和pBH98A克隆经SpeI(该酶产生与XbaI形成的交错切口相容的末端)消化之后，发现与所插入的转基因分离。发生分离是由于质粒骨架中存在另一SpeI位点，接近插入物3′端(图3)。因而将SpeI酶切的″融合部分基因″片段连接到XbaI线性化的pBIN，进行I-PpoI和H98A与IN的融合。
如4.1.7所述，将包含XbaI线性化pBIN以及SpeI消化的I-PpoI或H98A片段的连接混合物转化DH5α细胞。首先利用菌落PCR(4.1.9)，而不是通过从随机挑选的菌落直接进行质粒的小量制备，来筛选带有所需基因融合的克隆。带有融合I-PpoI或H98A的IN基因的菌落，预期≈1610bp的PCR产物(170bp来自pBluescript+1440来自融合的插入物)，而只有IN基因插入物的质粒(″背景″克隆)会得到≈1040bp产物(170+870bp)。将得到预期1610bp结果的菌落接种5ml LBamp，如前4.1所述，对培养物进行小量制备。
SpeI消化的I-PpoI或H98A片段能够按两个方向连接到XbaI消化的pBIN(图4a和4b)，因为该片段的5′和3′端均与所消化载体的末端相容。利用PvuII消化来确认包含IN-I-PpoI或IN-H98A融合物的质粒制备物。除表明存在该基因融合之外，PvuII消化还可揭示插入物相对彼此间的定位。鉴于该融合基因所编码的新蛋白质的功能性，IN融合的基因的正确定位极为重要。
理想的融合物(I-PpoI或H98A的5′端连接到整合酶3′端，图4b)经PvuII消化得到大小306、728、861和约2500bp的4条带。错误定位会产生306、403、1186和约2500bp的条带。命名正确定位的克隆，针对整合酶-I-PpoI融合物为pIP，针对整合酶-H98A融合物为pIH。
5.1.2.1测序结果质粒pBcIN5、pIP5和pIH5利用pBluescript标准引物T7和T3测序。每一测序反应得到跨越pBluescript中约500bp转基因序列的双向序列。质粒pIP5和pIH5再利用引物G448和G449测序(表4.6-I)。这些引物被设计为与融合基因中央区反向退火，并用于扩增使用T3和T7未能得到的序列区域。使用DNAMAN(版本5.2.9，Lynnon BioSoft)分析测序结果，比较所得序列与模板序列(AF029884(HIV-1 IN)，M38131(I-PpoI))以及质粒pCNPpo6和pCNPpo6_h98a的序列。
发现pBcIN5中对照整合酶基因序列正确，除了有一个沉默点突变之外，所述沉默点突变并不影响该突变密码子所编码的氨基酸残基。相反，质粒pIP5和pIH5均受IN基因212位的无义突变影响。该突变可导致所表达蛋白质严重截短，必须纠正该突变质粒。质粒pIP5和pIH5的I-PpoI和H98A编码部分也不同于来自质粒(pCNPPo6和pCNPpo6h98a)供者的序列信息。为了确认此结果，利用与pIP5和pIH5相同的引物(表4.5-I)，对融合构建体(pIP2 and pIH7)的第二个克隆进行测序。
利用引物G7和F987(附录I)测序亲本质粒pCNPPo6和pCNPpo6h98a。发现上述质粒的实际序列不同于质粒供者提供的原始序列信息，彼此不只预定的一个位点(pCNPpo6h98a中His98突变)不同。通过测序pCNPPo6和pCNPpo6h98a得到的序列，比质粒供者提供的序列信息(图5)更类似于I-PpoI的野生型序列(M38131)。还发现预定的H98A突变之外的序列差异对不同密码子编码的氨基酸没有影响。因此，从pIP5和pIH5得到的I-PpoI和H98A编码序列也是正确的，因为它们对应于野生型蛋白质的氨基酸序列。
图5显示相同序列，一致性序列(″星号″)行的空隙表示序列差异。第一个空隙(1)的碱基差异不影响所涉及密码子编码的氨基酸。(2)的差异也是沉默型，除了pCNPpo6h98a供者序列中GCN所示His98突变(黑体所示密码子，野生型编码His，突变密码子编码Ala)以外。情况(3)表示亲本质粒相比I-PpoI野生型序列的序列差异，但发现质粒pCNPpo6h98a的实际序列与野生型序列相同。质粒pCNPpo6只有预定的His98编码三联体不同于野生型序列。
5.1.3纠正pIP5和pIH5的突变pBcIN5的IN基因不包含在pIP5和pIH5融合插入物质粒212位所发现的无义突变。这部分归因于用来按不同目的扩增整合酶基因的不同PCR反应(具有不同引物；附录I)，还因为同一反应的PCR产物可能具有异质性。
利用pBcIN中的未突变IN基因修复带有无义突变的pIP5和pIH5质粒。用PacI和Af1II从未突变pBcIN5中切下527bp片段。类似地，用这两个酶消化pIP5和pIH5，并经SAP处理。将凝胶提取并纯化的pBcIN片段(527bp)连接到经消化、凝胶提取和纯化、缺少相应片段的pIP5和pIH5质粒骨架(3880bp)。只能通过测序质粒制备物来证实成功的克隆。为了增加找到成功克隆的可能性，只从具有低背景(连接)对照菌落的转化子制备小量制备物。发现所纠正的pIP5和pIH5的首个测序样品(质粒pkorj.IP3，pkorj.IH7)没有该无义突变，突变纠正成功。在Gateway PCR中使用新的融合基因制备物。
5.1.4Gateway(GW)PCR使用att B1/B2位点和引入5′Histag的引物(附录I，表I-2)以及FailSafeTMPCR PreMix选择试剂盒(Epicentre)，进行Gateway PCR(4.2.5.1)。引物G445(5′)、G238(3′IN-Ppo和IN-H98A)和G402(3′cIN)的长度分别是86、70和54bp，这样在插入物末端总共重新引入110或104bp。因此，扩增pkorj.IP3、pkorj.IH7的PCR产物预期大小为1440+110＝1550bp，而pBcIN5为974bp(870+104)。PCR反应物走0.8％TBE胶，凝胶提取、纯化正确大小的条带。
5.1.5构建最终的表达载体按照制造商规程(GATEWAYTMCloning Technology，GibcoBRL，Life Technologies)，将质粒pkorj.IP3、pkorj.IH7和pBcIN5的GW-PCR产物进行BP反应。利用PvuII(MBI)消化来验证所得入门克隆(Entry clone)(pDONRTM质粒制备物)。就IN-Ppo和IN-H98A融合基因所产生的质粒制备物而言，正确的入门克隆根据出现2480、810和560bp 3条带来鉴定。类似地使用PvuII对带有cIN基因的入门克隆(pEntryCIN 1-3)进行限制性分析。正确克隆可观察到分离出≈850bp片段，而空质粒产生602bp片段。
按照制造商说明书，类似地通过入门克隆质粒(pIPentry3、pIHentryl和pEntryCIN1)与目的载体(Destination vector)pBVboostFG之间的LR反应而生成的目的载体。从LR反应所得菌落的克隆中制备小量制备物，利用PvuII消化进行验证。正确表达克隆pDIP1-5和pDIH1-5的特征在于出现大小约4800、2600、800、542和144bp的5个条带。将PvuII消化的完整质粒pBVBoostFG在目的质粒消化物旁边走胶(得到大小为4973、2684、1433和144bp的4条带)，作为对照。通过PvuII消化而分离出约800bp片段，来鉴定包含cIN的正确表达质粒(图5.1.5-IV)。得到预期图形的克隆被命名为pDIP、DDIH和pDcIN，首字母D代表目的质粒。
利用表4.1.5-I所列引物进行测序，来验证最终表达载体的基因构建体(克隆pDIP2、pDIH1和pDcIN1)。测序结果表明，克隆pDIP2、pDIH1和pDcIN1是正确的。使用这些质粒制备物进行细菌蛋白质生成(4.6)。
5.2制备整合靶向质粒(pPPOsite)为制备包含I-PpoI切割位点的质粒，将包含I-PpoI识别序列的双链寡核苷酸插入pBluescript的EcoRV位点。制备包含15bp识别序列的寡核苷酸接头(I-Ppo-oligo)以及生成质粒pPPOsite的其它步骤，如4.3节所述。
利用酶I-PpoI(Promega)的限制性分析，来验证pPPOsite质粒的小量制备物。带有所插入的I-Ppo-接头的克隆经消化而线性化。利用引物T7和T3测序质粒，进一步验证其中一个克隆(pPPOsite#6)。测序表明，在EcoRV消化的pBluescript中引入了I-Ppo-接头的两个拷贝。接头的序列正确。
5.3制备用于整合的底物(pB2LTR+ECFP)HIV-1整合酶底物的要求是，应该是平端、双链DNA，每一侧翼带有病毒5′和3′长重复末端(LTR)的至少15bp(Brown，1997)。LTR的末端20bp包含HIV-1 IN整合所需重要序列，每一LTR末端两个碱基远处的双核苷酸3′CA最为重要(Brin & Leis，2002a)。
LTR末端被设计为便于克隆到pBluescript并随后可以在LTR之间插入标志基因盒(参见图6)。5′LTR被设计为5′端适合KpnI消化的pBluescript，3′端适合其它的LTR。3′LTR被设计为3′端SpeI位点连接到pBluescript，SphI位点连接到5′LTR。此外，在两个LTR序列中均引入另外的核酸内切酶切割位点LTR序列中部分包含的ScaI位点可以释放出LTR侧接的平端EGFP盒，在其3′端距离末端两个核苷酸远处均带有重要的CA双核苷酸。
图5中，上方序列代表5′LTR，下方对应3′LTR。ScaI限制性位点用下划线标示，每个3′端的CA双核苷酸为黑体。
5′和3′LTR的制备及其连接到KpnI和SpeI消化的pBluescript，如4.4节所述。从在MCS中最有可能插入短LTR序列的浅蓝色菌落中(只部分干扰α片段基因的通读)制备小量制备物。使用ScaI(MBI)限制性分析来验证质粒制备物(pB2LTR#1-3)。除pBluescript中已经存在的位点之外，两个LTR的插入产生了两个ScaI限制性位点。因此，根据从pBluescript中分离出1160bp的长片段(LTR之间的序列因很短而不能检测)，可以鉴定具有两个LTR的正确克隆。在LTR之间插入标志基因盒之前，通过测序来验证pB2LTR质粒制备物(pB2LTR#1)。利用引物T7和T3所得测序结果表明，该质粒正如所料，即带有正确插入的5′和3′LTR。
使用SphI酶切pBVBoostFG-EGFP中包含EGFP标志基因盒的三联启动子。如4.4所述，将该盒引入带有5′和3′LTR的pBluescript构建体(pB2LTR#1)。利用ScaI消化小量制备物(ScaI被设计用来游离平端EGFP盒)，来验证2620bp盒的插入。根据分离出EGFP标志基因盒(约2620bp)以及来自质粒骨架的约1100和1800bp的两条带，来鉴定正确克隆。限制性分析表明，所测试的小量制备物中8/10是正确的。继在pBVBoostFG中序列验证之后，EGFP盒未经改变，因而假定是正确的。该盒相对于LTR的定位并不重要，因为盒本身带有EGFP表达所需的启动子元件。
5.4细菌蛋白质生成及分析制备融合基因IN-I-PpoI和IN-H98A是为了研究其所编码的新融合蛋白质的功能，并与天然HIV-1整合酶(克隆HXB2，本研究中cIN)的活性做比较。将该基因转移到目的载体(pBVBoostFG)中，以便能够生成蛋白质。使用大肠杆菌菌株BL21(DE3)(Stratagene)和BL21-AITMOne Shot(Invitrogen)作为表达宿主，在细菌细胞中进行蛋白质生成实验。
5.4.1用于SDS-PAGE的样品收集及制备如4.1.7中所述，利用表达载体pDIP2、pDIH1和pDcIN1转化细菌。作为表达研究的阳性对照，也将质粒pINSD.His(Engelman和Craigie 1992，Craigie等人1995)转化到表达宿主细菌中。细菌菌落在振摇温箱中生长，直到细胞密度达到OD600值为0，6-1。此时将部分培养物接种到新鲜LBg培养基中，以产生实际的表达培养物。从每一克隆剩余的原始培养物中制备甘油储存物。将表达培养物生长到细胞密度达到对数中期(OD600≈0.4)，以便使细菌过表达所需蛋白质的能力达到最大。将未转化的细菌样品随同实际表达(以及阳性对照)样品进行处理，作为Western印迹的对照。
加入IPTG(100mM)到终浓度(cfinal)1mM，诱导大肠杆菌BL21(DE3)细胞培养物的蛋白质生成。加入IPTG诱导来自lacUV5启动子的RNA聚合酶T7(T7RNAP)的表达。然而T7启动子的表达有泄漏，即该细胞中没有诱导剂时也″开启″。这可以导致异源蛋白质的非诱导表达，如果该蛋白质产物有毒性，则有坏处。实际上，观察到pDIP2的基因产物妨碍所转化的细菌在LB平板上生长以及细菌培养物在LB培养基中生长。因此，严格的表达控制是细菌蛋白质生成中的相关问题。
加入IPTG(cfinal1-0.01mM)和L-阿拉伯糖(cfinal0.2％)，诱导BL21-AITMOne Shot细胞。诱导BL21-AI中来自araBAD启动子(PBAD)的T7RNAP表达需要L-阿拉伯糖诱导(Lee 1980，Lee等人，1987)。在BL21-AI中T7 RNAP水平受严格调节，因而认为该菌株特别适合表达可能的毒性基因。筛选不同量的IPTG，来研究不同诱导水平对过表达蛋白质稳定性的影响。为相同目的，也测试了不同生长条件(较低温度、加入葡萄糖)。
菌株BL21(DE3)和BL21-AI是蛋白酶lon和OmpT(外膜蛋白酶)缺陷的，其造成细菌细胞中所表达的异源蛋白质降解(Grodberg &Dunn，1988；Studier & Moffat，1986)。缺少上述蛋白酶因而降低了异源蛋白质表达研究中蛋白质降解的可能性。
在这两种菌株的表达实验期间采用1h、2h、3h和4h(或其中某些)时间点，来确定异源蛋白质表达及稳定性的理想时间。还在诱导前(0h，UI)从培养物取样，来评估基础蛋白质表达水平。如4.7节所述收集并制备所有样品。为了裂解细胞并灭活宿主细胞内蛋白酶，在细胞沉淀后立即煮沸样品非常重要。得自BL21(DE3)转化子的部分样品在制备样品(细胞沉淀并加入SDS-PAGE样品缓冲液)后立即冷冻，只有在SDS-PAGE凝胶上样前才煮沸。利用SDS-PAGE(4.7.1)和Western印迹(4.7.2)分析蛋白质产生。
5.4.2SDS-PAGE和Western印迹如4.7.1所述进行变性SDS-PAGE。如4.7.2所述，在Western印迹过程中将蛋白质转印到硝酸纤维素膜并染色。利用识别多聚组氨酸的抗体染色来显示带有N端6XHis融合物的片段大小，而HIV-1整合酶特异性抗体则显示带有IN蛋白质N端区域(氨基酸23-34)的所有片段。未能使用I-PpoI特异性抗体，但源自pDIP2和pDIH1表达培养物的蛋白质的大小差异表明存在正确的融合蛋白质。pDcIN表达的蛋白质产物预期为32kDa(作为野生型HIV-1整合酶单聚体)，IN-H98A(pDIH)和IN-I-PpoI(pDIP)融合体为50kDa(32kDa+I-PpoI或H98A 18kDa/单聚体)。按制备pDcIN1、pDIP2和pDIH1表达样品的同样方式，从质粒pINSD.His制备免疫印迹染色的阳性对照。该His-标签的对照与本研究所用的两种抗体均反应，显示所克隆的整合酶大小以及蛋白质N端多聚组氨酸标签的存在。
BL21(DE3)表达样品的免疫印迹表明，存在从染色程序的特异性抗体反应中形成的预期的蛋白质条带。除了pDIH、pDIP和pDcIN正确大小的基因产物之外，印迹中还存在很多小带。据认为蛋白质在表达途径的某些时候遭到降解，可能是由于T7启动子的基础表达较强，因而在细胞中产生大量异源蛋白质。异源蛋白质表达在BL21(DE3)培养物的非诱导状态已经发生，据认为这促进了蛋白质的不稳定性。
利用表达质粒pDIP2转化时，在培养的大肠杆菌BL21(DE3)细胞中观察到细菌生长的显著抑制。首先，用pDIP2转化细菌难以获得任何菌落。其次，pDIP2转化的BL21(DE3)细胞的原始培养物及表达培养物即使生长均极为缓慢。最后，从诱导的pDIP2转化的BL21(DE3)培养物所获取的细胞，其表达的IN-I-PpoI蛋白质数量极少。
为了测试在更适于表达毒性蛋白质的菌株中表达时，pDIP2、pDIH1和pDcIN1的表达产物是否更为稳定，使用大肠杆菌菌株BL21-AI重复该实验(图5.4.2-II-5.4.2-V)。免疫印迹结果显示，BL21-AI的基础表达水平低于BL21(DE3)，但未观察到蛋白质稳定性明显增强。不同的IPTG诱导水平并不改变DcIN1和pDIH1的表达水平，也不影响蛋白质稳定性。
正如在pDIP2感染的BL21(DE3)细胞中已经观察到的，pDIP2的IN-I-PpoI蛋白质表达受阻。因此认为该蛋白质产物对本研究所用表达宿主有毒性。在LB平板和生长培养基中加入葡萄糖(0.1％)来测试pDIP2，因为葡萄糖可能防止毒性基因在BL21-AI细胞中基础表达水平的相关问题[BL21-AI细胞手册(Invitrogen)及此处参考文献]。发现添加葡萄糖对蛋白质的表达水平具有强烈的抑制作用，但未观察到对蛋白质降解的明显改善。
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引入此处所述的任何文献的内容以供参考。
附录I表I-1在插入PCR中使用的引物(4.1.1.1)。以5’→3’方向显示所述的序列。引物中引入的RE-位点以下划线序列表示并在表中进行了说明。起始密码子和终止密码子以粗体表示。
表I-2在GATEWAY-PCR中使用的引物(4.1.7.1)。以5’→3’方向显示所述的序列。GW 3’Ppo引物和GW 3’cIN引物中的两个终止密码子以及GW 5’IN HT中的起始密码子以粗体表示。GW 5’IN HT中的六个组氨酸编码密码子如下划线所示。
表I-3测序中使用的引物。以5’→3’方向显示所述的序列。
表I-4在产生pB2LTR的LTR以及构建插入到pPPOsite中的I-PpoI位点时使用的寡脱氧核糖核苷酸。
附录II表II-1本研究中使用的PCR程序
附录III1)GeneRulerTM100bp DNA Ladder(MBI)2)GeneRulerTM1kb DNA Ladder(MBI)3)GeneRulerTMDNA Ladder Mix(MBI)4)1 Kb DNA Ladder(NEB)
附录IV缓冲剂和试剂过硫酸铵10％(APS)0.1g APS，溶于1ml H2O中在使用前即时配制或贮存于-20℃。
APA-缓冲液 0.1M NaHCO31mM MgCl2.6·H2O用NaOH调整pH至9.8Kodak(转移缓冲液)100ml 10x Kodak贮存溶液200ml甲醇700ml H201LKodak(转移缓冲液)10x贮存溶液30,3g Tris碱30,3g甘氨酸加H2O至1000mlLB-溶液 10g细菌用胰蛋白胨5g细菌用酵母提取物10g NaCl用1M NaOH调节pH至7.5，1用H2O补至100mlPBS-缓冲液 276mM NaCl16mM Na2HPO410.7mM KCl2.9mM KH2PO4Ponceau蛋白染色溶液 0.2％Ponceau S3％TCA分离缓冲液5X，pH 8.315g Tris碱72g甘氨酸5g SDS(十二烷基硫酸钠)加H2O至700ml。调整pH。
加水至终体积1000ml。贮存于+4℃。
SDS-PAGE样品缓冲液(2x) 2.5ml0.5M Tris-HCl(pH 6.8)4.0ml 10％SDS2.0ml甘油0.2ml 0.2％溴酚蓝1.0ml β-巯基乙醇0.3ml H2OSOC 2g细菌用胰蛋白胨0.5g酵母提取物1ml 1M NaCl0.25ml 1M KCl1ml 2M Mg-贮存溶液1ml 2M葡萄糖用水调整体积至100mlTAE缓冲液 0.04M Tris乙酸盐1mM EDTATBS 0.5M29.22g NaCl3.15g Tris-HCl加H2O至1000mlTBS缓冲液 20mM Tris-HCl(pH 7.5)0.5M NaClTBS-Tween缓冲液 1x TBS缓冲液0.2％(v/v)Tween20TE缓冲液10mM Tris-HCI pH 81mM EDTATris-HCl 0.5M，pH 6.8 6g Tris碱；溶解于60ml水中调整pH至6.8，加水至100ml
贮存于+4℃.
Tris-HCl 1.5M，pH 8.8 27.23gTris碱；溶解于80ml水中调整pH至8.8，加水至150ml贮存于+4℃SDS-PAGE凝胶的制备10％电泳胶(厚梳子) 4％成层胶(厚梳子)6.023ml蒸馏水 6.10ml蒸馏水3.75ml 1,5M Tris-HCl pH 8.82.50ml 0.5M Tris-HClpH 6.8150μl 10％SDS-贮液 100μl 10％SDS-贮液5.00ml 30％丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液(BioRa d)1.30ml 30％丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液(BioRad)75μl 10％APS 50μl 10％APS7,5μl TEMED10μl TEMED
权利要求
1.将包含逆转录病毒样核酸的转基因靶向整合入真核细胞基因组中的方法，其中，所述基因组是被能够结合核酸的限制性酶靶向的，并且所述转基因是被引入结合位点的，其特征在于，所述的核酸内切酶对高丰度rDNA基因座中的位点特异并与介导所述转基因引入的整合酶融合。
2.权利要求1的方法，其中所述的基因组是人类基因组。
3.权利要求1或权利要求2的方法，其中所述的整合酶是慢性病毒整合酶。
4.权利要求3的方法，其中所述的整合酶是HIV-1整合酶。
5.前述任一项权利要求的方法，其中所述的核酸内切酶是I-PpoI。
6.融合蛋白，其包含与权利要求1中所述的整合酶融合的权利要求1所述的核酸内切酶。
7.权利要求6的融合蛋白，其为HIV-1整合酶与I-PpoI的融合蛋白。
全文摘要
本发明涉及包含逆转录病毒样－DNA的转基因靶向整合入真核基因组的方法，所述的基因组被核酸内切酶切割而在切割位点引入所述的转基因，其中所述的核酸内切酶对高丰度的rDNA基因座中的位点是特异的，并且与介导转基因引入的整合酶融合。所述的融合蛋白可能是新的。
文档编号C12N15/62GK1910288SQ200580002435
公开日2007年2月7日 申请日期2005年1月14日 优先权日2004年1月14日
发明者M·阿洛斯, D·施恩克温, K·爱兰尼, S·伊拉－赫图拉, O·莱迪南 申请人:Ark治疗学有限公司