MAdCAM抗体的制作方法

专利名称：MAdCAM抗体的制作方法
专利说明MAdCAM抗体 本申请要求2004年1月9日提交的美国临时申请案60/535,490的权益。
背景技术：
粘膜地址素细胞粘附分子(MAdCAM)是免疫球蛋白超家族细胞粘附受体的成员。淋巴细胞归巢(homing)至胃肠道的特化淋巴组织和粘膜位点的选择性通过MAdCAM的内皮表达确定(Berlin，C等，Cell，80413-422(1994)；Berlin，C.等，Cell，74185-195(1993)；及Erle，D.J.等，J.Immunol.，153517-528(1994))。MAdCAM独特地在有组织的肠淋巴组织的高内皮小静脉的细胞表面上表达，如Peyer斑和肠系膜的淋巴结(Streeter等，Nature，33141-6(1988)；Nakache等，Nature，337179-81(1989)；Briskin等，Am.J.Pathol.151-97-110(1997))，但也在其它淋巴样器官如胰腺、胆囊和脾小静脉及脾白髓的边缘窦中表达(Briskin等(1997)，如前；Kraal等，Am.J.Path.，147763-771(1995))。虽然MAdCAM在肠免疫监督中起生理学作用，但它显示在慢性胃肠道炎症条件下可促进炎性肠病中淋巴细胞的过度外渗。TNF和其它促炎细胞因子增强了内皮MAdCAM表达，并且在取自患有克隆氏病和溃疡性结肠炎的患者的活检标本中，MAdCAM表达在炎症位点局部增强了约2-3倍(Briskin等(1997)，Souza等，Gut，45856-63(1999)；Arihiro等，Pathol Int.，52367-74(2002))。已经在结肠炎的试验模型中观察到类似模式的表达提高(Hesterberg等，Gastroenterology，1111373-1380(1997)；Picarella等，J.Immunol.，1582099-2106(1997)；Connor等，J Leukoc Biol.，65349-55(1999)；Kato等，J Pharmacol Exp Ther.，295183-9(2000)；Hokari等，Clin Exp Immunol.，26259-65(2001)；Shigematsu等，Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol.，281G1309-15(2001))。在炎性病症如胰岛素依赖型糖尿病(Yang等Diabetes，461542-7(1997)；Hnninen等，J Immunol.，1606018-25(1998))、移植物抗宿主病(Fujisaki等，Scand J Gastroenterol.，38437-42(2003)，Murai等，Nat Immunol.，4154-60(2003))、慢性肝病(Hillan等，Liver，19509-18(1999)；Grant等，Hepatology，331065-72(2001))、炎性脑病(Stalder等，Am J Pathol.，153767-83(1998)；Kanawar等，Immunol Cell Biol.，78641-5(2000))和胃炎(Barrett等，J Leukoc Biol.，67169-73(2000)；Hatanaka等，Clin Exp Immunol.，130183-9(2002))的其它临床前模型中，疾病发病机理中也存在胎儿MAdCAM表达的再度唤醒和活化的α4β7+淋巴细胞的参与。在这些炎性模型及半抗原介导的(如TNBS、DSS等)或继承性转移(CD4+CD45Rbhigh)小鼠结肠炎模型中，大鼠抗-小鼠MAdCAM单克隆抗体(mAb)MECA-367，其阻断α4β7+淋巴细胞结合至MAdCAM上，可减少淋巴细胞募集、组织外渗、炎症和疾病的严重性。抗人MAdCAM的小鼠单克隆抗体(mAb)也已报导(见如WO 96/24673和WO 99/58573)。既知MAdCAM在炎性肠病(IBD)和其它胃肠道或其它组织相关的炎性疾病中的作用，一种用于抑制α4β7结合和MAdCAM-介导的白细胞募集的方法是理想的。具有这样的治疗手段将是更理想的，所述的治疗手段具有的有利性质包括但不限于，在患者中与其它药物疗法不存在不期望的相互作用，以及有利的物理化学特性如在人中的pK/pD值、溶解性、稳定性、贮存期限及体内半衰期。治疗性蛋白如抗体，将有利地免于不想要的翻译后修饰或聚集体形成。因此，急需治疗性的抗-MAdCAM抗体。
发明概述本发明提供特异性结合MAdCAM的分离的抗体，其中至少所述抗体的CDR序列是人CDR序列，或所述抗体的抗原结合部分。在一些实施方案中该抗体是人抗体，优选地是作为MAdCAM拮抗剂的抗体。也提供了包含所述抗体或部分的组合物。本发明也提供包含所述抗-MAdCAM拮抗性抗体的重链和/或轻链或其可变区或其它抗原结合部分或编码前述任一者的核酸分子及可药用载体的的组合物。本发明组合物可进一步包含另外的成分如治疗剂或诊断剂。本发明也提供诊断和治疗方法。本发明进一步提供分离的细胞系，该细胞系产生所述的抗-MAdCAM抗体或其抗原结合部分。本发明也提供编码所述的抗-MAdCAM抗体的重链和/或轻链或其可变区或其抗原结合部分的核酸分子。本发明提供包含所述核酸分子的载体和宿主细胞，以及重组产生由该核酸分子编码的多肽的方法。也提供了表达所述的抗-MAdCAM抗体的重链和/或轻链、或其抗原结合部分的非人转基因动物或植物。
附图简述

图1是12种人抗-MAdCAM单克隆抗体重链和κ轻链可变区的预测的氨基酸序列与相应的人基因的种系氨基酸序列的比对。图1A显示预测的抗体1.7.2和1.8.2的重链的氨基酸序列与种系人VH 3-15基因产物的比对。图1B显示预测的抗体6.14.2重链的氨基酸序列与种系人VH 3-23基因产物的比对。图1C显示预测的抗体6.22.2重链的氨基酸序列与种系人VH 3-33基因产物的比对。图1D显示预测的抗体6.34.2重链的氨基酸序列与种系人VH 3-30基因产物的比对。图1E显示预测的抗体6.67.1重链的氨基酸序列与种系人VH 4-4基因产物的比对。图1F显示预测的抗体6.73.2重链的氨基酸序列与种系人VH 3-23基因产物的比对。图1G显示预测的抗体6.77.1重链的氨基酸序列与种系人VH 3-21基因产物的比对。图1H显示预测的抗体7.16.6和7.26.4的重链的氨基酸序列与种系人VH1-18基因产物的比对。图1I显示预测的抗体7.20.5重链的氨基酸序列与种系人VH 4-4基因产物的比对。图1J显示预测的抗体9.8.2重链的氨基酸序列与种系人VH3-33基因产物的比对。图1K显示预测的抗体1.7.2和1.8.2的κ轻链氨基酸序列与种系人A3基因产物的比对。图1L显示预测的抗体6.14.2的κ轻链氨基酸序列与种系人O12基因产物的比对。图1M显示预测的抗体6.22.2的κ轻链氨基酸序列与种系人A26基因产物的比对。图1N显示预测的抗体6.34.2的κ轻链氨基酸序列与种系人O12基因产物的比对。图10显示预测的抗体6.67.1的κ轻链氨基酸序列与种系人B3基因产物的比对。图1P显示预测的抗体6.73.2的κ轻链氨基酸序列与种系人O12基因产物的比对。图1Q显示预测的抗体6.77.1的κ轻链氨基酸序列与种系人A2基因产物的比对。图1R显示预测的抗体7.16.6和7.26.4的κ轻链氨基酸序列与种系人A2基因产物的比对。图1S显示预测的抗体7.20.5的κ轻链氨基酸序列与种系人A3基因产物的比对。图1T显示预测的抗体9.8.2的κ轻链氨基酸序列与种系人O18基因产物的比对。图2是预测的人抗-MAdCAM抗体重链和κ轻链氨基酸序列的CLUSTAL比对。图2A是预测的κ轻链氨基酸序列的CLUSTAL比对和辐射状树，显示抗-MAdCAM抗体κ轻链之间的相似程度。图2B是预测的重链氨基酸序列的CLUSTAL比对和辐射状树，显示抗-MAdCAM抗体重链之间的相似程度。图3是短尾猴和人MAdCAM的形成α4β7结合结构域的2个N末端结构域的氨基酸序列CLUSTAL比对。根据Tan等，Structure(1998)6793-801来比对β-链。图4是表示纯化的生物素化1.7.2和7.16.6对人外周血淋巴细胞粘附至表达MAdCAM的冷冻人肝脏内皮切片的剂量效应的图。图5显示基于收集于表7的抗-MAdCAM抗体1.7.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2结合的MAdCAM表位的多样性数据的二维图示。同一圈内的抗-MAdCAM抗体显示相同的反应性模式，属于相同的表位仓(bin)并很可能识别MAdCAM上相同的表位。在重叠圈内的抗-MAdCAM抗体克隆不能同时结合并因此很可能识别MAdCAM上重叠的表位。不整合的圈表示具有截然不同的空间表位分离的抗-MAdCAM抗体克隆。图6显示抗-MAdCAM抗体1.7.2和经Alexa 488标记的7.16.6的夹心ELISA数据，显示能检测MAdCAM上不同表位的两种抗体可用于为诊断目的检测可溶性MAdCAM。图7在短尾猴模型中使用抗-MAdCAM mAb 7.16.6，显示抑制性抗-MAdCAM抗体(1mg/mg)对循环的外周α4β7+淋巴细胞的数目的影响，表示为相对于对照IgG2a mAb或载体的成倍增加。
本发明详述定义和一般技术除非在这里另外定义，与本发明相关使用的科学和技术术语将具有本领域那些一般技术人员通常理解的意义。而且，除非上下文另外需要，单数术语将包括复数而复数术语将包括单数。通常，用于与这里描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学、蛋白质和核酸化学及杂交相关的术语及其技术是在本领域熟知并通常使用。本发明的方法和技术通常根据本领域熟知的常规方法进行并参照在整个说明书中引用和讨论的各种一般性或更具体的参考文献描述，除非另外表明。见，例如Sambrook等，Molecular CloningA LaboratoryManual，2nd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，N.Y.(1989)和Ausubel等，Current Protocols in MolecularBiology，Greene Publishing Associates(1992)，及Harlow和Lane，AntibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.(1990)，将其在这里通过引用作为参考。根据厂商的说明书，如通常在本领域完成的或如这里描述的进行酶反应和纯化技术。标准技术用于化学合成、化学分析、药物的制备、制剂和递送以及对患者的治疗。除非另外说明，下列术语将理解为具有下列意义术语“多肽”包含天然或人造蛋白质、蛋白质片段和蛋白质序列的多肽类似物。多肽可以是单体或多聚体的。术语“分离的蛋白”或“分离的多肽”是蛋白质或多肽，所述蛋白质或多肽由于其来源或衍生源而(1)不与在其天然态中伴随它的天然关联成分关联，(2)没有来自同一物种的其它蛋白质，(3)由来自不同物种的细胞表达，或者(4)不在自然中存在。因此，化学合成或在不同于其天然来源细胞的细胞体系中合成的多肽将与其天然关联成分“分离”。也可使用本领域熟知的蛋白质纯化技术，通过分离使得蛋白质基本无天然关联成分。当至少约60-75％的样品显示单一种多肽时，蛋白质或多肽是“基本纯的”、“基本同种的”或“基本纯化的”。该多肽或蛋白质可以是单体或多体的。基本纯的多肽或蛋白质通常会占蛋白质样品的约50％、60％、70％、80％或90％W/W，更通常是约95％，并且优选为超过99％的纯度。蛋白质纯度或同质性可通过许多本领域熟知的方法表明，例如将蛋白质样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，随后用本领域熟知的染料将凝胶染色后显现单个多肽条带。为了某种目的，可使用纯化领域熟知的HPLC或其它方法提供更高的分辨率。如此处使用的术语“多肽片段”指具有氨基末端和/或羧基末端缺失的多肽，但其中剩余的氨基酸序列与天然存在的序列中的相应位置一致。在一些实施方案中，片段为至少5、6、8或10个氨基酸长。在另外的实施方案中，片段是至少14个氨基酸长，更优选地至少20个氨基酸长，通常至少50个氨基酸长，甚至更优选地为至少70、80、90、100、150或200个氨基酸长。如此处使用的术语“多肽类似物”指包含至少25个氨基酸的片段的多肽，其与氨基酸序列的一部分具有相当的同一性并具有至少一种下列的特性(1)在合适的结合条件下特异性结合至MAdCAM，(2)能抑制α4β7整联蛋白和/或L选择蛋白结合至MAdCAM，或(3)能在体外或体内减少MAdCAM细胞表面表达。通常，多肽类似物包含相对于天然存在的序列的保守性氨基酸替换(或插入或缺失)。类似物通常为至少20个氨基酸长，优选地为至少50、60、70、80、90、100、150或200个氨基酸长或更长，并且其可常常与全长的天然存在的多肽一样长。优选的氨基酸替换是那些(1)减少对蛋白质水解易感性、(2)减少对氧化易感性、(3)改变形成蛋白质复合物的结合亲和性、(4)改变结合亲和力或(5)赋予或修饰这种类似物的其它物理化学或功能特性的氨基酸替换。类似物可包括除天然存在的肽序列以外的序列的不同突变型蛋白。例如，单个或多个氨基酸替换(优选保守性氨基酸替换)可在天然存在的序列(优选地在形成分子间接触的结构域外的多肽部分)中进行。保守性氨基酸替换应该不会显著改变亲本序列的结构特征(例如，替换的氨基酸不倾向破坏亲本序列中存在的螺旋，或破坏表征亲本序列的其它类型的二级结构)。本领域公认的多肽二级结构和三级结构的实例在Proteins，Structures and Molecular Principles(Creighton，Ed.，W.H.Freeman and Company，New York(1984))；Introduction to Protein Structure(C.Branden和J.Tooze，eds.，Garland Publishing，New York，N.Y.(1991))和Thornton等Nature，354105(1991)中描述，将它们每个在这里通过引用作为参考。非肽类似物常用于制药工业作为具有类似于模板肽的特性的药物。这些类型的非肽化合物称为“肽模拟物”或“模拟肽”。Fauchere，J.Adv.Drug Res.，1529(1986)；Veber和Freidinger，TINS，p.392(1985)；和Evans等，J.Med.Chem.，301229(1987)，将其在这里通过引用作为参考。这种化合物常常借助计算机化分子建模来开发。结构上类似治疗上有用的肽的肽模拟物可用来产生等同的治疗或预防效果。通常，肽模拟物在结构上类似范例多肽(paradigm polypeptide)(即具有理想的生物化学特性或药理学活性的多肽)，例如人抗体，但其具有一个或多个可任选地由键如-CH2NH-、-CH2S-、-CH2-CH2-、-CH＝CH-(顺式和反式)、-COCH2-、-CH(OH)CH2-和-CH2SO-通过本领域熟知的方法替代的肽键。用相同类型的D-氨基酸系统地置换共有序列的一个或多个氨基酸(如D-赖氨酸代替L赖氨酸)也可用于生产更稳定的肽。而且，包含共有序列或大体相同的共有序列变体的受约束的肽(constrained peptide)可通过本领域已知的方法(Rizo和GieraschAnn.Rev.Biochem.61387(1992)，将其在这里通过引用作为参考)生产；例如通过加入能形成分子内二硫键使肽环化的内部半胱氨酸残基。“免疫球蛋白”是一种四聚体分子。在天然存在的免疫球蛋白中，每个四聚体由两个相同的多肽链对组成，每对具有一条“轻”链(约25kDa)和一条“重”链(约50-70kDa)。每一条链的氨基末端部分包括主要负责抗原识别的约100-110或更多氨基酸的可变区。每一条链的羧基末端部分确定主要负责效应功能的恒定区。将人轻链分类为κ和λ轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε，并分别定义抗体的同种型为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区由约12或更多氨基酸的“J”区连接，而重链还包含约10或更多氨基酸的“D”区。通常参见，Fundamental Immunology，Ch.7(Paul，W.，ed.，2nd ed.Raven Press，N.Y.(1989))(为所有目的将其通过全文引用作为参考)。每一个轻/重链对的可变区形成抗体结合位点，这样完整的免疫球蛋白具有两个结合位点。免疫球蛋白链表现出由三个高变区(也称为互补性决定区或CDR)连接的相对保守的框架区(FR)的相同的大体结构。每对的两条链的CDR通过框架区排列以形成表位特异性结合位点。从N-端至C-端，轻链和重链都包含FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4结构域。依照Kabat，Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1987和1991))，或Chothia & Lesk，J.Mol.Biol.，196901-917(1987)；Chothia等，Nature，342878-883(1989)的定义将氨基酸分配至每一结构域，将其每篇文献在这里通过全文引用作为参考。“抗体”指完整的免疫球蛋白或指其抗原结合部分，该抗原结合部分与完整的抗体竞争特异性结合。在一个实施方案中，抗体是它的抗原结合部分。抗原结合部分可通过重组DNA技术或通过对完整抗体的酶或化学裂解产生。抗原结合部分包括，尤其是Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、dAb和互补性决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv)、嵌合抗体、双特异抗体和包含足够使多肽特异性结合抗原的至少一部分免疫球蛋白的多肽。Fab片段是由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；F(ab)2片段是包含两个在绞链区由二硫桥连接的Fab片段的二价片段；Fd片段由VH和CH1结构域组成；Fv片段由抗体单臂的VL和VH结构域组成；而dAb片段(Ward等，Nature，341544-546(1989))由VH结构域组成。如此处使用的，称为例如1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.34.2、6.67.1、6.77.2、7.16.6、7.20.5、7.26.4或9.8.2的抗体是由相同名称的杂交瘤产生的单克隆抗体。例如，抗体1.7.2由杂交瘤1.7.2产生。称为6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod或7.26.4-mod的抗体是其序列已经通过定点诱变从其相应的亲本进行过修饰的单克隆抗体。单链抗体(scFv)是通过合成的连接序列使VL和VH区成对以形成单价分子的抗体，所述连接序列能使VL和VH区作为单条蛋白质链制备(Bird等，Science，242423-426(1988)和Huston等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，855879-5883(1988))。双特异抗体是二价、双特异性的抗体，其中VH和VL结构域在单一的多肽链上表达，但使用太短而使得相同链上的两个结构域之间不能形成配对的连接序列，从而迫使结构域与另一条链的互补结构域成对并产生两个抗原结合位点(见，例如Holliger，P等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，906444-6448(1993)和Poljak，R.J等，Structure，21121-1123(1994))。来自本发明抗体的一个或多个CDR可共价或非共价地整合至分子中以使其成为特异性结合至MAdCAM的免疫粘合素。免疫粘合素可以整合CDR将其作为更大的多肽链的部分，可将CDR共价地连接至另一个多肽链或可非共价地整合CDR。CDR使免疫粘合素特异性结合至特定的目的抗原上。抗体可具有一个或多个结合位点。如果具有多于一个的结合位点，结合位点可彼此相同或不同。例如，天然存在的免疫球蛋白具有两个相同的结合位点，单链抗体或Fab片段具有一个结合位点，而“双特异性”或“双功能”抗体(双特异抗体)具有两个不同的结合位点。“分离的抗体”是这样的抗体(1)与在其天然状态下伴随它的天然关联的成分(包括其它天然关联的抗体)不关联，(2)无来自相同物种的其它蛋白，(3)由来自不同物种的细胞表达或(4)天然不存在。分离的抗体的实例包括已经使用MAdCAM亲和纯化的抗-MAdCAM抗体、在体外通过杂交瘤或其它细胞系产生的抗-MAdCAM抗体和源于转基因哺乳动物或植物的人抗MAdCAM抗体。如此处使用的，术语“人抗体”指其中可变区和恒定区序列是人序列的抗体。该术语包含具有源于人基因但经改变(如用以降低可能的免疫原性、增强亲和性、消除可能引起不希望的折叠的半胱氨酸或糖基化位点等)的序列的抗体。该术语包含在非人细胞中重组产生的这种抗体，这种非人细胞可以使抗体发生人细胞非典型的糖基化。该术语也包含在包含一些或所有的人免疫球蛋白重链和轻链基因座的转基因小鼠中产生的抗体。在一方面，本发明提供人源化抗体。在一些实施方案中，人源化抗体是一种源于非人物种的抗体，其中在重链和轻链的框架结构域和恒定区中的某些氨基酸已经突变以避免或取消在人中的免疫反应。在一些实施方案中，人源化抗体可通过将来自人抗体的恒定结构域融合至非人物种的可变结构域生产。怎样产生人源化抗体的实例可在美国专利No.6,054,297，5,886,152和5,877,293中找到。在一些实施方案中，本发明的人源化抗-MAdCAM抗体包含本发明的一种或多种人抗-MAdCAM抗体的一个或多个框架区的氨基酸序列。在另一方面，本发明包括“嵌合抗体”。在一些实施方案中嵌合抗体指包含来自一种抗体的一个或多个区和来自一种或多种其它抗体的一个或多个区的抗体。在一个优选的实施方案中，一个或多个CDR源于本发明的人抗-MAdCAM抗体。在一个更优选的实施方案中，所有的CDR源于本发明的人抗-MAdCAM抗体。在另一个优选的实施方案中，来自多于一种本发明人抗-MAdCAM抗体的CDR在嵌合抗体中混合并相配。例如，嵌合抗体可包含来自第一种人抗-MAdCAM抗体的轻链的CDR1，其可与来自第二种人抗-MAdCAM抗体的轻链的CDR2和CDR3组合，并且重链的CDR可源于第三种抗-MAdCAM抗体。而且，框架区可以源于相同抗-MAdCAM抗体之一、源于一种或多种不同的抗体如人抗体或源于人源化抗体“中和抗体”、“抑制性抗体”或拮抗性抗体是抑制α4β7或表达α4β7的细胞，或者任何其它关连配体或表达关连配体的细胞结合至MAdCAM达至少约20％的抗体。在一个优选的实施方案中，该抗体抑制α4β7整联蛋白或表达α4β7的细胞结合至MAdCAM达至少40％，更优选地60％，甚至更优选地80％、85％、90％、95％或100％。这种结合的减少可通过本领域普通技术人员已知的任何方法测量，例如在体外竞争性结合测定法中测量。测量表达α4β7的细胞结合至MAdCAM的减少的实例在实施例I中显示。本领域那些普通技术人员按照本说明书中的教导可容易地制备抗体的片段或类似物。优选的片段或类似物的氨基-和羧基-末端在功能结构域边界附近。结构和功能结构域可通过将核苷酸和/或氨基酸序列数据与公开的或私有的序列数据库相比较确定。优选地，使用借助计算机的比较法来识别鉴定存在于已知结构和/或功能的其它蛋白质中的基序或预测的蛋白质构象结构域。用于鉴定折叠成已知三维结构的蛋白质序列的方法是已知的(Bowie等，Sciene，253164(1991))。如此处使用的术语“表面等离子共振”指一种光学现象，其使得能通过检测生物传感器基质内的蛋白质浓度的改变来分析实时生物特异性相互作用，例如使用BIAcore系统(Pharmacia Biosensor AB，Uppsala，Sweden和Piscataway，N.J.)。为了进一步描述，见Jonsson，U.等，Ann.Biol.Clin.，5119-26(1993)；Jonsson，U.等，Biotechniques，11620-627(1991)；Johnsson，B.等，J.Mol.Recognit.，8125-131(1995)；和Johnnson，B.等，Anal.Biochem.，198268-277(1991)。术语“koff”指抗体从抗体/抗原复合物中离解的解离速率常数。术语“Kd”指特定的抗体-抗原相互作用的解离常数。当解离常数≤1μM，优选地≤100nM且最优选地≤10nM时，可以说抗体结合抗原。术语“表位”包括能特异性结合至免疫球蛋白或T细胞受体或以其它方式与分子相互作用的任何蛋白质决定簇。表位决定簇通常由分子的化学活性表面簇例如氨基酸或碳水化合物侧链组成并通常具有特定的三维结构特征及特定电荷特征。表位可以是“线性的”或“构象的”。在线性表位中，蛋白质和相互作用的分子(如抗体)之间相互作用的所有点线性地沿着该蛋白质的一级氨基酸序列存在。在构象表位中，相互作用点跨越蛋白质上彼此分离的氨基酸残基。如这里使用，20个常规氨基酸和其缩写遵循常规用法。见Immunology-A Synthesis(2nd Edition，E.S.Golub和D.R.Gren，Eds.，Sinauer Associates，Sunderland，Mass.(1991))，将其在这里通过引用作为参考。这20个常规氨基酸的立体异构体(如D氨基酸)、非天然氨基酸如α-，α-双取代的氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸和其它非常规氨基酸也可以是本发明多肽的合适组分。非常规氨基酸的实例包括4-羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、ε-N，N，N-三甲基赖氨酸、ε-N-乙酰基赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰丝氨酸、N-甲酰蛋氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸、s-N-甲基精氨酸和其它类似的氨基酸及亚氨基酸(如4-羟脯氨酸)。根据标准用法和惯例，如此处使用的多肽注释中，左手方向是氨基末端方向而右手方向是羧基末端方向。在这里涉及的术语“多核苷酸”指长度至少10个碱基的核苷酸(即核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或任一类型核苷酸的修饰形式)的聚合形式。该术语包括单链和双链形式的DNA。如此处使用的术语“分离的多核苷酸”应该指基因组、cDNA或合成来源的多核苷酸或它们的一些组合，由于其来源，该“分离的多核苷酸”(1)与其中该“分离的多核苷酸”在自然中得以发现处的全部或部分多核苷酸不关联，(2)有效地连接至在自然界中不与其连接的多核苷酸，或(3)在自然中不作为更大序列的一部分存在。在这里涉及的术语“寡核苷酸”包括通过天然存在和非天然存在的寡核苷酸键连接在一起的天然存在的和经修饰的核苷酸。寡核苷酸是通常包含200碱基或更少碱基长的多核苷酸子集。优选地寡核苷酸是10-60个碱基长，最优选地是12、13、14、15、16、17、18、19或20-40个碱基长。虽然寡核苷酸可以是双链，如用于基因突变体的构建，但寡核苷酸通常为单链，如用于探针；本发明的寡核苷酸可以是有义或反义寡核苷酸。在这里涉及的术语“天然存在的核苷酸”包括脱氧核糖核苷酸和核糖核甘酸。在这里涉及的术语“经修饰的核苷酸”包括具有经修饰或取代的糖基等的核苷酸。在这里涉及的术语“寡核苷酸键”包括寡核苷酸连键如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、phosphoroanilothioate、phoshoraniladate、phosphoroamidate等。见如LaPlanche等，Nucl.Acids Res.149081(1986)；Stec等J.Am.Chem.Soc.1066077(1984)；Stein等，Nucl.Acids Res.，163209(1988)；Zon等，Anti-Cancer Drug Design 6539(1991)；Zon等，Oligonucleotides and AnaloguesA Practical Approach，pp.87-108(F.Eckstein，Ed.，Oxford University Press，OxfordEngland(1991))；Stec等，美国专利No.5,151,510；Uhlmann andPeyman，Chemical Reviews，90543(1990)，这些公开内容在这里通过引用作为参考。如果需要，寡核苷酸可包括用于检测的标记。“有效连接的”序列包括邻接目的基因的表达控制序列和反式作用或在一段距离处控制目的基因的表达控制序列。如此处使用的术语“表达控制序列”指实现其连接的编码序列的表达和加工必需的多核苷酸序列。表达控制序列包括适当的转录起始、终止、启动子和增强子序列；有效的RNA加工信号如剪接和多腺苷酸化信号；稳定细胞质mRNA的序列；增强翻译效率的序列(即Kozak共有序列)；增强蛋白质稳定性的序列；以及当需要时，包括增强蛋白分泌的序列。取决于宿主生物体，这种控制序列的性质不同；在原核生物中，这种控制序列一般包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列；在真核生物中，通常，这种控制序列包括启动子和转录终止序列。术语“控制序列”有意包括(最少)其存在对表达和加工处理是必需的所有成分，并还可包括其存在是有利的额外成分，例如引导序列和融合伴侣序列。如此处使用的术语“载体”意指能将另外的核酸运输至其已经连接了的核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其指额外的DNA片段可连接进去的环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中额外的DNA片段可连接至该病毒基因组中。某些载体能在其导入的宿主细胞中自主复制(如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其它载体(如非附加型哺乳动物载体)在将其导入宿主细胞后可整合至宿主细胞的基因组中，并因而可与宿主基因组一起复制。而且，某些载体能指导与它们有效地连接的基因的表达。该载体在这里称为“重组表达载体”(或简称“表达载体”)。一般而言，重组DNA技术中有用的表达载体常常是质粒形式。在本说明书中，因为质粒是最常使用的载体形式，所以“质粒”和“载体”可互换使用。然而，本发明有意包括提供等同功能的这类其它形式的表达载体，例如病毒载体(如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)。如此处使用的术语“重组宿主细胞”(或简称“宿主细胞”)意指已经导入重组表达载体的细胞。应该理解该术语用意不仅指特定的对象细胞而且指这种细胞的后代。因为某些修饰由于突变或环境的影响可能发生在随后的子代，实际上，这种子代可能与亲本细胞不完全相同，但仍然包括在如此处使用的术语“宿主细胞”的范围内。在这里涉及的术语“选择性杂交”指可检测地和特异性地结合。根据本发明的多核苷酸、寡核苷酸及其片段在杂交和洗涤条件下可选择性地杂交至核酸链，所述的杂交和洗涤条件使可检测的结合至非特异性核酸的明显量最小化。“高严格性”或“高度严格的”条件可用于获得本领域已知的并在这里讨论的选择性杂交条件。“高严格性”或“高度严格的”条件的实例是于42℃杂交温度、在6X SSPE或SSC，50％甲酰胺，5X Denhardt’s试剂，0.5％SDS，100μg/ml变性的成碎片的鲑精DNA的杂交缓冲液中将多核苷酸与另一种多核苷酸温育12-16小时，其中可将一种多核苷酸固定至固体表面如膜上，随后，于55℃用1X SSC，0.5％SDS的洗涤缓冲液洗涤两次的方法。也见Sambrook等，同上，pp.9.50-9.55。在核苷酸序列的上下文中术语“百分比序列同一性”指当以最大对应排列比对时两个序列中相同的残基。序列同一性比较的长度可超过至少约9个核苷酸、通常至少约18个核苷酸、更通常为至少约24个核苷酸、典型地为至少约28个核苷酸、更典型的为至少约32个核苷酸，并且优选地为至少约36、48或更多核苷酸的一段序列。本领域已知的可用于测量核苷酸序列同一性的不同算法有许多。例如，多核苷酸序列可使用由加利福尼亚圣地亚哥Accelrys公司的Wisconsin程序包10.3版中的程序FASTA、Gap或Bestfit比较。FASTA，其包括如FASTA2和FASTA3程序，提供了查询序列和检索序列之间最佳重叠区域的比对和百分比序列同一性(Pearson，Methods Enzymol.，18363-98(1990)；Pearson，Methods Mol.Biol.，132185-219(2000)；Pearson，Methods Enzymol.，266227-258(1996)；Pearson，J.Mol.Biol.，27671-84(1998)；在这里将其通过引用作为参考)。除非另外指定，使用特定程序或算法的默认参数。例如，核苷酸序列之间的百分比序列同一性可使用Wisconsin程序包10.3版提供的采用其默认参数(字段大小为6和NOPAM因子用于评分矩阵)的FASTA或使用采用其默认参数的Gap来测定，将其在这里通过引用作为参考。除非另外说明，对核苷酸序列的指代包含其互补链。因此，对具有特定序列的核酸分子的指代应该理解为包含其互补链，具有其互补序列。在分子生物学领域，研究员可互换使用术语“百分比序列同一性”、“百分比序列相似性”和“百分比序列同源性”。在本申请中，这些术语应该仅对于核苷酸序列具有相同的含义。当涉及核酸或其片段时，术语“显著相似性”或“显著序列相似性”表示当以合适的核苷酸插入或删除与另外的核苷酸(或其互补链)最优地比对时，在至少约85％，优选地至少约90％，更优选地至少约95％、96％、97％、98％或99％的核苷酸碱基中存在核苷酸序列同一性，如通过任何熟知的序列同一性算法测量，如上面讨论的FASTA、BLAST或Gap。当应用于多肽时，术语“显著同一性”表示两个肽序列，当例如通过采用默认缺口权重(gap weights)的程序GAP或BESTFIT最优比对时，具有至少75％或80％的序列同一性，优选地至少90％或95％的序列同一性，甚至更优选地至少98％或99％的序列同一性。优选地，不一致的残基位置因保守性氨基酸替换而不同。“保守性氨基酸替换”是指其中氨基酸残基由带有具有相似化学性质(如电荷或疏水性)的侧链(R基团)的另外的氨基酸残基替换。一般而言，保守性氨基酸替换基本不会改变蛋白质的功能特性。在两个或多个氨基酸序列由于保守替换而彼此不同的情况下，可上调百分比序列同一性或相似程度以校正替换的保守性质。进行这种调节的方法是本领域那些技术人员熟知的。参见例如Pearson，Methods Mol.Biol.，24307-31(1994)，将其在这里通过引用作为参考。带有具有相似化学性质的侧链的氨基酸组的实例包括1)脂族侧链甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；2)脂族-羟基侧链丝氨酸和苏氨酸；3)包含酰胺的侧链天冬酰胺和谷氨酰胺；4)芳香侧链苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；5)碱性侧链赖氨酸、精氨酸和组氨酸；及6)包含硫的侧链是半胱氨酸和蛋氨酸。优选的保守氨基酸替换组是缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。备选地，保守的替换是在PAM250 log-可能性矩阵中具有正值的任何改变，该矩阵公开于Gonnet等，Science，2561443-45(1992)，这里将其通过引用作为参考。“适度保守性”替换是在PAM250 log-可能性矩阵中具有非负值的任何改变。多肽的序列相似性通常使用序列分析软件测量。通过赋给不同置换、缺失和其它修饰(包括保守性氨基酸置换)的相似性度量，蛋白质分析软件匹配相似序列。例如，GCG包括程序如“Gap”和“Bestfit”，其可用默认参数测定紧密相关的多肽如来自不同生物体物种的同源性多肽之间或野生型蛋白质和其突变型蛋白之间的序列同源性或序列同一性。见，例如Wisconsin程序包10.3版本。多肽序列也可使用Wisconsin程序包10.3版本中采用默认的或推荐的参数的FASTA程序比较。FASTA(如FASTA2和FASTA3)提供了查询序列和搜索序列之间最佳重叠的区域的比对和百分比序列同一性(Pearson(1990)；Pearson(2000))。当将本发明的序列和含有大量来自不同生物体的序列的数据库相比较时，另外优选的算法是计算机程序BLAST，特别是blastp或tblastn，采用默认参数。见，例如Altschul等，J.Mol.Biol.215403-410(1990)；Altschul等，Nucleic Acids Res.253389-402(1997)，在这里将其通过引用作为参考。比较同源性的多肽序列的长度一般为至少约16个氨基酸残基，通常至少约20个残基，更通常为至少约24个残基，典型的为至少约28个残基，并且优选多于约35个残基。当搜索含有来自大量不同生物体的序列的数据库时，优选比较氨基酸序列。如此处使用，术语“标记”或“经标记的”指将另一种分子掺入抗体中。在一个实施方案中，该标记是可检测的标记，如掺入放射性标记的氨基酸或附着可通过标记的抗生物素蛋白(如，含有可通过光学或比色法检测的荧光标记或酶活性的抗生物素蛋白链菌素)检测的生物素基部分至多肽上。在另一个实施方案中，标记物或标记可以是治疗性的，如药物缀合物或毒素。标记多肽和糖蛋白的多种方法是本领域已知的并可使用。多肽标记的实例包括但不限于下列放射性同位素或放射性核素(如3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)、荧光标记(如FITC、若丹明、稀土元素荧光体)、酶标记(如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光标记、生物素基、由第二报道分子识别的预定的多肽表位(如亮氨酸拉链对序列、二抗的结合位点、金属结合结构域、附加表位)、磁性试剂如钆螯合物、毒素如百日咳毒素、紫杉酚、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、鬼臼噻吩甙、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、阿霉素、柔红霉素、二羟蒽林二酮(dihydroxy anthracin dione)、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔以及嘌呤霉素和其类似物或同系物。在一些实施方案中，标记由不同长度的间隔臂连接以减少可能的位阻。术语“剂/试剂”在此用于表示化合物、化合物的混合物、生物学大分子或由生物学材料制成的提取物。如此处使用的术语“药剂或药物”指正确施用于患者时能引起理想疗效的化合物或组合物。这里其它的化学术语根据本领域的常规用法使用，如The McGraw-HillDictionary of Chemical Terms(Parker，S.，Ed.，McGraw-Hill，SanFrancisco(1985))举例说明的，在这里将其通过引用作为参考。术语“抗炎”剂或“免疫调节”剂在此用以指具有在受试者包括人中抑制炎症包括炎性疾病的功能特性的试剂。在本发明不同的实施方案中，炎性疾病可以是但不限于胃肠道炎性疾病，包括克隆氏病、溃疡性结肠炎、憩室疾病、胃炎、肝病、原发性胆管纤维硬化、硬化性胆管炎。炎性疾病还包括但不限于腹部疾病(包括腹膜炎、阑尾炎、胆道疾病)、急性横贯性脊髓炎、变应性皮炎(包括变应性皮肤、变应性湿疹、皮肤特应性、特应性湿疹、特应性皮炎、皮肤炎症、炎性湿疹、炎性皮炎、跳蚤皮肤、粟粒性皮炎、粟粒性湿疹、屋尘螨皮肤)、强直性脊柱炎(莱特尔综合征)、哮喘、气道炎症、动脉粥样硬化症、动脉硬化、胆管闭锁、膀胱炎症、乳腺癌、心血管炎症(包括血管炎、类风湿性甲褶梗死、腿溃疡、多肌炎、慢性血管炎症、心包炎、慢性阻塞性肺病)、慢性胰腺炎、神经周围炎症、结肠炎(包括阿米巴结肠炎、感染性结肠炎、细菌性结肠炎、克隆氏结肠炎、缺血性结肠炎、溃疡性结肠炎、特发性直肠结肠炎、炎性肠病、假膜性结肠炎)、胶原血管病症(类风湿性关节炎、SLE、进行性全身性硬化症、混合性结缔组织病、糖尿病)、克隆氏病(节段性回肠炎、肉芽肿性回肠炎、回肠结肠炎、消化系统炎症)、脱髓鞘病(包括脊髓炎、多发性硬化症、播散性脑硬化、急性播散性脑脊髓炎、静脉周脱髓鞘、维生素B12缺乏病、格-巴二氏综合征、MS-相关逆转录病毒)、皮肌炎、憩室炎、渗出性腹泻、胃炎、肉芽肿性肝炎、肉芽肿性炎症、胆囊炎、胰岛素依赖型糖尿病、肝脏炎性疾病(肝纤维化原发性胆汁性肝硬变、肝炎、硬化性胆管炎)、肺部炎症(特发性肺纤维变性、肺部嗜酸细胞性肉芽肿、肺组织细胞增多病X、细支气管周炎症、急性支气管炎)、性病性淋巴肉芽肿、恶性黑色素瘤、口/牙疾病(包括龈炎、牙周病)、粘膜炎、肌肉骨骼系统炎症(肌炎)、非酒精性脂肪肝炎(非酒精性脂肪肝疾病)、眼&眶炎症(包括眼色素层炎、视神经炎、周围性类风湿性溃疡、外周角膜炎症)、骨关节炎、骨髓炎、咽炎症、多关节炎、直肠炎、银屑病、放射损伤、结节病、镰状细胞necropathy、血栓性浅静脉炎、全身炎症反应综合征、甲状腺炎、系统性红斑狼疮、移植物抗宿主病、急性烧伤、贝塞氏综合征、合格伦综合征。术语患者和受试者包括人和兽医受试者。
人抗-MAdCAM抗体及其表征在一个实施方案中，本发明提供包含人CDR序列的抗-MAdCAM抗体。在一个优选的实施方案中，本发明提供人抗-MAdCAM抗体。在一些实施方案中，通过免疫非人转基因动物如啮齿动物产生人抗-MAdCAM抗体，其中所述动物的基因组包含人免疫球蛋白基因以使得该转基因动物产生人抗体。在一些实施方案中，本发明提供不结合补体的抗-MAdCAM抗体。在一个优选的实施方案中，该抗-MAdCAM抗体是1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod和7.26.4-mod。在另一个优选实施方案中，抗-MAdCAM抗体包含轻链，所述的轻链包含选自SEQ ID NO4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、54、58、62、66或68的氨基酸序列(有或无信号序列)，或任何一种所述氨基酸序列的可变区，或来自这些氨基酸序列的一个或多个CDR。在另一个优选的实施方案中，该抗-MAdCAM抗体包含重链，所述的重链包含选自SEQ ID NO2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、42、46、52、56、60或64的氨基酸序列(有或无信号序列)，或可变区的氨基酸序列，或来自所述氨基酸序列的一个或多个CDR。也包含于本发明的是人抗-MAdCAM抗体，所述的抗体包含上面提及的序列任意之一的从CDR1开始至CDR3结束的氨基酸序列。本发明进一步提供包含上面提及的序列任意之一的一个或多个FR区的抗-MAdCAM抗体。本发明进一步提供包含前面提及的氨基酸序列之一的抗-MAdCAM抗体，在所述序列中已作了一处或多处修饰。在一些实施方案中，将抗体中可能有化学反应性的半胱氨酸用另外的残基(例如但不限于丙氨酸或丝氨酸)置换。在一个实施方案中，置换是在非经典的半胱氨酸处进行。置换可在抗体的可变区的CDR或框架区或在恒定区进行。在一些实施方案中，半胱氨酸是经典的(canonical)。在一些实施方案中，进行氨基酸替换是为除去抗体中可能的蛋白水解位点。该位点可存在于抗体的可变区CDR或框架区或恒定区。置换半胱氨酸残基并去除蛋白水解位点可减少抗体产品中的异质性。在一些实施方案中，形成可能的脱酰胺作用位点的天冬酰胺-甘氨酸对可通过改变所述残基中一个或两者而除去。在一些实施方案中，进行氨基酸替换以增加或去除本发明抗体可变区中潜在的糖基化位点。在一些实施方案中，切割本明抗-MAdCAM抗体重链的C-末端赖氨酸。在本发明不同的实施方案中，抗-MAdCAM抗体的重链和轻链可任选地包括信号序列。在一方面，本发明提供12种抑制性人抗-MAdCAM单克隆抗体及生产它们的杂交瘤细胞系。表1列出编码全长的重链和轻链(包括信号序列)的核酸及对应的全长的推断出的氨基酸序列的序列标识符(SEQID NO)。
表1 在另一方面，本发明提供某些上述人抗-MAdCAM单克隆抗体的经修饰的形式。表2列出经修饰的抗体的DNA和蛋白质序列的序列标识符。
表2 抗-MAdCAM抗体的种类和亚类抗体可以是IgG、IgM、IgE、IgE或IgD分子。在一优选的实施方案中，抗体是IgG类并是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚类。在一更优选的实施方案中，该抗-MAdCAM抗体是IgG2或IgG4亚类。在另一个优选的实施方案中，该抗-MAdCAM抗体是与抗体1.7.2、1.8.2、7.16.6、7.20.5、7.26.4、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod或7.26.4-mod相同的类别和亚类，为IgG2；或与6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1或9.8.2相同的类和亚类，为IgG4。抗-MAdCAM抗体的类和亚类可通过本领域已知的任何方法测定。一般而言，抗体的类和亚类可使用对特定类和亚类的抗体特异性的抗体测定。这些抗体是可从商业获得的。ELISA、蛋白质印迹法及其它技术能测定类和亚类。备选地，类和亚类可通过测序抗体重链和/或轻链的全部或部分恒定区，将它们的氨基酸序列与各种不同类和亚类的免疫球蛋白的已知氨基酸序列相比较而测定，确定抗体的类和亚类为显示最高的序列同一性的类别。
物种和分子选择性在本发明的另一方面，该抗-MAdCAM抗体显示物种和分子选择性。在一个实施方案中，该抗-MAdCAM抗体结合至人、短尾猴或狗MAdCAM上。在一些实施方案中，抗-MAdCAM抗体不结合至新世纪猴种类如狨。遵循本说明书的教导，可以使用本领域熟知的方法测定抗-MAdCAM抗体的物种选择性。例如，可使用蛋白质印迹法、FACS、ELISA或免疫组织化学来测定物种选择性。在一优选的实施方案中，人们可使用免疫组织化学测定物种选择性。在一些实施方案中，特异性结合MAdCAM的抗-MAdCAM抗体对MAdCAM的选择性比对VCAM、纤连蛋白或任何其它的抗原强至少10倍，优选至少20、30、40、50、60、70、80或90倍，最优选至少100倍。在一优选的实施方案中，抗-MAdCAM抗体不显示任何明显的与VCAM、纤连蛋白或除MAdCAM外任何其它抗原的结合。可按照本说明书的教导使用本领域熟知的方法测定抗-MAdCAM抗体对MAdCAM的选择性。例如，人们可使用蛋白质印迹法、FACS、ELISA或免疫组织化学测定该选择性。
抗-MAdCAM抗体对MAdCAM的结合亲和性在本发明的另一方面，该抗-MAdCAM抗体以高亲和性特异性地结合至MAdCAM。在一个实施方案中，当使用表面等离子共振如BIAcore测量时，抗-MAdCAM抗体以3×10-8M或更小的Kd特异性地结合至MAdCAM。在更优选的实施方案中，抗体以1×10-8或更小或者1×10-9M或更小的Kd特异性地结合至MAdCAM。在一个甚至更优选的实施方案中，该抗体以1×10-10M的Kd或更小的Kd特异性地结合至MAdCAM。在其它优选的实施方案中，本发明抗体以2.66×10-10M或更小、2.35×10-11M或更小或者9×10-12M或更小的Kd特异性地结合至MAdCAM。在另外优选的实施方案中，该抗体以1×10-11M或更小的Kd特异性地结合至MAdCAM。在另一个优选的实施方案中，该抗体以与选自1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod或7.26.4-mod的抗体基本相同的Kd特异性地结合至MAdCAM。与相同试验中参照抗体的Kd比较，具有与参照抗体“基本相同的Kd”的抗体的Kd为±100pM，优选地±50pM，更优选地±20pM，依然更优选地±10pM、±5pM或±2pM。在另一个优选的实施方案中，该抗体以与包含来自选自1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod或7.26.4-mod的抗体的一个或多个可变区或一个或多个CDR的抗体基本相同的Kd结合至MAdCAM。在另一个优选的实施方案中，抗体以与包含选自SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、52、54、56、58、62、64、66或68的氨基酸序列(有或无信号序列)之一或其可变区的抗体基本相同的Kd结合至MAdCAM。在另一个优选的实施方案中，抗体以与包含来自某种抗体的一个或多个CDR的抗体基本相同的Kd结合至MAdCAM，所述的某种抗体包含选自SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、52、54、56、58、62、64、66或68的氨基酸序列。抗-MAdCAM抗体对MAdCAM的结合亲和性可通过本领域已知的任何方法测定。在一个实施方案中，结合亲和性可通过竞争性ELISA、RIA或表面等离子共振如BIAcore来测定。在一更优选的实施方案中，结合亲和性通过表面等离子共振测定。在一甚至更优选的实施方案中，结合亲和性和解离速率可通过BIAcore测定。测定结合亲和性的实例在下面实施例II中描述。
抗-MAdCAM抗体的半衰期根据本发明的另一目的，抗-MAdCAM抗体在体内或体外具有至少1天的半衰期。在一个优选的实施方案中，抗体或其部分具有至少3天的半衰期。在一个更优选的实施方案中，抗体或其部分具有4天或更长的半衰期。在另一个实施方案中，抗体或其部分具有8天或更长的半衰期。如下讨论的，在另一个实施方案中，该抗体或其抗原结合部分经衍生或修饰以使其具有更长的半衰期。在另一个优选的实施方案中，抗体可包含点突变以延长血清半衰期，如公开于2000年2月24日的WO00/09560描述。抗体半衰期可通过本领域一般技术人员已知的任何方法测量。例如，抗体半衰期可以以适当的时段通过蛋白质印迹法、ELISA或RIA测量。抗体半衰期可在任何适当的动物例如灵长类动物如短尾猴或人中测量。
抗-MAdCAM抗体识别的MAdCAM表位的鉴定本发明也提供人抗-MAdCAM抗体，该抗体与这里提供的人抗-MAdCAM抗体结合相同的抗原或表位。此外，本发明提供与人抗-MAdCAM抗体竞争或交叉竞争的人抗-MAdCAM抗体。在一优选的实施方案中，人抗-MAdCAM抗体是1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod或7.26.4-mod。在另一个优选的实施方案中，人抗-MAdCAM抗体包含来自选自1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod或7.26.4-mod的抗体的一个或多个可变区或一个或多个CDR。在另一个优选的实施方案中，人抗-MAdCAM抗体包含选自SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、52、54、56、58、62、64、66或68(有或无信号序列)的氨基酸序列之一或其可变区。在另一个优选的实施方案中，人抗-MAdCAM抗体包含一个或多个CDR，所述CDR来自包含选自SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、52、54、56、58、62、64、66或68的氨基酸序列之一的抗体。在一个高度优选的实施方案中，抗-MAdCAM抗体是另一种人抗体。可使用本领域已知的多种方法测定抗-MAdCAM抗体是否与另一种抗-MAdCAM抗体结合相同的抗原。例如，可使用一种已知的抗-MAdCAM抗体捕获抗原，将该抗原从抗-MAdCAM抗体洗脱，并随后测定试验抗体是否会结合洗脱的抗原。可通过在饱和条件下将抗-MAdCAM抗体结合至MAdCAM，并随后测量试验抗体结合至MAdCAM的能力来测定一种抗体是否与抗-MAdCAM抗体竞争。如果试验抗体能与抗-MAdCAM抗体在相同的时间结合至MAdCAM，那么与抗-MAdCAM抗体相比，该试验抗体结合至不同的表位。然而，如果该试验抗体不能在相同的时间结合至MAdCAM，那么该试验抗体与该人抗-MAdCAM抗体竞争。该实验可使用ELISA或表面等离子共振或优选地用BIAcore进行。为检验抗-MAdCAM抗体是否与另一种抗-MAdCAM抗体交叉竞争，可以两个方向使用上述的竞争方法，即测定已知的抗体是否阻断试验抗体，或反过来。
轻链和重链基因利用本发明也提供包含由人κ基因编码的轻链可变区的抗-MAdCAM抗体。在一优选的实施方案中，该轻链可变区由人VκA2、A3、A26、B3、O12或O18基因家族编码。在不同的实施方案中，该轻链包含不多于11个，不多于6个或不多于3个从种系人VκA2、A3、A26、B3、O12或O18序列的氨基酸替换。在一个优选的实施方案中，氨基酸替换是保守性替换。SEQ ID NO4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44和48提供了12种抗-MAdCAM抗体，即1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4和9.8.2的全长κ轻链的氨基酸序列。图1K-1T是12种抗-MAdCAM抗体的轻链可变区氨基酸序列与其从中衍生的种系序列的比对。图2A显示12种抗-MAdCAM抗体的κ轻链的轻链可变区氨基酸序列彼此之间的比对。按照本说明书的教导，本领域一般技术人员可确定另外的抗-MAdCAM抗体的种系序列和抗体序列之间的不同。SEQ ID NO54、58、62、66或68提供了5种另外的抗-MAdCAM抗体的全长κ轻链的氨基酸序列，所述的抗体是6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod和7.26.4-mod，分别由其亲本抗-MAdCAM抗体，即6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.77.1或7.26.4通过氨基酸替换进行修饰。在一优选的实施方案中，相对于种系氨基酸序列，抗-MAdCAM抗体的VL包含与抗体1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod体或7.26.4-mod的任何一个或多个VL相同的突变。本发明包括与示例的抗体利用相同的人Vκ和人Jk基因的抗-MAdCAM抗体。在一些实施方案中，抗体包含一处或多处与一种或多种示例抗体相同的自种系的突变。在一些实施方案中，抗体在与一种或多种示例抗体相同的一个或多个位置包含不同的替换。例如，抗-MAdCAM抗体的VL可含有一个或多个与抗体7.16.6中存在的替换相同的氨基酸替换，以及另一与抗体7.26.4相同的氨基酸替换。以该方式，可混合搭配抗体结合的不同特征以改变如抗体对MAdCAM的亲和性或其从抗原的解离速率。在另一个实施方案中，突变发生在与抗体1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod或7.26.4-mod的任何一个或多个VL中发现的突变位置相同的位置，但进行保守性氨基酸替换而不是用相同的氨基酸。例如，如果与种系相比，抗体1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod或7.26.4-mod之一中的氨基酸替换是谷氨酸，则可保守地替换天冬氨酸。类似地，如果氨基酸替换是丝氨酸，则可保守地替换苏氨酸。在另一优选的实施方案中，轻链包含与1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod或7.26.4-mod的VL的氨基酸序列相同的氨基酸序列。在另一个非常优选的实施方案中，轻链包含与1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod或7.26.4-mod的轻链CDR区相同的氨基酸序列。在另一优选的实施方案中，轻链包含具有1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod或7.26.4-mod轻链的至少一个CDR区的氨基酸序列。在另一个优选的实施方案中，轻链包含具有来自利用相同Vk和Jk基因的不同轻链的CDR的氨基酸序列。在一个更优选的实施方案中，来自不同轻链的CDR从1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod或7.26.4-mod获得。在另一优选的实施方案中，轻链包含选自SEQ ID NO4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、54、58、62、64、66或68的氨基酸序列，有或无信号序列。在另一个实施方案中，轻链包含的氨基酸序列由选自SEQ ID NO3、7、11、15、19、23、27、31、35、39、43、47、53、57、61、65或67(有或无信号序列)的核苷酸序列编码，或由编码与其相比具有1-11个氨基酸插入、缺失或替换的氨基酸序列的核苷酸序列编码。优选地，氨基酸替换是保守性氨基酸替换。在另一个实施方案中，抗体或其部分包含λ轻链。本发明也提供包含人VH基因序列或源于人VH基因的序列的抗-MAdCAM抗体或其部分。在一个实施方案中，重链氨基酸序列源于人VH1-18、3-15、3-21、3-23、3-30、3-33或4-4基因家族。在不同的实施方案中，重链包含不多于15个，不多于6个或不多于3个自种系人VH 1-18、3-15、3-21、3-23、3-30、3-33或4-4基因序列的氨基酸改变。SEQ ID NO2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、42和46提供12种抗-MAdCAM抗体的全长重链的氨基酸序列。图1A-1J是12种抗-MAdCAM抗体的重链可变区的氨基酸序列与其从中衍生的种系序列的比对。图2B显示12种抗-MAdCAM抗体的重链可变区的氨基酸序列彼此间的比对。根据本说明书的教导及本发明的核苷酸序列，本领域一般技术人员可确定12种抗-MAdCAM抗体重链和种系重链的编码的氨基酸序列，并可测定种系序列和抗体序列之间的不同。SEQ ID NO52、56、60和64提供了抗-MAdCAM抗体6.22.2-mod、6.34.2-mod和6.67.1-mod的全长重链的氨基酸序列，所述的抗体分别通过从其亲本抗-MAdCAM抗体6.22.2、6.34.2和6.67.1的氨基酸替换进行修饰而得到。一种另外的经修饰的抗-MAdCAM抗体7.26.4-mod具有SEQ ID NO42的全长重链氨基酸序列。在一优选的实施方案中，相对于种系氨基酸序列，抗-MAdCAM抗体的VH包含与抗体1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod或7.26.4-mod的任何一个或多个VH相同的突变。与上面讨论的相似，抗体包含一处或多处与一种或多种示例抗体相同的自种系的突变。在一些实施方案中，抗体在一个或多个与一种或多种示例抗体相同的位置包含不同的替换。例如，抗-MAdCAM抗体的VH可含有一处或多处与抗体7.16.6中存在的替换相同的氨基酸替换，以及另一与抗体7.26.4相同的氨基酸替换。以该方式，人们可混合搭配抗体结合的不同特征以改变例如该抗体对MAdCAM的亲和性或其从抗原的解离速率。在另一个实施方案中，与种系相比，氨基酸替换发生在与参照抗体1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod或7.26.4-mod的任何一个或多个VH中发现的自种系的替换相同的位置，但该位置是用不同的残基替换，较于参照抗体该替换是保守性替换。在另一优选的实施方案中，重链包含与1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod或7.26.4-mod的VH的氨基酸序列相同的氨基酸序列。在另一个非常优选的实施方案中，重链包含与1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod或7.26.4-mod的重链CDR区相同的氨基酸序列。在另一优选的实施方案中，重链包含来自1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.4、7.26.4、9.8.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod或7.26.4-mod的重链的至少一个CDR区的氨基酸序列。在另一优选的实施方案中，重链包含具有来自不同重链的CDR的氨基酸序列。在一个更优选的实施方案中，来自不同重链的CDR从1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.-mod、6.77.1-mod或7.26.4-mod获得。在另一优选的实施方案中，重链包含选自SEQ ID NO2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、42、46、52、56、60或64的氨基酸序列，有或无信号序列。在另一个实施方案中，重链包含由选自SEQ ID NO1、5、9、13、17、21、25、29、33、37、41、45、51、55、59或63的核苷酸序列或编码与上述相比具有1-15个氨基酸插入、缺失或替换的氨基酸序列的核苷酸序列编码的氨基酸序列。在另一个实施方案中，替换是保守性氨基酸替换。
抗体和产生抗体的细胞系的产生方法免疫法在本发明的一个实施方案中，人抗体通过用MAdCAM抗原免疫含有一些或全部人免疫球蛋白重链和轻链基因座的非人动物而产生。在优选的实施方案中，非人动物是XENOMOUSE动物，其是含有人免疫球蛋白基因座大片段并在小鼠抗体产生方面有缺陷的工程小鼠品系。见，例如Green等，Nature Genetics 713-21(1994)和美国专利5,916,771、5,939,598、5,985,615、5,998,209、6,075,181、6,091,001、6,114,598和6,130,364。也参见WO 91/10741、WO 94/02602、WO 96/34096和WO 96/33735、WO 98/16654、WO 98/24893、WO 98/50433、WO 99/45031、WO 99/53049、WO 0009560和WO 00/037504。该XENOMOUSETM动物产生如同成人的完全人抗体的所有组成成分并产生抗原特异性人mAb。第二代XENOMOUSETM动物通过引入巨碱基大小的人重链基因座和κ轻链基因座的种系构型YAC片段而含有约80％人抗体V基因的所有组成成分。在其它实施方案中，XENOMOUSETM小鼠含有大约全部的人重链和λ轻链基因座。见Mendez等，Nature Genetics 15146-156(1997)，Green和Jakobovits，J.Exp.Med.188483-495(1998)，将其公开内容在这里通过引用作为参考。本发明也提供通过免疫包含人免疫球蛋白基因座的非人转基因动物而从非人、非小鼠动物中生产抗-MAdCAM抗体的方法。人们可使用上面刚刚描述的方法产生这些动物。在这些文献中公开的方法可如美国专利5,994,619(“‘619专利”)中描述的进行修改，将其在这里通过引用作为参考。该‘619专利描述了用于产生新的培养的内细胞团(CICM)细胞和细胞系(其源于猪和奶牛)，以及异源DNA已经插入其中的转基因CICM细胞的方法。CICM转基因细胞可用于产生克隆的转基因胚胎、胎儿和幼仔。该‘619专利也描述了用于产生能传递异源DNA至其后代的转基因动物的方法。在一优选的实施方案中，非人动物可以是大鼠、绵羊、猪、山羊、牛或马。在另一个实施方案中，含有人免疫球蛋白基因座的非人动物是具有人免疫球蛋白的“小基因座(minilocus)”的动物。在小基因座方法中，通过包含来自Ig基因座的单个基因来模拟外源Ig基因座。从而，将一个或多个VH基因、一个或多个DH基因、一个或多个JH基因、μ恒定区和另外的恒定区(优选地γ恒定区)构成一种构建体用于插入至动物中。该方法尤其描述于美国专利No.5,545,807、5,545,806、5,625,126、5,633,425、5,661,016、5,770,429、5,789,650、5,814,318、5,591,669、5,612,205、5,721,367、5,789,215和5,643,763中，将其在这里通过引用作为参考。小基因座方法的优势是迅速，包含Ig基因座部分的构建体能迅速产生并导入动物中。然而，小基因座方法一个潜在缺点是可能没有足够的免疫球蛋白多样性支持完全的B细胞发育，从而抗体产生可能较低。为生产人抗-MAdCAM抗体，用MAdCAM抗原免疫包含一些或全部人免疫球蛋白基因座的非人动物并将抗体或产生抗体的细胞从动物中分离。MAdCAM抗原可以是经分离和/或纯化的MAdCAM并优选地是人MAdCAM。在另一个实施方案中，MAdCAM抗原是MAdCAM片段，优选地是MAdCAM的胞外结构域。在另一个实施方案中，MAdCAM抗原是包含至少一个MAdCAM表位的片段。在另一个实施方案中，MAdCAM抗原是在其细胞表面表达MAdCAM的细胞，优选地是在其细胞表面过量表达MAdCAM的细胞。免疫动物可通过本领域已知的任何方法完成。见，如Harlow和Lane，AntibodiesA Laboratory Manual，New YorkCold SpringHarbor Press(1990)。用于免疫非人动物如小鼠、大鼠、绵羊、山羊、猪、牛和马的方法是本领域熟知的。见，例如Harlow和Lane以及美国专利5,994,619。在一优选的实施方案中，MAdCAM抗原与一种佐剂一起施用以刺激免疫应答。这种佐剂包括完全或不完全弗氏佐剂、RIBI(胞壁酰二肽)或ISCOM(免疫刺激复合物)。这种佐剂可通过隔离多肽于局部的沉积中而保护多肽免于迅速分散，或它们可含有刺激宿主分泌对巨噬细胞和免疫系统的其它成分的趋化性因子的物质。优选地，如果施用多肽，该免疫接种程序表将包含两次或多次施用多肽，在数周内展开。实施例I提供了用磷酸盐缓冲盐水中的全长人MAdCAM免疫XENOMOUSETM动物的方案。
抗体和产生抗体的细胞系的产生用MAdCAM抗原免疫动物后，抗体和/或产生抗体的细胞可从该动物中获得。包含抗-MAdCAM抗体的血清可通过放血或处死动物从该动物中获得。血清可如其从动物中获得那样使用，可从该血清获得免疫球蛋白部分，或可从血清中纯化抗-MAdCAM抗体。在另一个实施方案中，产生抗体的无限增殖化细胞系可从经免疫的动物中制备。免疫后，处死动物并使用本领域熟知的方法使B细胞永生。使细胞永生的方法包括但不限于用癌基因转染它们、用致癌病毒感染它们并将其在选择永生化细胞的条件下培养、使其接受致癌或突变化合物影响、将其与无限增殖化细胞如骨髓瘤细胞融合以及使肿瘤抑制基因失活。见，例如Harlow和Lane，同上。在涉及骨髓瘤细胞的实施方案中，骨髓瘤细胞不分泌免疫球蛋白多肽(非分泌细胞系)。永生化并用抗生素选择后，使用MAdCAM、它的一部分或表达MAdCAM的细胞筛选永生化细胞或其培养上清液。在一优选的实施方案中，初次筛选可使用酶联免疫测定(ELISA)或放射免疫测定法(RIA)进行，优选使用ELISA进行。ELISA筛选的实例在PCT公开No.WO 00/37504中提供，将其在这里通过引用作为参考。在另一个实施方案中，产生抗体的细胞可从具有自身免疫性病症及表达抗-MAdCAM抗体的人中制备。表达抗-MAdCAM抗体的细胞可通过分离白细胞并使其接受荧光激活细胞分选术(FACS)或通过在包被有MAdCAM或其部分的平板上淘洗来分离。可将这些细胞与人非分泌骨髓瘤融合以产生表达人抗-MAdCAM抗体的人杂交瘤。一般而言，这是一个次优选的实施方案，因为有可能抗-MAdCAM抗体对MAdCAM具有低的亲和性。对产生抗-MAdCAM抗体的细胞如杂交瘤进行选择、克隆并进一步筛选理想的特征，包括健康的细胞生长、高的抗体产生及理想的抗体特征，如下进一步讨论的。杂交瘤可在体内在同系动物、在缺乏免疫系统的动物如裸鼠中，或在体外细胞培养中培养和扩充。选择、克隆和扩充杂交瘤的方法是本领域那些一般技术人员熟知的。优选地，经免疫的动物是表达人免疫球蛋白基因的非人动物并且将脾的B细胞融合至源于与该非人动物相同物种的骨髓瘤。更优选地，免疫的动物是XENOMOUSETM动物并且骨髓瘤细胞系是非分泌性小鼠骨髓瘤，例如骨髓瘤细胞系是P3-X63-AG8-653(ATCC)。参见，如实施例I。因此，在一个实施方案中，本发明提供用于产生能产生针对MAdCAM的人单克隆抗体或其片段的细胞系的方法，方法包括(a)用MAdCAM、MAdCAM的一部分或表达MAdCAM的细胞或组织免疫在这里描述的非人转基因动物；(b)让该转基因动物产生对MAdCAM的免疫应答；(c)从转基因动物中分离产生抗体的细胞；(d)使产生抗体的细胞永生；(e)建立永生的产生抗体的细胞的独立单克隆群；并(f)筛选该永生的产生抗体的细胞或其培养上清液以鉴定针对MAdCAM的抗体。在一方面，本发明提供产生人抗-MAdCAM抗体的杂交瘤。在一优选的实施方案中，杂交瘤是小鼠杂交瘤，如上描述的。在另一个实施方案中，杂交瘤在非人、非小鼠物种如大鼠、绵羊、猪、山羊、牛或马中产生。在另一个实施方案中，杂交瘤是人杂交瘤，其中人非分泌性骨髓瘤与表达抗-MAdCAM抗体的人细胞融合。
核酸、载体、宿主细胞和产生抗体的重组方法核酸编码本发明抗-MAdCAM抗体的核酸分子得以提供。在一个实施方案中，核酸分子编码抗-MAdCAM免疫球蛋白的重链和/或轻链。在一优选的实施方案中，单个核酸分子编码抗-MAdCAM免疫球蛋白的重链而另一个核酸分子编码抗-MAdCAM免疫球蛋白的轻链。在一更优选的实施方案中，编码的免疫球蛋白是人免疫球蛋白，优选的是人IgG。编码的轻链可以是λ链或κ链，优选地是κ链。在一优选的实施方案中编码轻链可变区的核酸分子包括人VκA2、A3、A26、B3、O12或O18基因的种系序列或所述序列的变体。在一优选的实施方案中，编码轻链的核酸分子包含源于人Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4或Jκ5基因的序列。在一优选的实施方案中，编码轻链的核酸分子编码不多于11个自种系A2、A3、A26、B3、O12或O18Vκ基因的氨基酸改变，优选不多于6个氨基酸改变，并且更优选地不多于3个氨基酸改变。在一更优选的实施方案中，编码轻链的核酸是种系序列。本发明提供编码与种系序列相比含有至多11个氨基酸改变的轻链可变区(VL)的核酸分子，其中氨基酸变化与抗体1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod或7.26.4-mod之一的VL自种系序列的氨基酸变化一致。本发明也提供含有编码1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod或7.26.4-mod的轻链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列的核酸分子。本发明也提供含有编码1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod或7.26.4-mod的轻链任意之一的一个或多个CDR的氨基酸序列的核苷酸序列的核酸分子。在一优选的实施方案中，核酸分子包含编码1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod或7.26.4-mod的轻链任意之一的所有CDR的氨基酸序列的核苷酸序列。在另一个实施方案中，核酸分子包含编码SEQ ID NO4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、54、58、62、66、68之一的氨基酸序列的核苷酸序列或包含SEQ ID NO3、7、11、15、19、23、27、31、35、39、43、47、53、57、61、65或67之一的核苷酸序列。在另一优选的实施方案中，核酸分子包含编码SEQ ID NO4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、54、58、62、66、68任意之一的一个或多个CDR的氨基酸序列的核苷酸序列，或包含SEQ ID NO3、7、11、15、19、23、27、31、35、39、43、47、53、57、61、65或67任意之一的一个或多个CDR的核苷酸序列。在一更优选的实施方案中，核酸分子包含编码SEQID NO4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、54、58、62、66、68任意之一的所有CDR的氨基酸序列的核苷酸序列，或包含SEQ IDNO3、7、11、15、19、23、27、31、35、39、43、47、53、57、61、65或67任意之一的所有CDR的核苷酸序列。本发明也提供编码VL的氨基酸序列的核酸分子，所述的VL具有与上面描述的VL，特别是与包含SEQ ID NO4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、54、58、62、66或68之一的氨基酸序列的VL至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致的氨基酸序列。本发明也提供与SEQ ID NO3、7、11、15、19、23、27、31、35、39、43、47、53、57、61、65或67之一的核苷酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致的核苷酸序列。在另一个实施方案中，本发明提供在高度严格条件下与编码如上所述的VL的核酸分子，特别是与包含编码SEQ ID NO4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、54、58、62、66或68的氨基酸序列的核苷酸序列的核酸分子杂交的核酸分子。本发明也提供在高度严格条件下与包含SEQ ID NO3、7、11、15、19、23、27、31、35、39、43、47、53、57、61、65或67之一的核苷酸序列的核酸分子杂交的核酸分子。本发明也提供编码利用人VH 1-18、3-15、3-21、3-23、3-30、3-33或4-4VH基因的重链可变区(VH)的核酸分子。在一些实施方案中，编码VH基因的核酸分子进一步利用人JH4或JH6家族的基因。在一些实施方案中，编码VH基因的核酸分子利用人JH4b或JH6b基因。在另一个实施方案中，核酸分子包含源于人D3-10、4-23、5-5、6-6或6-19基因的序列。在一个更优选的实施方案中，编码VH的核酸分子包含不多于15个自种系VH 1-18、3-15、3-21、3-23、3-30、3-33或4-4基因的氨基酸变化，优选不多于6个氨基酸变化，并且更优选不多于3个氨基酸变化。在一个高度优选的实施方案中，与种系序列相比，编码VH的核酸分子包含至少一个氨基酸变化，其中该氨基酸变化与抗体1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod或7.26.4-mod之一的重链自种系序列的氨基酸变化一致。在一个更优选的实施方案中，该VH与种系序列相比包含不多于15个氨基酸变化，其中该变化与抗体1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod体或7.26.4-mod之一的VH自种系序列的变化一致。在一个实施方案中，核酸分子包含编码1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod或7.26.4-mod的VH的氨基酸序列的核苷酸序列。在另一个实施方案中，核酸分子包含编码1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod或7.26.4-mod的重链的一个或多个CDR的氨基酸序列的核苷酸序列。在一优选的实施方案中，核酸分子包含编码1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod或7.26.4-mod的重链的所有CDR的氨基酸序列的核苷酸序列。在另一优选的实施方案中，核酸分子包含编码SEQ IDNO2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、42、46、52、56、60或64之一的氨基酸序列的核苷酸序列，或包含SEQ ID NO1、5、9、13、17、21、25、29、33、37、41、45、51、55、59或63之一的核苷酸序列。在另一优选的实施方案中，核酸分子包含编码SEQ ID NO2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、42、46、52、56、60或64任意之一的一个或多个CDR的氨基酸序列的核苷酸序列，或包含SEQ ID NO1、5、9、13、17、21、25、29、33、37、41、45、51、55、59或63任意之一的一个或多个CDR的核苷酸序列。在一优选的实施方案中，核酸分子包含编码SEQ ID NO2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、42、46、52、56、60或64任意之一的所有CDR的氨基酸序列的核苷酸序列，或包含SEQ ID NO1、5、9、13、17、21、25、29、33、37、41、45、51、55、59或63任意之一的所有CDR的核苷酸序列。在一些实施方案中核酸分子包含编码任何上面提及的抗-MAdCAM抗体的重链或轻链从CDR1开始到CDR3结束的连续区域的核苷酸序列。在另一个实施方案中，核酸分子编码VH的氨基酸序列，该VH与如上刚描述的编码VH的氨基酸序列之一，特别是与包含SEQ ID NO2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、42、46、52、56、60或64之一的氨基酸序列的VH至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致。本发明也提供与SEQ ID NO1、5、9、13、17、21、25、29、33、37、41、45、51、55、59或63之一的核苷酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致的核苷酸序列。在另一个实施方案中，编码VH的核酸分子是在高度严格条件下与上述编码VH的核苷酸序列杂交，特别是与包含SEQ ID NO2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、42、46、52、56、60或64之一的氨基酸序列的VH杂交的核酸分子。本发明也提供在高度严格条件下与包含SEQ ID NO1、5、9、13、17、21、25、29、33、37、41、45、51、55、59或63之一的核苷酸序列的核酸分子杂交的编码VH的核苷酸序列。编码抗-MAdCAM抗体的全部重链和轻链之一或两者或其可变区的核苷酸序列可从产生抗-MAdCAM抗体的任何来源获得。分离编码抗体的mRNA的方法是本领域熟知的。见，如Sambrook等，Molecular CloningA Laboratory Manual，2d ed，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)。mRNA可用于产生cDNA以便用于聚合酶链式反应(PCR)或cDNA克隆抗体基因。在本发明的一个实施方案中，核酸分子可从如上所述的表达抗-MAdCAM抗体的杂交瘤获得，优选从这样的杂交瘤获得，所述的杂交瘤具有作为其融合伴侣之一的表达人免疫球蛋白基因的转基因动物细胞，例如XENOMOUSETM动物、非人小鼠转基因动物或非人、非小鼠转基因动物的细胞。在另一个实施方案中，杂交瘤源于非人、非转基因动物，其可用于例如人源化抗体。编码抗-MAdCAM抗体完整重链的核酸分子可通过将编码重链完整可变区或其抗原结合域的核酸分子与编码重链的恒定区的核酸分子融合而构建。类似地，编码抗-MAdCAM抗体轻链的核酸分子可通过将编码轻链可变区或其抗原结合域的核酸分子与编码轻链的恒定区的核酸分子融合而构建。编码VH和VL区的核酸分子可通过将其插入至分别已经编码重链恒定区和轻链恒定区的表达载体，这样VH片段有效地连接至载体内的重链恒定区(CH)片段而VL片段有效地连接至载体内的轻链恒定区(CL)片段，从而转化为全长的抗体基因。备选地，编码VH或VL链的核酸分子通过使用标准的分子生物学技术通过连接，例如连接编码VH链的核酸分子至编码CH链的核酸分子而使其转化成全长的抗体基因。使用编码VL和CL链的核酸分子可达到一样的结果。人重链和轻链恒定区基因的序列是本领域已知的。见，例如Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，5th Ed.，NIHPubl.No.91-3242(1991)。编码全长的重链和/或轻链的核酸分子可随后由已经导入所述核酸分子的细胞表达并且分离抗-MAdCAM抗体。在一优选的实施方案中，编码重链可变区的核酸编码SEQID NO2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、42、46、52、56、60或64的氨基酸序列的可变区，而编码轻链可变区的核酸分子编码SEQ ID NO4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、54、58、62、66或68的氨基酸序列的可变区。在一个实施方案中，编码抗-MAdCAM抗体重链或其抗原结合部分或者抗-MAdCAM抗体轻链或其抗原结合部分的核酸分子可从非人、非小鼠动物中分离，所述的动物能表达人免疫球蛋白基因并已经用MAdCAM抗原免疫。在另一个实施方案中，核酸分子可从源于非转基因动物或产生抗-MAdCAM抗体的人患者的产生抗-MAdCAM抗体的细胞分离。来自产生抗-MAdCAM抗体的细胞的mRNA可通过标准技术分离，使用PCR和文库构建技术克隆和/或扩增，并使用标准方案筛选以获得编码抗-MAdCAM重链和轻链的核酸分子。如下描述，核酸分子可用于重组表达大量的抗-MAdCAM抗体。如下进一步描述，核酸分子也可用于生产嵌合抗体、单链抗体、免疫粘合素、双特异抗体、突变的抗体和抗体衍生物。同样如下描述，如果核酸分子源于非人、非转基因动物，核酸分子可用于抗体人源化。在另一个实施方案中，本发明的核酸分子可用作特定抗体序列的探针或PCR引物。例如，核酸分子探针可用于诊断方法或者核酸分子PCR引物可用于扩增DNA区，该区尤其可用于分离用于产生抗-MAdCAM抗体可变区的核苷酸序列。在一优选的实施方案中，核酸分子是寡核苷酸。在一更优选的实施方案中，寡核苷酸来自目标抗体的重链和轻链的高变区。在一更优选的实施方案中，寡核苷酸编码一个或多个CDR的全部或部分。
载体本发明提供包含编码重链或其抗原结合部分的本发明核酸分子的载体。本发明也提供包含编码轻链或其抗原结合部分的本发明核酸分子的载体。本发明也提供包含编码融合蛋白、修饰抗体、抗体片段和其探针的核酸分子的载体。为表达本发明的抗体或抗体部分，将如上所述获得的编码部分或全长轻链和重链的DNA插入至表达载体，因而基因有效地连接至转录和翻译的控制序列。表达载体包括质粒、逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒(AAV)、植物病毒如花椰菜花叶病毒、烟草花叶病毒、粘粒、YAC、EBV衍生的游离体等。将抗体基因连接进载体中，使得载体中的转录和翻译控制序列发挥它们预期的调节该抗体基因转录和翻译的功能。选择表达载体和表达控制序列使其与使用的表达宿主细胞相容。抗体轻链的基因和抗体重链的基因可插入分开的载体。在一优选的实施方案中，这两种基因都插入同一表达载体。抗体基因可通过标准方法(例如连接抗体基因片段和载体上的互补性限制位点，或如果无限制位点则进行平端连接)插入表达载体。方便的载体是编码功能完全的人CH或CL免疫球蛋白序列的载体，通过设计合适的限制位点使得任何VH或VL序列能如上所述容易地插入和表达。在这种载体中，剪接通常发生在插入的J区的剪接供体位点和在人C区之前的剪接受体位点之间，也发生在人CH外显子中存在的剪接区域。多腺苷酸化和转录终止发生在编码区下游的天然染色体位点。重组表达载体也能编码促进抗体链从宿主细胞分泌的信号肽。抗体链基因可克隆进载体中使得信号肽符合读框地连接至抗体链基因的氨基末端。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即来自非免疫球蛋白的信号肽)。除了抗体链基因，本发明的重组表达载体携带有控制抗体链基因在宿主细胞中表达的调节序列。本领域那些技术人员将理解表达载体的设计，包括对调节序列的选择可依赖于这些因素如待转化的宿主细胞的选择、期望的蛋白质表达水平等。用于哺乳动物宿主细胞表达的优选的调节序列包括指导哺乳动物细胞中高水平蛋白质表达的病毒元件，例如源于逆转录病毒LTR、巨细胞病毒(CMV)(如CMV启动子/增强子)、猿猴病毒40(SV40)(例如SV40启动子/增强子)、腺病毒(如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))的启动子和/或增强子，多瘤和强的哺乳动物启动子如天然免疫球蛋白和肌动蛋白启动子。对于进一步的病毒调控元件和其序列描述，见如美国专利Nos.5,168,062、4,510,245和4,968,615，将其每个在这里通过引用作为参考。用于在植物中表达抗体的方法，包括对启动子和载体的描述以及植物的转化在本领域是已知的。见例如美国专利6,517,529。在细菌细胞或真菌细胞如酵母细胞中表达多肽的方法也是本领域熟知的。除了抗体链基因和调节序列外，本发明的重组表达载体可携带另外的序列，如调节该载体在宿主细胞中的复制的序列(如复制起点)和选择标记基因。选择标记基因便于对载体已经导入的宿主细胞的选择(见，例如美国专利Nos.4,399,216、4,634,665和5,179,017)。例如，通常选择标记基因赋予载体已经导入的宿主细胞以耐药性，例如抗G418、潮霉素或甲氨蝶呤。优选的选择标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(以甲氨蝶呤选择/扩增用于dhfr-宿主细胞)和neo基因(用于G418选择)，以及谷氨酸合成酶基因。
非杂交瘤宿主细胞和重组产生蛋白质的方法编码抗-MAdCAM抗体的重链或其抗原结合部分和/或轻链或其抗原结合部分的核酸分子，及包含这些核酸分子的载体可用于转化合适的哺乳动物、植物、细菌或酵母宿主细胞。转化可通过用于将多核苷酸导入宿主细胞的任何已知方法完成。用于将异源多核苷酸导入哺乳动物细胞的方法是本领域熟知的并包括葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺-介导的转染、原生质体融合、电穿孔术、脂质体中多核苷酸的包封、生物弹注射和直接显微注射DNA至胞核。另外，核酸分子可通过病毒载体引入至哺乳动物细胞。转化细胞的方法是本领域熟知的。见，例如美国专利Nos.4,399,216、4,912,040、4,740,461和4,959,455(该专利在这里通过引用作为参考)。转化植物细胞的方法是本领域熟知的，包括如农杆菌属介导的转化、基因枪转化、直接注射、电穿孔和病毒转化。转化细菌和酵母细胞的方法也是本领域熟知的。为表达可用作宿主的哺乳动物细胞系是本领域熟知的并包括许多可从American Type Culture Collection(ATCC)获得的无限增殖化细胞系。这些尤其包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NS0、SP2细胞、HEK-293T细胞、NIH-3T3细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(如Hep G2)、A549细胞、3T3细胞和许多其它的细胞系。哺乳动物宿主细胞包括人、小鼠、大鼠、狗、猴、猪、山羊、牛、马和仓鼠细胞。通过确定哪种细胞系具有高表达水平来选择特别优选的细胞系。其它可使用的细胞系是昆虫细胞系如Sf9细胞、两栖动物细胞、细菌细胞、植物细胞和真菌细胞。当将编码重链或其抗原结合部分、轻链和/或其抗原结合部分的重组表达载体引入至哺乳动物宿主细胞时，可通过培养宿主细胞一段时间来产生抗体，所述的时间足够使该抗体在宿主细胞中表达，或更优选地使该抗体分泌至宿主细胞生长的培养基。可使用标准蛋白质纯化方法从培养基回收抗体。植物宿主细胞包括如烟草、拟南芥、浮萍、玉米、小麦、马铃薯等。细菌宿主细胞包括大肠杆菌和链霉菌属种类。酵母宿主细胞包括粟酒裂殖酵母、酿酒酵母和甲醇酵母。而且，可使用许多已知的技术增强本发明抗体从产生细胞系中的表达(或来自其的其它部分)。例如，谷氨酰胺合成酶基因表达系统(GS系统)是用于在一定条件下改善表达的普通方法。该GS系统在欧洲专利No.0 216 846、0 256 055、0 338 841和0 323 997中全部或部分讨论。可能的是由不同细胞系表达或在转基因动物中表达的抗体将彼此具有不同的糖基化。然而，由在这里提供的核酸分子编码或包含在这里提供的氨基酸序列的所有抗体是本发明的一部分，无需考虑该抗体的糖基化作用。
转基因动物和植物本发明也提供包含一个或多个可用于产生本发明抗体的本发明核酸分子的转基因非人动物和转基因植物。抗体可在山羊、奶牛、马、猪、大鼠、小鼠、兔、仓鼠或其它哺乳动物的组织或体液，如奶、血或尿中产生和回收。参见，例如美国专利No.5,827,690、5,756,687、5,750,172和5,741,957。如上所述，可用MAdCAM或其部分免疫包含人免疫球蛋白基因座的非人转基因动物。用于在植物中产生抗体的方法在如美国专利6,046,037和5,959,177中描述，在这里通过引用作为参考。在另一个实施方案中，非人转基因动物和转基因植物可通过标准转基因技术将一个或多个本发明的核酸分子导入动物或植物中而产生。见Hogan，同上。用于生产转基因动物的转基因细胞可以是胚胎干细胞、体细胞或受精卵细胞。转基因非人生物体可以是嵌合、非嵌合的杂合子及非嵌合的纯合子。见，例如Hogan等，Manipulatingthe Mouse EmbryoA Laboratory Manual 2ed，Cold Spring HarborPress(1999)；Jackson等，Mouse Genetics and TransgenicsAPractical Approach，Oxford University Press(2000)；和Pinkert，Transgenic Animal TechnologyA Laboratory Handbook，AcademicPress(1999)。在另一个实施方案中，转基因非人生物体可具有编码目标重链和/或轻链的靶向断裂和替换。在一优选的实施方案中，转基因动物或植物包含并表达编码重链和轻链的核酸分子，所述的重链和轻链结合起来以特异性结合至MAdCAM，优选地结合至人MAdCAM。在另一个实施方案中，转基因动物或植物包含编码修饰的抗体如单链抗体、嵌合抗体或人源化抗体的核酸分子。抗-MAdCAM抗体可在任何转基因动物中生产。在一优选的实施方案中，非人动物是小鼠、大鼠、绵羊、猪、山羊、牛或马。非人转基因动物表达所述编码的多肽于血、奶、尿、唾液、眼泪、粘液和其它体液中。
噬菌体展示文库本发明提供用于产生抗-MAdCAM抗体或其抗原结合部分的方法，所述方法包括在噬菌体上合成人抗体文库，用MAdCAM或其部分筛选该库，分离结合MAdCAM的噬菌体，并从噬菌体上获得该抗体的步骤。一种制备抗体文库的方法包括步骤用MAdCAM或其抗原性部分免疫含有人免疫球蛋白基因座的非人宿主动物以产生免疫反应，从宿主动物中提取负责产生抗体的细胞；从提取的细胞中分离RNA，反转录该RNA以产生cDNA，使用引物扩增cDNA，并将cDNA插入至噬菌体展示载体以便抗体在噬菌体上表达。本发明的重组抗-MAdCAM抗体可用这种方法获得。除在这里公开的抗-MAdCAM抗体外，本发明的重组抗-MAdCAM人抗体可通过筛选重组组合抗体文库，优选scFv噬菌体展示文库而分离，所述的文库可使用由从人淋巴细胞分离的mRNA制备的人VL和VH cDNA制备。用于制备和筛选这种文库的方法是本领域已知的。用于产生噬菌体展示文库的试剂盒可从商业上获得(如，thePharmacia Recombinant Phage Antibody System，catalog no.27-9400-01；和the Stratagene SurfZAP phage display kit，catalog no.240612)。也存在可用于产生和筛选抗体展示文库的其它方法和试剂(见，例如U.S.Pat.No.5,223,409；PCT公开No.WO 92/18619；PCT公开No.WO 91/17271；PCT公开No.WO92/20791；PCT公开No.WO 92/15679；PCT公开No.WO 93/01288；PCT公开No.WO 92/01047；PCT公开No.WO 92/09690；Fuchs等，(1991)，Biotechnology，91369-1372；Hay等，Hum.Antibod.Hybridomas，381-85(1992)；Huse等，Science，2461275-1281(1989)；McCafferty等，Nature，348552-554(1990)；Griffiths等，EMBO J，12725-734(1993)；Hawkins等，J.Mol.Biol.，226889-896(1992)；Clackson等，Nature，352624-628(1991)；Gram等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，893576-3580(1992)；Garrad等，Biotechnology，91373-1377(1991)；Hoogenboom等，Nuc Acid Res，194133-4137(1991)；和Barbas等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，887978-7982(1991)。在一优选的实施方案中，为分离具有理想特征的人抗-MAdCAM抗体，使用在Hoogenboom等，PCT公开No.WO 93/06213中描述的表位印记方法，首先使用如这里描述的人抗-MAdCAM抗体来选择对MAdCAM具有相似结合活性的人重链和轻链序列。用于这种方法中的抗体文库优选地是如McCafferty等，PCT公开No. WO 92/01047，McCafferty等，Nature，348552-554(1990)；和Griffiths等，EMBO J，12725-734(1993)中描述制备和筛选的scFv文库。该scFv抗体文库优选地使用人MAdCAM作为抗原来筛选。一旦初始人VL和VH片段选择出后，进行“混合搭配”试验来选择优选的VL/VH对组合，在所述的“混合搭配”试验中筛选初始选择的VL和VH片段的不同对的MAdCAM结合。另外，为进一步提高抗体质量，使用类似在天然免疫反应过程中负责抗体亲和力成熟的体内体细胞突变过程的方法使优选的VL/VH对的VL和VH片段优选地在VH和/或VL的CDR3区内随机突变。这种体处亲和力成熟可通过使用分别与VH CDR3或VL CDR3互补的PCR引物扩增VH和VL区完成，该引物已经在某个位置“掺有”四种核苷酸碱基的随机混合物，这样所得的PCR产物编码VH和VL片段，随机突变已经引入VH和/或VL CDR3区。这些随机突变的VH和VL片段可根据与MAdCAM的结合再次筛选。从重组体免疫球蛋白展示文库中筛选和分离本发明的抗-MAdCAM抗体后，可从展示包(如从噬菌体基因组)回收编码选择的抗体的核酸并通过标准的重组DNA技术将其亚克隆至其它的表达载体中。如下所述，如果需要，可进一步操作该核酸以产生本发明的其它抗体形式。为表达通过筛选组合库分离的重组人抗体，如上所述，将编码抗体的DNA克隆至重组表达载体并导入哺乳动物宿主细胞中。
类转换本发明的另一方面是提供使抗-MAdCAM抗体的类与另一种类转换的机制。在本发明的一方面，编码VL或VH的核酸分子使用本领域熟知的方法分离，使它不包括任何编码CL或CH的核苷酸序列。随后将编码VL或VH的核酸分子有效地连接至编码来自不同类免疫球蛋白分子的CL或CH的核苷酸序列。如上所述，这可使用包含编码CL或CH的序列的载体或核酸分子完成。例如，最初是IgM的抗-MAdCAM抗体可类转换成IgG。而且，类转换可用于将一种IgG亚类转换成另一亚类，如由IgG4转换成IgG2。用于产生包含期望的同种型或抗体亚类的本发明抗体的优选方法包括步骤分离编码抗-MAdCAM抗体重链的核酸和编码抗-MAdCAM抗体轻链的核酸，获得重链的可变区，连接该重链可变区与期望的同种型的重链恒定区，在细胞中表达轻链和连接的重链，并收集具有期望的同种型的抗-MAdCAM抗体。
抗体衍生物使用本领域一般技术人员已知的技术和方法，可用上面描述的核酸分子来产生抗体衍生物。
人源化抗体使用人源化技术，可能采用使用合适文库的展示技术，可将非人抗体的免疫原性减少至某种程度。可以理解，鼠类抗体或来自其它物种的抗体可使用本领域熟知的技术人源化或灵长类化。见例如Winter和Harris，Immunol Today，1443-46(1993)及Wright等，Crit.Reviews in Immunol.，12125-168(1992)。目标抗体可通过重组DNA技术改造以用相应的人序列替换CH1、CH2、CH3、铰链区和/或框架区(见WO 92/02190和U.S.Patent No.5,530,101、5,585,089、5,693,761、5,693,792、5,714,350和5,777,085)。在另一个实施方案中，通过用相应的本发明抗-MAdCAM抗体的人序列替换CH1、铰链区、CH2、CH3和/或框架区使非人抗-MAdCAM抗体人源化。
突变的抗体在另一个实施方案中，核酸分子、载体和宿主细胞可用于产生突变的抗-MAdCAM抗体。抗体可在重链和/或轻链的可变区突变以改变抗体的结合特性。例如，在一个或多个CDR区产生突变以增加或减少抗体对MAdCAM的Kd。定点诱变中的技术是本领域熟知的。见例如Sambrook等，和Ausubel等，见上。在一优选的实施方案中，突变在较于种系在抗-MAdCAM抗体可变区中已知改变了的氨基酸残基处产生。在一更优选的实施方案中，一个或多个突变在较于种系在抗-MAdCAM抗体1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod或7.26.4-mod之一的可变区或CDR区中已知改变了的氨基酸残基处产生。在另一个实施方案中，一个或多个突变在较于种系在其氨基酸序列呈现于SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、52、54、56、58、62、64、66或68，或其核苷酸序列呈现于SEQ ID NO1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、51、53、55、57、61、63、65或67的可变区或CDR区中已知改变了的氨基酸残基处产生。在另一个实施方案中，核酸分子在一个或多个框架区中突变。突变可在框架区或恒定区中产生以增加抗-MAdCAM抗体的半衰期。见，例如于2000年2月24日公开的WO 00/09560，在这里通过引用作为参考。在一个实施方案中，可能有1、3或5或10个点突变并且不多于15个点突变。也可在框架区或恒定区中产生突变以改变抗体的免疫原性，提供共价或非共价地结合至另一个分子的位点，或改变某些性质如补体固定作用。在单一突变的抗体中，突变可在框架区、恒定区和可变区每一个中产生。备选地，在单一突变的抗体中，突变可以仅在框架区、可变区或恒定区之一中产生。在一个实施方案中，与突变前的抗-MAdCAM抗体相比，突变的抗-MAdCAM抗体的VH或VL区中存在不多于15个氨基酸改变。在一更优选的实施方案中，在突变的抗-MAdCAM抗体的VH或VL区中有不多于10个氨基酸改变，更优选不多于5个氨基酸改变，或甚至更优选不多于3个氨基酸改变。在另外的实施方案中，在恒定区中有不多于15个氨基酸改变，更优选不多于10个氨基酸改变，甚至更优选不多于5个氨基酸改变。
经修饰的抗体在另一个实施方案中，可产生包含连接至另一个多肽的全部或部分的抗-MAdCAM抗体的融合抗体或免疫粘合素。在一优选的实施方案中，仅抗-MAdCAM抗体的可变区连接至该多肽。在另一个优选的实施方案中，抗-MAdCAM抗体的VH域连接至第一个多肽，而抗-MAdCAM抗体的VL域连接至第二个多肽，所述的第二个多肽与第一个多肽以其中VH和VL区可彼此相互作用形成抗体结合位点的方式相关联。在另一个优选的实施方案中，VH区通过连接序列与VL区分开，使得VH和VL区可彼此相互作用(见下面的单链抗体章节)。随后将VH-连接序列-VL抗体连接至目标多肽。融合抗体可用于引导多肽至表达MAdCAM的细胞或组织。该多肽可以是治疗剂如毒素、生长因子或其它调节蛋白，或者可以是诊断剂如容易显现的酶如辣根过氧化物酶。而且，可产生其中两种(或多种)单链抗体彼此连接的融合抗体。如果需要在单个多肽链上产生二价或多价抗体，或如果希望产生双特异性抗体，则这是有用的。为产生单链抗体(scFv)，将编码VH-和VL的DNA片段有效地连接至另外的编码柔性连接序列如编码氨基酸序列(Gly4-Ser)3的片段上，这样该VH和VL序列可表达为连续的单链蛋白质，VH和VL区通过柔性连接序列连接(见，例如Bird等，Science，242423-426(1988)；Huston等，Proc.Natl.Acad Sci.USA，855879-5883(1988)；McCafferty等，Nature，348552-554(1990))。如果仅使用单一VH和VL，单链抗体是单价的，如果使用两个VH和VL，则为二价，或者如果使用多于两个的VH和VL，则是多价。在另一个实施方案中，其它修饰的抗体可使用编码抗-MAdCAM抗体的核酸分子制备。例如，“κ抗体”(Ill等，Protein Eng，10949-57(1997))、“微型抗体”(Martin等，EMBO J，135303-9(1994))、“双特异抗体”(Holliger等，PNAS USA，906444-6448(1993))或“Janusins”(Traunecker等，EMBO J，103655-3659(1991)和Traunecker等，“Janusinnew molecular design forbispecific reagents，”Int J Cancer Suppl，751-52(1992))可遵循本说明书教导使用标准分子生物学技术制备。在另一方面，可产生嵌合抗体和双特异性抗体。可产生包含来自不同抗体的CDR和框架区的嵌合抗体。在一优选的实施方案中，嵌合抗体的CDR包含人抗-MAdCAM抗体的轻链或重链可变区的所有CDR，而框架区源于一种或多种不同的抗体。在一更优选的实施方案中，嵌合抗体的CDR包含人抗-MAdCAM抗体的轻链和重链可变区的所有CDR。框架区可来自另一物种，并在一优选的实施方案中是经人源化的。备选地，框架区可来自另一种人抗体。可产生通过一个结合区域特异性结合至MAdCAM并通过另一个结合区域结合至第二个分子的双特异性抗体。双特异性抗体可通过重组分子生物学技术产生，或可物理地结合在一起。而且，可产生特异性结合至MAdCAM和另一个分子的含有多于一个VH和VL的单链抗体。这种双特异性抗体可使用熟知的技术产生，例如，关于(i)和(ii)，见例如Fanger等，Immunol Methods 472-81(1994)和Wright andHarris，同上，关于(iii)，见例如Traunecker等，Int.J.Cancer(Suppl.)751-52(1992)。在一个优选的实施方案中，双特异性抗体结合至MAdCAM并结合至另一种在内皮细胞上高水平表达的分子。在一个更优选的实施方案中，另一分子是VCAM、ICAM或L-选择蛋白。在不同的实施方案中，上面描述的修饰的抗体可使用来自选自1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod或7.26.4-mod的抗体之一的一个或多个可变区或一个或多个CDR区而制备。在另一个实施方案中，修饰的抗体使用一个或多个可变区或一个或多个CDR区而得以制备，所述可变区和CDR区的氨基酸序列表示于SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、52、54、56、58、62、64、66或68中，或其核苷酸序列表示于SEQ ID NO1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、51、53、55、57、61、63、65或67中。
衍生的和标记的抗体本发明的抗体或抗体部分可衍生或连接至另一种分子(如，另一种肽或蛋白质)。通常，抗体或其部分受到衍生，MAdCAM结合不受到衍生或标记的不利影响。因此，本发明的抗体和抗体部分有意包括在此描述的人抗-MAdCAM抗体的完整形式和修饰形式。例如，本发明的抗体或抗体部分可功能性连接(通过化学偶合、基因融合、非共价连接或其它方式)至一种或多种能介导抗体或抗体部分与其它分子(如抗生物素蛋白链菌素核心区或多组氨酸标记)关联的其它分子实体，例如另一种抗体(如双特异性抗体或双特异抗体)、检测剂、细胞毒性剂、药物制剂和/或蛋白质或肽。一种类型的衍生抗体可通过交联两种或多种抗体(相同类型或不同类型，如用以产生双特异性抗体)而产生。合适的交联剂包括那些具有两个由适当间隔区分开的不同反应性的基团的异双功能(如间-马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯)、或同双功能(如，二琥珀酰亚胺基辛二酸酯)的交联剂。这些交联剂可从PierceChemical Company，Rockford，Ill获得。另一种类型的衍生抗体是标记的抗体。可用于本发明抗体或抗体部分衍生的检测剂包括荧光化合物，其包括荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明、5-二甲胺-1-萘磺酰氯、藻红蛋白、稀土元素荧光体等。抗体也可用用于检测的酶标记，例如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等。当抗体用可检测的酶标记时，通过加入另外的该酶用来产生能辨别的反应产物的试剂而得以检测。例如，当存在辣根过氧化物酶试剂时，加入过氧化氢和二氨基联苯可产生能检测的有色反应产物。抗体也可用生物素标记，并通过间接测量抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素结合而检测。抗体可用磁性试剂如钆标记。抗体也可用由第二报道分子识别的预定的多肽表位(如亮氨酸拉链对序列、二抗的结合位点、金属结合区域、附加表位)标记。在一些实施方案中，标记由不同长度的间隔臂连接以减少可能的位阻。抗-MAdCAM抗体也可用放射性标记的氨基酸标记。放射性标记可用于诊断和治疗目的。例如，该放射性标记可用于通过x射线或其它诊断技术来检测表达MAdCAM的组织。而且，放射性标记可在治疗上用作用于患病的组织或表达MAdCAM的肿瘤的毒素。用于多肽的标记实例包括但不限于下面的放射性同位素或放射性核素--3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I。抗-MAdCAM抗体也可用化学基团如聚乙二醇(PEG)、甲基或乙基或碳水化合物基团衍生。这些基团可用于改善抗体的生物学特征，如提高血清半衰期或增强组织结合。该方法也可应用于抗-MAdCAM抗体的任何抗原结合片段或变体。
药物组合物和试剂盒在另外的方面，本发明提供含有抑制性人抗-MAdCAM抗体的组合物及用该组合物治疗受试者的方法。在一些实施方案中，治疗的受试者是人。在其它实施方案中，受试者是兽医受试者。在一些实施方案中，兽医受试者是狗或非人灵长类动物。治疗可包括将一种或多种本发明抑制性抗MAdCAM单克隆抗体或其抗原结合片段单独施用或与药用载体一起施用。本发明的抑制性抗-MAdCAM抗体和含有它们的组合物可与一种或多种其它治疗剂、诊断剂或预防剂联合施用。额外的治疗剂包括抗炎剂或免疫调节剂。这些试剂包括但不限于局部和口服的皮质激素如去氢氢化可的松、甲基去氢氢化可的松、NCX-1015或布地奈德；氨基水杨酸盐类如5-氨基水杨酸、偶氮水杨酸、巴柳氮或NCX-456；免疫调节剂类如硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤、甲氨蝶呤、环孢菌素、FK506、IL-10(伊洛白介素)、IL-11(奥普瑞白介素)、IL-12、MIF/CD74拮抗剂、CD40拮抗剂，例如TNX-100/5-D12、OX40L拮抗剂、GM-CSF、吡美莫司或雷怕霉素；抗TNFα剂类例如英夫利昔单抗、阿达木单抗、CDP-870、奥那西普、依那西普；抗炎剂类，例如PDE-4抑制剂(罗氟司特等)、TACE抑制剂(DPC-333、RDP-58等)和ICE抑制剂(VX-740等)以及IL-2受体拮抗剂如达珠单抗；选择性粘附分子拮抗剂类，例如那他珠单抗、MLN-02或alicaforsen；止痛剂类，例如但不限于，COX-2抑制剂如罗非考昔、伐地考昔、塞来考昔、P/Q-型电压灵敏通道(α2δ)调节剂，如加巴喷丁和普瑞巴林、NK-1受体拮抗剂、大麻素受体调节剂和δ阿片受体激动剂以及抗瘤剂、抗肿瘤剂、抗血管生成剂或化学治疗剂。这些额外的试剂可包含于相同的组合物中或分开施用。在一些实施方案中，本发明的一种或多种抑制性抗-MAdCAM抗体可作为疫苗或疫苗的佐剂使用。特别地，由于MAdCAM在淋巴组织中表达，通过将抗原与本发明抗-MAdCAM抗体结合能使疫苗抗原有利地靶向淋巴组织。如此处使用的，“可药用载体”指生理学上相容的任何和全部的溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收增强或延迟剂等。可药用载体的一些实例是水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、含有氯化钠的醋酸盐缓冲液、葡萄糖、甘油、聚乙二醇、乙醇等及其组合。在许多情况下，优选在组合物中包括等渗剂例如糖、多元醇如甘露醇、山梨糖醇或氯化钠。可药用物质的另外的实例是表面活性剂、湿润剂或小量的辅助物质如湿润或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，其能改善抗体的储存期或效果。本发明组合物可以是多种形式例如液体、半固体和固体剂型，如液体溶液(如可注射和可输注溶液)、分散剂或混悬剂、片剂、丸剂、冻干的饼剂、干粉剂、脂质体和栓剂。优选的形式取决于期望的施用模式和治疗应用。典型的优选组合物是以可注射或可输注溶液形式，例如类似那些用于人被动免疫的组合物。施用的优选方式是肠胃外施用(如静脉内、皮下、腹膜内、肌内、皮内施用)。在一个优选的实施方案中，抗体通过静脉内输注或注射施用。在另一个优选的实施方案中，抗体通过肌内、皮内或皮下注射施用。治疗组合物通常在制造和存储条件下必须是无菌和稳定的。组合物可配制成溶液、冻干的饼剂、干粉剂、微乳剂、分散剂、脂质体或其它适合高药物浓度的有序结构。无菌可注射溶液可通过将所需量的抗-MAdCAM抗体掺入合适的根据需要含有上面列举的成分的一种或其组合的溶剂中，随后通过灭菌来制备。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉剂的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，其能产生活性成分的粉末加上任何来自其先前无菌溶液的额外期望成分。通常，分散剂通过将活性化合物掺入无菌载体而制备，所述的载体含有基本的分散介质和所需的来自上面列举那些的其它成分。溶液的理想特性可例如通过使用表面活性剂维持，并且在分散剂的情况下，所需的微粒大小通过使用表面活性剂、磷脂和聚合体而得以维持。可注射组合物的延长吸收可通过将延迟吸收的试剂如单硬脂酸盐、聚合物材料、油和明胶包含于组合物来达到。虽然对于许多治疗应用，优选的施用途径/方式是皮下、肌内、皮内或静脉内输注，但本发明的抗体可通过本领域已知的多种方法施用。熟练的技术人员将理解，施用的途径和/或方式将取决于期望的结果而不同。在特定的实施方案中，抗体组合物可与能防止抗体迅速释放的载体制备，例如控制释放制剂，包括埋植剂、透皮贴剂和微囊化递药系统。可使用可生物降解的、生物相容性的聚合体，如乙烯-醋酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯类和聚乳酸。用于制备这种制剂的许多方法是授予了专利的或通常为本领域那些技术人员已知的。见如Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems(J.R.Robinson，ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York(1978))。在特定的实施方案中，本发明抗-MAdCAM抗体可经口服施用，例如使用惰性稀释剂或可吸收食用载体。化合物(根据需要，和其它成分)也可封装于硬壳或软壳明胶胶囊中、压制成片剂或直接掺入受试者的膳食中。对于口服治疗施用，抗-MAdCAM抗体可与赋形剂混合并以可摄入的片剂、口含片剂、锭剂、胶囊剂、酏剂、混悬剂、糖浆剂、糯米纸囊剂等形式使用。对于通过除肠胃外施用外的方式施用本发明化合物，可能有必要用防止化合物失活的材料包被该化合物或将其与该化合物同时施用。本发明组合物可以包括“治疗有效量”或“预防有效量”的本发明抗体或抗原结合部分。“治疗有效量”指以必需的剂量和持续时间段能有效地达到理想的治疗结果的量。抗体或抗体部分的治疗有效量可根据因素如个体的疾病状态、年龄、性别和体重，以及抗体或抗体部分在个体中引发理想的反应的能力而不同。治疗有效量也指抗体或抗体部分的治疗上有利的效应超过其任何毒性或有害作用的量。“预防有效量”指以必需的剂量和持续时间段能有效地获得理想的预防结果的量。通常，由于预防剂量是在先于疾病或在疾病早期的受试者中使用，所以预防有效量可能少于治疗有效量。可调节剂量方案以提供最优化的理想反应(如治疗或预防反应)。例如，可施用单一的快速推注剂、可随时间施用几个分份剂量或可按治疗情况所需指示的按比例地减少或增加剂量。特别有利的是将肠胃外组合物配制为剂量单位形式以易于剂量的施用及统一性。如此处使用的剂量单位形式指适于作为用于接受治疗的哺乳动物受试者的单元剂量的物理上分离单位；每个单位含有与所需的药物载体结合的预确定量的经计算可以产生理想治疗效果的活性化合物。本发明的剂量单位形式的规格由(a)抗-MAdCAM抗体或其部分的独特特征和要获得的特定治疗或预防效果，和(b)在配制这种抗体用于治疗个体中敏感性的本领域中的内在限制而规定并直接取决它们。本发明抗体或抗体部分的治疗或预防有效量的示范性非限制范围是0.025-50mg/kg，更优选地是0.1-50mg/kg，更优选地是0.1-25、0.1-10或0.1-3mg/kg。在一些实施方案中，制剂含有在20mM 醋酸钠，pH 5.5，140 mM NaCl和0.2mg/mL聚山梨酯80的缓冲液中的5mg/mL抗体。需要注意的是剂量值可随需减缓的疾病的类型和严重性而改变。应该一步理解，对于任何特定的受试者，需根据个体需求和施用或指导施用组合物的人的专业判断来随时间而调整特定的给药方案，并且于此列出的剂量范围仅作为范例而不用意于限制所要求保护的组合物的范围或实践。本发明的另一方面提供包含本发明抗-MAdCAM抗体或抗体部分或含有这种抗体的组合物的试剂盒。除了抗体或组合物，试剂盒还可包括诊断剂或治疗剂。试剂盒也可包括用于诊断或治疗方法中的使用说明书。在一个优选的实施方案中，试剂盒包括抗体或含有该抗体的组合物和可用于下面描述的方法的诊断剂。在另一个优选的实施方案中，试剂盒包括抗体或含有该抗体的组合物和一种或多种可用于下面描述的方法的治疗剂。
基因疗法本发明的核酸分子可通过基因疗法施用给需要它的患者。该疗法可以是体内或离体的。在一个优选的实施方案中，可将编码重链和轻链两者的核酸分子施用给患者。在一更优选的实施方案中，施用该核酸分子使得它们稳定地整合入B细胞的染色体，因为这些细胞专用于生产抗体。在一优选的实施方案中，将前体B细胞离体转染或感染并再移植入需要它的患者。在另一个实施方案中，使用已知能感染目标细胞类型的重组病毒在体内感染前体B细胞或其它细胞。用于基因疗法的典型载体包括脂质体、质粒和病毒载体。示范性病毒载体是逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒。体内或离体感染后，抗体表达水平可通过从受治疗的患者中取样并使用本领域已知或于此讨论的任何免疫测定法监测。在一优选的实施方案中，基因治疗方法包括步骤施用分离的编码抗-MAdCAM抗体重链或其抗原结合部分的核酸分子并表达该核酸分子。在另一个实施方案中，基因治疗方法包括步骤施用分离的编码抗-MAdCAM抗体轻链或其抗原结合部分的核酸分子并表达该核酸分子。在一个更优选的方法中，基因治疗方法包括步骤施用分离的编码本发明抗-MAdCAM抗体重链或其抗原结合部分的核酸分子和分离的编码本发明抗-MAdCAM抗体轻链或其抗原结合部分的核酸分子，并表达所述核酸分子。基因治疗方法还可包括施用另一种抗炎剂或免疫调节剂的步骤。
诊断性使用方法抗-MAdCAM抗体可用于在体外生物样品中或在体内检测MAdCAM。抗-MAdCAM抗体可用于常规免疫测定法中，包括但不限于，ELISA、RIA、FACS、组织免疫组织化学法、蛋白质印迹法或免疫沉淀法。本发明抗-MAdCAM抗体可用于检测人的MAdCAM。在另一个实施方案中，抗-MAdCAM抗体可用于检测旧大陆灵长类如短尾猴和猕猴、猩猩和猿的MAdCAM。本发明提供用于检测生物样品中MAdCAM的方法，包括将生物样品与本发明抗-MAdCAM抗体接触并检测结合至MAdCAM的抗体。在一个实施方案中，抗-MAdCAM抗体用可检测标记直接衍生。在另一个实施方案中，抗-MAdCAM抗体(一抗)是未标记的并且能结合抗-MAdCAM抗体的二抗或其它分子是经标记的。如本领域技术人员熟知的，选择能特异性地结合特定物种和类别的一抗的二抗。例如，如果抗-MAdCAM抗体是人IgG，则二抗可以是抗-人-IgG。能结合抗体的其它分子包括但不限于，A蛋白和G蛋白，两者都可商业获得，如从Pierce Chemical公司获得。抗体或二抗的合适标记已经在上文公开，并包括多种酶、辅基、荧光材料、发光材料、磁性剂和放射性物质。合适的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的实例包括抗生物素蛋白链菌素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适的荧光材料的实例包括7-羟基香豆素、荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料的实例包括鲁米诺；磁性剂的实例包括钆；并且合适的放射性物质的实例包括125I、131I、35S或3H。在一备选的实施方案中，使用用可检测物质标记的MAdCAM标准和未标记的抗-MAdCAM抗体，通过竞争免疫检测法可在生物样品中检测MAdCAM。在该测定法中，将生物样品、标记的MAdCAM标准和抗-MAdCAM抗体混合并测定结合至未标记抗体的标记的MAdCAM标准的量。生物样品中MAdCAM的量与结合至抗-MAdCAM抗体的标记的MAdCAM标准的量成反比。可为许多目的使用上面公开的免疫测定法。在一个实施方案中，抗-MAdCAM抗体可用于检测细胞培养中的细胞中的MAdCAM。在一个优选的实施方案中，抗-MAdCAM抗体可用于测定在用多种化合物处理细胞后细胞表面MAdCAM表达的水平。这种方法可用于检验可用于活化或抑制MAdCAM的化合物。在该方法中，将一细胞样品用试验化合物处理一段时间而让另一样品未经处理，随后可通过流式细胞计量术、免疫组织化学法、蛋白质印迹法、ELISA或RIA测定细胞表面表达。而且，可扩大免疫测定法的规模用于高通量筛选以便检测大量化合物对MAdCAM的活化或抑制。本发明抗-MAdCAM抗体也可用于测定组织上的或源于组织的细胞中的MAdCAM水平。在一优选的实施方案中，该组织是患病的组织。在一更优选的实施方案中，该组织是发炎的胃肠道或其活组织检查样本。在一个优选的方法实施方案中，将组织或其活组织检查样本从患者切取。随后将该组织或活组织检查样本用于免疫测定法以通过上述方法检测例如MAdCAM水平、细胞表面的MAdCAM水平或MAdCAM的定位。该方法可用于测定发炎的组织是否高水平表达MAdCAM。上述的诊断方法可用于测定组织是否表达高水平的MAdCAM，高水平的MAdCAM表达可以预示组织会对用抗-MAdCAM抗体治疗反应很好。而且，该诊断方法也可用于测定用抗-MAdCAM抗体治疗(见下)是否引起组织表达较低水平的MAdCAM并因此可用于确定治疗是否成功。本发明抗体也可用于体内定位表达MAdCAM的组织和器官。在一优选的实施方案中，抗-MAdCAM抗体可用于定位发炎的组织。本发明抗-MAdCAM抗体的优势是它们不会在施用后产生免疫反应。该方法包括步骤施用抗-MAdCAM抗体或其药物组合物给需要这种诊断试验的患者并让患者接受成像分析以确定表达MAdCAM的组织的定位。成像分析是医学领域熟知的，并包括但不限于，x射线分析、γ闪烁扫描、磁共振显像(MRI)、正电子发射断层扫描或计算机断层摄影(CT)。在该方法的另一个实施方案中，从患者获得活组织检查样本以测定目标组织是否表达MAdCAM而不让患者接受成像分析。在一个优选的实施方案中，抗-MAdCAM抗体可用能在患者中显像的可检测试剂标记。例如，抗体可用能用于x射线分析的对比剂如钡，或可用于MRI或CT的磁性对比剂如钆螯合物标记。其它标记试剂包括但不限于，放射性同位素如99Tc。在另一个实施方案中，抗-MAdCAM抗体是未标记的并可通过施用可检测的并能结合抗-MAdCAM抗体的二抗或其它分子而显像。本发明抗-MAdCAM抗体也可用于测定存在于供体的血、血清、血浆或其它生物液体包括但不限于粪便、尿、痰或活组织检查样本中的可溶性MAdCAM的水平。在一优选的实施方案中，生物液体是血浆。随后将该生物液体用于免疫测定法以测定可溶性MAdCAM的水平。可溶性MAdCAM可以成为正发生的肠胃炎症的替代标记并且测定方法可用作诊断标记来衡量疾病严重性。上述的诊断方法可用于测定个体是否表达高水平的可溶性MAdCAM，高水平的可溶性MAdCAM表达可表明个体会对用抗-MAdCAM抗体治疗做出好的反应。而且，诊断方法也可用于测定用抗-MAdCAM抗体(见下)或该疾病的其它药剂治疗是否引起个体表达较低水平的MAdCAM并因此可用于确定治疗是否成功。
抗-MAdCAM抗体对α4β7/MAdCAM-依赖性粘附的抑制在另一个实施方案中，本发明提供结合MAdCAM并抑制带有α4β7整连蛋白的细胞与MAdCAM的结合和粘附或其它关连配体如L-选择蛋白与MAdCAM的结合和粘附的抗-MAdCAM抗体。在一个优选的实施方案中，MAdCAM是人MAdCAM，并是可溶的形式或在细胞表面上表达。在另一个优选的实施方案中，抗-MAdCAM抗体是人抗体。在另一个实施方案中，抗体或其部分以不大于50nM的IC50值抑制α4β7和MAdCAM之间的结合。在一优选的实施方案中，IC50值不大于5nM。在一更优选的实施方案中，IC50值小于5nM。在一更优选的实施方案中，IC50值小于0.05μg/mL、0.04μg/mL或0.03μg/mL。在另一个优选的实施方案中，IC50值小于0.5μg/mL、0.4μg/mL或0.3μg/mL。IC50值可通过本领域已知的任何方法测定。通常，IC50值可通过ELISA或粘附测定法测量。在一优选的实施方案中，使用天然表达MAdCAM的细胞或组织或者已经经改造而表达MAdCAM的细胞或组织，通过粘附测定法测量IC50值。
抗-MAdCAM抗体对淋巴细胞募集至消化道相关的淋巴组织的抑制在另一个实施方案中，本发明提供结合天然表达的MAdCAM并抑制淋巴细胞结合至专门的胃肠道淋巴组织的抗-MAdCAM抗体。在一优选的实施方案中，天然表达的MAdCAM是人或灵长类MAdCAM并是可溶的形式或在细胞表面上表达。在另一个优选的实施方案中，抗-MAdCAM抗体是人抗体。在另一个实施方案中，抗体或其部分以不大于5mg/kg的IC50值抑制肠滋养型α4β7+淋巴细胞募集至表达MAdCAM的组织。在一优选的实施方案中，IC50值不大于1mg/kg。在一更优选的实施方案中，IC50值小于0.1mg/kg。在一个实施方案中，使用γ闪烁扫描或单光子发射电子计算机断层扫描，通过测量锝标记的外周血淋巴细胞募集至胃肠道的量效关系来测定IC50值。在另一个实施方案中，IC50值可使用流式细胞计量术，通过测量外周循环中肠滋养型α4β7+淋巴细胞例如但不限于CD4+α4β7+记忆T-细胞的增加作为抗-MAdCAM抗体的剂量的函数而测定。为了使本发明更容易理解，列出下面的实施例。这些实施例仅用于说明目的而不能理解为以任何方式限制本发明的范围。
实施例1产生抗-MAdCAM抗体的杂交瘤的生成根据本实施例制备、测定和选择本发明的抗体。
主要免疫原制备制备两种免疫原用于XenoMouseTM小鼠的免疫接种(i)MAdCAM-IgG1Fc融合蛋白和(ii)从用MAdCAM稳定转染的细胞制备的细胞膜。
(i)MAdCAM-IgG1Fc融合蛋白表达载体构建将编码MAdCAM的成熟胞外免疫球蛋白样结构域的EcoRI/BglII cDNA片段从pINCY Incyte克隆(3279276)上切取并将其克隆进pIG1载体的EcoRI/BamHI位点(Simmons，D.L.(1993)Cellular Interactions in DevelopmentA Practical Approach，ed.Hartley，D.A.(Oxford Univ.Press，Oxford)，pp.93-127.)来产生符合读框的IgG1Fc融合。将得到的插入序列用EcoRI/NotI切取并克隆进pCDNA3.1+(Invitrogen)中。将载体中的MAdCAM-IgG1FccDNA测序确认。MAdCAM-IgG1Fc融合蛋白的氨基酸序列显示如下MAdCAM-IgG1Fc融合蛋白
MDFGLALLLAGLLGLLLGQSLQVKPLQVEPPEPVVAVALGASRQLTCRLACADRGASVQWRGLDTSLGAVQSDTGRSVLTVRNASLSAAGTRVCVGSCGGRTFQHTVQLLVYAFPDQLTVSPAALVPGDPEVACTAHKVTPVDPNALSFSLLVGGQELEGAQALGPEVQEEEEEPQGDEDVLFRVTERWRLPPLGTPVPPALYCQATMRLPGLELSHRQAIPVLHSPTSPEPPDTTSPESPDTTSPESPDTTSQEPPDTTSQEPPDTTSQEPPDTTSPEPPDKTSPEPAPQQGSTHTPRSPGSTRTRRPEIQPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKATPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQID NO107)下划线信号肽粗体字MAdCAM胞外结构域重组蛋白表达/纯化将CHO-DHFR细胞用含有MAdCAM-IgG1Fc融合蛋白 cDHA的pCDNA3.1+载体转染并在含有600μg/mL G418和100ng/mL甲氨蝶呤的Iscove’s培养基中选择表达MAdCAM-IgG1Fc融合蛋白的稳定克隆。对于蛋白质表达，在中空纤维生物反应器中接种在含有10％低IgG胎牛血清(Gibco)、非必需氨基酸(Gibco)、2mM谷氨酰胺(Gibco)、丙酮酸钠(Gibco)、100μg/mL G418和100ng/mL甲氨蝶呤的Iscove’s培养基中的稳定表达MAdCAM-IgG1Fc的CHO细胞，并用于产生浓缩的培养基上清液。通过亲和色谱从采集的上清液纯化MAdCAM-IgG1Fc融合蛋白。简要地说，将上清液施加于HiTrap G蛋白琼脂糖(5mL，Pharmacia)柱上(2mL/min)，用25mM Tris pH 8、150mM NaCl(5柱体积)洗涤并用100mM甘氨酸pH 2.5(1mL/分钟)洗脱，立刻用1M Tris pH 8中和级分至pH 7.5。将含有MAdCAM-IgG1Fc融合蛋白的级分通过SDS-PAGE鉴定，混合在一起并施加于聚丙烯酰胺葡聚糖S100柱(Pharmacia)上，用35mM BisTris pH 6.5、150mM NaCl预平衡。以0.35mL/分钟进行凝胶过滤，在约3×5mL级分中收集MAdCAM-IgG1Fc融合蛋白峰。混合这些样品并施加于Resource Q(6mL，Pharmacia)柱上，在35mM BisTris pH 6.5中预平衡。用5柱体积35mM Bis Tris pH 6.5、150mM NaCl(6mL/分钟)洗涤该柱并用35mM Bis Tris pH 6.5、400mM NaCl洗脱MAdCAM-IgG1Fc融合蛋白到4-6mL级分中。在此阶段，该蛋白为90％纯并通过SDS-PAGE作为约68kD的单一条带迁移。为了用作免疫原和用于全部后续的测定，将材料缓冲液更换为25mM HEPES pH 7.5、1mM EDTA、1mM DTT、100mM NaCl、50％甘油并在-80℃下以等分样品储存。
(ii)稳定表达MAdCAM的细胞膜将包含公开了的MAdCAM序列(Shyjan AM等，J Immunol.，156，2851-7(1996))的核苷酸645-1222的SacI/NotI片段从结肠cDNA文库PCR扩增并将其克隆进pIND-Hygro载体(Invitrogen)的SacI/NotI位点。将包含额外的5’编码序列的SacI片段从pCDNA3.1 MAdCAM-IgG1Fc亚克隆入该构建体中以产生全长MAdCAMcDNA。然后将含有MAdCAM cDNA的KpnI/NotI片段克隆进pEF5FRTV5GWCAT载体(Invitrogen)中的相应位点并替代CAT编码序列。将cDNA插入序列通过测序验证并根据厂商技术说明书通过Flp重组酶技术将其用于转染而在FlpIn NIH 3T3细胞(Invitrogen)中产生单个稳定表达的克隆。通过它们支持α4β7+JY人B类淋巴母细胞系结合的能力(Chan BM等，J. Biol.Chem.，2678366-70(1992))选择稳定表达的克隆，这在下面概述。使用FlpIn CHO细胞(Invitrogen)，以相同的方式制备表达MAdCAM的CHO细胞的稳定克隆。将表达MAdCAM的FlpIn NIH-3T3细胞在含有2mM L-谷氨酰胺、10％供体小牛血清(Gibco)和200μg/mL潮霉素B(Invitrogen)的Dulbecco’s改良Eagles培养基(Gibco)中生长，并在转瓶中扩充。将表达MAdCAM的FlpIn CHO细胞在含有2mM L-谷氨酰胺、10％供体小牛血清(Gibco)和350μg/mL潮霉素B(Invitrogen)的Ham’s F12/Dulbecco’s改良Eagles培养基(Gibco)中生长，并在转瓶中扩充。细胞收获使用非酶细胞解离溶液(Sigma)并刮取，在磷酸盐缓冲盐水中洗涤并通过离心。通过两轮在25mM BisTris pH8、10mM MgCl2、0.015％(w/v)抑肽酶、100U/mL杆菌肽中polytron匀浆并离心从细胞沉淀颗粒制备细胞膜。将最后的沉淀颗粒重悬在相同缓冲液中，将50×106细胞等同物等分加入至厚壁eppendorf中并以＞100,000g旋转而产生用于XenoMouse小鼠免疫的细胞膜沉淀颗粒。倾析上清液并将细胞膜在-80℃下储存在eppendorf中直到需要使用。通过SDS-PAGE和使用对抗MAdCAM的N-端残基([C]-KPLQVEPPEP)而产生的家兔抗-肽抗体的蛋白质印迹法证实蛋白在细胞膜中的表达。
免疫接种和杂交瘤产生将八到十周大的XENOMOUSETM小鼠用纯化的重组MAdCAM-IgG1Fc融合蛋白(10μg/剂量/小鼠)或从稳定表达MAdCAM的CHO或NIH 3T3细胞(10×106细胞/剂量/小鼠)制备的细胞膜经腹膜内或在它们的后足垫中免疫。在三到八周内将该剂量重复五到七次。在融合前4天，小鼠接受PBS中的人MAdCAM胞外结构域的最后注射。将来自经免疫的小鼠的脾脏和淋巴结淋巴细胞与非分泌性骨髓瘤P3-X63-Ag8.653细胞系融合并如先前描述的(Galfre和Milstein，Methods Enzymol.733-46(1981))将其接受HAT选择。回收一系列全部分泌MAdCAM特异性人IgG2κ和IgG4κ抗体的杂交瘤并对其进行亚克隆。将产生MAdCAM特异性单克隆抗体的十二个杂交瘤亚克隆即1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4和9.8.2回收并用下面描述的测定法检测。衍生亚克隆杂交瘤系1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4和9.8.2的亲本系1.7、1.8、6.14、6.22、6.34、6.67、6.73、6.77、7.16、7.20、7.26和9.8全部具有抗MAdCAM活性。
ELISA测定法使用MAdCAM-IgG1Fc融合蛋白捕获抗体通过如描述过的(Coligan等，Unit 2.1“Enzyme-linked immunosorbent assays，”in Current protocolsIinImmunology(1994))ELISA测定来检测小鼠血清和杂交瘤上清液中的抗原特异性抗体。对于用MAdCAM-IgG1Fc融合蛋白免疫的动物，通过流式细胞仪根据对抗人IgG1的非特异性反应性和结合至FlpIn CHO MAdCAM细胞的能力筛选抗体。在优选的ELISA测定中，使用下列技术在含缓冲液(100mM碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液，pH 9.6)的板中以100μL/孔的MAdCAM-IgG1Fc融合蛋白(4.5μg/mL)在4℃下包被ELISA板过夜。温育后，除去包被缓冲液并用200μL/孔封闭缓冲液(5％BSA、0.1％Tween 20、磷酸盐缓冲盐水)封闭该板并在室温下温育1小时。移除封闭缓冲液并在室温下加入50μL/孔的杂交瘤上清液或其它血清或上清液(例如，阳性对照)2小时。温育后，将该板用PBS(3×100μL/孔)洗涤并用稀释于PBS的HRP-结合的二抗(即1∶1000的对抗IgG2抗体的小鼠抗人IgG2-HRP(SB Cat.No.9060-05)或1∶1000的对抗IgG4抗体的小鼠抗人IgG4-HRP(Zymed Cat.No.3840))检测杂交瘤mAb的结合。将该板在室温下温育1小时，在PBS(3×100μL/孔)中洗涤并用100μL OPD(邻苯二胺(DAKO S2405)+5μL 30％H2O2/12mL)显色。将该板显色10-20分钟，用100μL 2MH2SO4终止反应。在490nm读板。
粘附测定通过ELISA证明结合至MAdCAM-IgG1 Fc融合蛋白的抗体，用α4β7+JY细胞和(i)MAdCAM-IgG1Fc融合蛋白或(ii)MAdCAM-CHO细胞在粘附测定中评估拮抗活性。
(i)MAdCAM-IgG1Fc融合蛋白测定将100μL 4.5μg/mL的在Dulbecco’s PBS中纯化的MAdCAM-IgG1Fc融合蛋白溶液吸附至96孔黑色Microfluor“B”U型底(Dynex #7805)板，4℃过夜。然后将用MAdCAM包被的板倒置并吸去过量的液体，之后，在10％BSA/PBS中于37℃封闭至少1小时。在此期间，培养的JY细胞用台盼蓝排阻法计数(应该为约8×105细胞/mL)并以20×106细胞/检测板吸移进50mL离心管中。将JY细胞在含有2mM L-谷氨酰胺和10％热灭活胎牛血清(Life Technologies#10108-165)的RPMI1640培养基(Gibco)中培养，并每2-3天以1-2×105/mL接种以防止培养物分化。通过离心(240g)用含有2mM L-谷氨酰胺(Gibco)的RPMI 1640培养基(Gibco)洗涤细胞两次，以2×106细胞/mL将最终的细胞沉淀颗粒重悬于RPMI 1640中用于钙黄绿素AM负荷。将1∶200稀释于DMSO中(约终浓度15μg)的钙黄绿素AM(Molecular Probes #C-3099)加至细胞，并在温育的过程(37℃下30分钟)避光保护。在该细胞温育步骤期间，将试验的抗体如下稀释对于单剂量试验，在0.1mg/mL PBS中的BSA(Sigma#A3059)中将抗体补足至3μg/mL(1μg/mL终浓度)；对于整个IC50曲线，将该抗体稀释于0.1mg/mL BSA/PBS，以3μg/mL(1μg/mL终浓度)为最高浓度，然后跨板加倍稀释(1∶2比例)。行的最后的孔用于检测总结合，所以使用0.1mg/ml PBS中的BSA。封闭后，将板的内容物弹去并将50μL抗体/对照加入至每孔中，并将该板于37℃下温育20分钟。在此期间，载有钙黄绿素的JY细胞通过离心用含有10％胎牛血清的RPMI 1640培养基洗涤一次并用1mg/mL BSA/PBS洗涤一次，在1mg/mL BSA/PBS中重悬最终的细胞沉淀至1×106/mL。将100μL细胞加至U形底的平板的每孔中，密封该板，简单离心(以1000rpm离心2分钟)并然后将该板在37℃下温育45分钟。该时期最后，将该板用Skatron洗板机洗涤并用Wallac Victor21420多标记读取仪测量荧光(激发λ485nm，发射λ535nm，从板的顶端、离板底8mm计数，以正常的发射口径持续0.1秒)。对于每种抗体浓度，百分比粘附表示为缺乏任何抗体的最大荧光反应减去与非特异性结合相关的荧光的百分数。IC50值定义为在该浓度下粘附反应降低至不存在抗-MAdCAM抗体时反应的50％的抗-MAdCAM抗体的浓度。能以IC50值＜0.1μg/mL抑制JY细胞结合至MAdCAM-IgG1Fc融合蛋白的抗体可认为是具有有效拮抗活性并将其进一步进行MAdCAM-CHO粘附测定。所有十二种试验的抗体均显示出有效的拮抗活性(表3)。单克隆抗体1.7.2、1.8.2、7.16.6、7.20.5和7.26.4源于IgG2κ谱系，而单克隆抗体6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1和9.8.2源于IgG4κ谱系。
(ii)MAdCAM-CHO细胞粘附测定如上培养培养JY细胞。表达MAdCAM的CHO细胞用pEF5FRT MAdCAM cDNA构建体和使用如上描述的Flp重组酶技术(Invitrogen)产生。表达MAdCAM的CHO细胞的单个稳定的克隆基于它们支持JY细胞粘附以及支持家兔抗-肽抗体的结合的能力得以选择，其中所述的家兔抗-肽抗体通过对抗MADCAM的N-末端产生并在上面描述，其结合通过流式细胞仪测定。将表达MAdCAM的CHO细胞在含2mM L-谷氨酰胺、10％胎牛血清(Gibco)和350μg/mL潮霉素B(Invitrogen)的DMEM/F12培养基(Gibco#21331-020)中培养，每2/3天将其以1∶5比例分盘。对于粘附测定，将表达MAdCAM的CHO细胞在200μL培养基中以4×104细胞/每孔接种于96孔黑色板-透明底部(Costar#3904)并在37℃/5％CO2条件下温育过夜。随后一天，将杂交瘤上清液或经纯化的单克隆抗体按上面描述的，从30μg/mL(等同于10μg/mL终浓度)起始浓度在1mg/mLBSA/PBS中稀释。对于MAdCAM CHO板，弹出该板的内容物并将50μL抗体/对照加入至每孔中，在37℃下温育板20分钟。行的最后孔用于测定总结合量，所以使用0.1mg/mL的PBS中的BSA。如上制备载有钙黄绿素AM的JY细胞，在1mg/mL BSA/PBS中达到1×106/mL的终浓度，然后在与抗体的20分钟温育期后加入100μL至平板中。然后将该板在37℃温育45分钟，随后在Tecan洗板机(PW 384)上洗涤并如上描述使用Wallac平板读取器测量荧光。对于每种抗体浓度，将百分比粘附表示为在不存在任何抗体时的最大荧光反应减去与非特异性结合相关的荧光的百分数。能以IC50值＜1μg/mL抑制JY细胞结合至MAdCAM CHO细胞的抗体可认为是具有有效拮抗剂活性。如前，将IC50值定义为在该浓度下粘附反应已经下降至不存在抗-MAdCAM抗体时的反应的50％的抗-MAdCAM抗体浓度。在该测定中1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4和9.8.2的IC50效力在下表3中描述。
表3.示例性抗-MAdCAM抗体的IC50值为了在切应力条件下，在基于流动的测定法(flow-based assay)中测量抗-MAdCAM mAb的拮抗剂效力，其中所述的切应力条件是设计用来模拟在供给肠相关淋巴组织的高内皮小静脉上的微血管环境，将表达MAdCAM的CHO细胞在玻璃显微镜玻片(50×4mm)上铺板并让其附着形成汇合单层(大约2.5×105细胞)。然后将该细胞与一系列浓度(0.1-10μg/mL)的经亲和纯化的mAb在连接至流动测定系统前于37℃下温育20分钟。将同种型匹配IgG2或IgG4mAb(10μg/mL)用作阴性对照。在0.05Pa的恒定切应力下将正常供体外周血淋巴细胞(PBL)灌输到细胞单层之上。摄录试验并计算淋巴细胞的总粘附(滚动+牢固粘附)。在所描述的条件下所有试验的单克隆抗体显示为有效的拮抗剂。
(iii)Stamper-Woodruff测定法为了显现MAdCAM+脉管，根据厂商的说明书，在磷酸盐缓冲盐水中用20摩尔过量的生物素-NHS(Pierce)在1-2mg经亲和纯化的蛋白上产生生物素化的抗-MAdCAM mAb。使该反应于室温下静置(30分钟)，并用PD-10(Pharmacia)柱脱盐并测定蛋白的浓度。将正常肝脏淋巴结从供体器官移出，在液氮中急骤冷冻并在-70℃下储存直到使用。切取10μm冷冻切片，在聚-L赖氨酸包被的载玻片上风干，并在测定前在丙酮中固定。用抗生物素蛋白-生物素封闭体系(DAKO)封闭切片，然后在室温下与一系列浓度(1-50μg/mL)的生物素化的抗MAdCAM mAb温育(2小时)。将同种型匹配的IgG2或IgG4mAb(50μg/mL)用作阴性对照并将封闭性的抗-β7抗体(50μg/mL)作为阳性对照。将取自正常供体的外周血淋巴细胞用小鼠抗-人CD2mAb(DAKO)标记以使得能随后显现粘附细胞。将5×105PBL加至每个淋巴结切片并温育30分钟，随后轻轻漂洗以避免粘附细胞脱落。然后在丙酮中再固定切片，并用生物素化抗MAdCAM mAb(10μg/mL)再温育，随后用生物素化山羊-抗-小鼠mAb再温育(用以识别CD2标记的PBL和未染色的MAdCAM+脉管)并然后用streptABcomplex/HRP(DAKO)再温育。最后通过加入DAB底物(DAKO)至切片显现MAdCAM+脉管和CD2标记的PBL，褐色的反应产物显示阳性染色的区域。通过计数粘附至肝门束、静脉或窦状隙的50个MAdCAM-1+脉管的淋巴细胞的数目来定量淋巴细胞粘附。然后用不存在任何抗体时PBL粘附取为100％，将表示为平均值的数据标准化为百分比粘附。基于n＝3个不同PBL供体并对于不同肝脏淋巴结供体编辑数据。与封闭性抗-β7抗体对照相比较的生物素化的纯化单克隆抗体1.7.2和7.16.6的代表性数据在图4中描述。
选择性测定VCAM和纤连蛋白与MAdCAM结构相近并序列同源。通过测定它们阻断α4β1+/α5β1+Jurkat T-细胞(ATCC)结合至它们关连的细胞粘附分子的能力评估亲和纯化的抗MAdCAM mAb的MAdCAM-特异性。将100μL 4.5μg/mL在Dulbecco’s PBS中的纤连蛋白细胞结合片段(110Kd，Europa Bioproducts有限公司，Cat.No.UBF4215-18)或VCAM(Panvera)的溶液吸附至96孔黑色Microfluor“B”U形-底部(Dynex #7805)平板，4℃过夜。然后倒置该包被的平板并吸去过量的液体，之后，在10％BSA/PBS中37℃下封闭至少1小时。在此期间，培育的Jurkat T细胞用台盼蓝排除法计数并如先前描述用于上面的JY细胞的方法用钙黄绿素AM染料负荷。将用于试验的抗体在0.1mg/ml PBS中的BSA中从10μg/mL最高浓度稀释。将行的最后孔用于测定总结合量，所以使用0.1mg/ml PBS中的BSA。将在PBS中制备的锯鳞血抑肽(Bachem，Cat.No.H-9010)以100nM的最高浓度用于封闭α5β1/纤连蛋白相互作用。将抗-CD106 mAb(克隆51-10C9，BDPharmingen Cat.No.555645)以1μg/mL的最高浓度用于封闭α4β1/VCAM相互作用。封闭后，将平板的内容物弹去并将50μL的抗体/对照加至每孔中并将平板在37℃下温育20分钟。将载有钙黄绿素的JurkatT细胞跟前面一样洗涤一次，将最终的细胞沉淀颗粒在1mg/mLBSA/PBS中重悬至1×106/mL。将100μL细胞加至U形底的平板的每孔中，密封该板，简单离心(1000rpm离心2分钟)并将该板于37℃温育45分钟。在该阶段末，用Skatron洗板机洗涤该板，并用WallacVictor21420多标记读取仪测量荧光(激发λ485nm，发射λ535nm，从板的顶端、离板底8mm计数，用正常的发射口径持续0.1秒)。对每个抗体，抑制程度如下在表4中图示(-可忽略的粘附抑制，***粘附的完全抑制)。所有示例的mAb都为有效的和选择性抗-MAdCAM拮抗剂，表现出对MAdCAM的选择性大大超过对VCAM和纤连蛋白的选择性大于100倍。
表4.抗-MAdCAM抗体对MAdCAM相对于其它细胞粘附分子纤连蛋白和VCAM的对比选择性杂交瘤于2003年9月9日存放于欧洲细胞培养保藏中心(ECACC)，H.P.A at CAMR，Porton Down，Salisbury，WiltshireSP4 0JG，具有以下保藏号杂交瘤 保藏No.
1.7.2 030909011.8.2 030909026.14.2 030909036.22.2 030909046.34.2 030909056.67.1 030909066.73.2 030909076.77.1 030909087.16.6 030909097.20.5 030909107.26.4 030909119.8.2 03090912
实施例II通过BIAcore测定完全人的抗-MAdCAM单克隆抗体的亲和常数我们使用BIAcore 3000仪器按厂商提供的方案通过表面等离子共振进行纯化抗体的亲和性测量。
方案1为了进行动态分析，使用常规的胺偶合在CM5BIAcore传感芯片上制备高密度的小鼠抗-人(IgG2和IgG4)抗体表面。将杂交瘤上清液10、5、2-倍稀释于含有100μg/mL BSA和10mg/mL羧甲基葡聚糖的HBS-P(10mM HEPES pH 7.4，150mM NaCl，0.005％表面活性剂P20)运行缓冲液中或使用纯品。用1分钟接触时间而将每种mAb捕获于单独的表面并用5分钟洗涤以稳定mAB基线。然后将MAdCAM-IgG1Fc(141nM)融合蛋白注射于全部表面上一分钟，随后解离3分钟。使用BIAcore提供的BIAevaluation软件上存在的基线漂移模型，将数据根据每个表面上捕获的抗体的数量标准化并用朗缪尔1:1全局拟合评价。
方案2使用胺偶联将亲和纯化的mAb固定于CM5生物传感器芯片上的葡聚糖层上。使用pH 4.5的乙酸盐缓冲液作为固定缓冲液制备芯片并获得2.5-5.5kRU蛋白密度。在流动缓冲液中的MAdCAM-IgG1Fc融合蛋白的样品以0.2-55nM浓度范围制备(包括仅含有运行缓冲液的0nM的溶液作为零参考)。随机化样品，并用HBS-EP(10mM HEPES pH 7.4，150mM NaCl，3mM EDTA，0.005％表面活性剂P20)作为运行缓冲液，跨4个流动池注射一式两份，各3分钟。使用100μL/分钟的流速来最小化大量转运限制(mass transportlimitation)。监测MAdCAM-IgG1Fc融合蛋白的解离180分钟，通过6秒钟注射25mM H3PO4(50μL/min)或10mM(6.22.2)、20mM(6.67.1、6.73.2、6.77.1)到25mM(6.34.2)和45mM NaOH(6.14.2)再生表面，并用BIAevaluation(v3.1)软件包分析数据。表5列出了本发明的代表性抗MAdCAM抗体的亲和性测量值表5.通过表面等离子共振(BIAcore)测定亲和常数Kd动态分析表明根据本发明制备的抗体对MAdCAM的胞外结构域具有高亲和性和强的结合常数。
实施例III抗-MAdCAM mAb的表位选择性和物种交叉反应性的鉴定抗体识别抗原上表面-暴露的表位，为线性(一级)序列或结构(二级)序列的区域。将Luminex表位框并法(binning)、BIAcore框并法和种免疫组织化学分析一起使用，以便阐释抗-MAdCAM抗体的功能性表位特征。
基于Luminex的表位框并法将结合MxhIgG 2，3，4的微珠(Calbiochem Ml 1427)结合至第一未知抗-MAdCAM抗体。我们加入150μL第一未知抗体稀释物(0.1μg/mL稀释于杂交瘤培养基中)至96孔组织培养板的孔中。将微珠储液轻轻涡旋并稀释于上清液中达到0.5×105微珠/mL的浓度。将微珠在上清液中在摇动器上4℃下黑暗中过夜。通过加入200μL洗涤缓冲液(含有0.05％Tween20的PBS)预湿96-孔微量滴定滤板(Millipore #MABVN1250)的每个孔并通过抽吸移除。接着，以50μL/孔加入0.5×105微珠/mL储液至滤板中，用洗涤缓冲液(2×100μL/孔)洗涤板孔。以60μL/孔加入稀释于杂交瘤培养基(0.1μg/mL)中的MAdCAM-IgG1Fc抗原。遮盖平板并于室温下温育一小时，同时轻轻摇动。通过加入100μL/孔洗涤缓冲液随后抽吸来洗涤板孔两次。接着，我们以60μL/孔加入稀释于杂交瘤培养基中的第二未知抗MAdCAM抗体(0.1μg/mL)。黑暗中室温下摇动平板两小时。接着，通过加入100μL/孔洗涤缓冲液随后通过抽吸洗涤板孔两次。接着，以60μL/孔加入生物素化的MxhIgG2，3，4(0.5μg/mL)。将平板黑暗中室温下摇晃一小时。通过加入100μL/孔洗涤缓冲液随后通过抽吸洗涤板孔两次。向每孔中加入稀释于杂交瘤培养基中的60μL 1μg/mL MxhIgG 2，3，4抗生物素蛋白链菌素-PE(Pharmacia #554061)。将平板黑暗中室温下摇晃二十分钟。通过加入100μL/孔洗涤缓冲液随后通过抽吸洗涤板孔两次。接着，将每孔重悬于80μL封闭缓冲液(具有0.5％牛血清白蛋白、0.1％TWEEN和0.01％硫柳汞的PBS)中，小心地上下吸取重悬微珠。使用Luminex 100及其附带的软件(LuminexCorporation)，读取平板测定发光读数。基于获得的多种试验抗-MAdCAM抗体的发光数据，根据它们的结合特异性将抗-MAdCAM抗体分组。进行试验的抗-MAdCAM抗体分成一系列的表位仓(epitope bin)，如表8所示。
BIAcore框并法以与上面描述相似的方法，BIAcore也可以用于测定本发明用作示范的抗-MAdCAM抗体的表位专有性。使用胺偶合法将9种抗-MAdCAM抗体克隆6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.77.1、7.20.5、9.8.2、1.7.2、7.26.4和7.16.6固定在CM5生物传感器芯片独立的流动池的葡聚糖层上。固定缓冲液是10mM乙酸盐缓冲液pH 4.5(克隆6.22.2、6.34.2、7.20.5、9.8.2、1.7.2、7.26.4和7.16.6)或10mM乙酸盐缓冲液pH 5.5(克隆6.67.1和6.77.1)。在全部情况下获得约3750RU的蛋白密度。用1M盐酸乙醇胺，pH 8.5进行对未反应的N-羟基琥珀酰亚胺酯的失活。将MAdCAM-IgG1Fc融合蛋白在HBS-EP运行缓冲液(0.01M HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005％聚山梨酯20)中稀释为1.5μg/mL(约25nM)的浓度。然后将其跨第一个流动池注射，体积为50μL，注射速率为5μL/分钟。注射完成后，将第一个抗体探针加入相同的流动池中。将全部试验抗体在HBS-EP中稀释至约20μg/mL的浓度，并也将其以5μL/min的流速注射50μL体积。当观察不到试验抗体的结合时，随后立即注射下一个试验克隆。当出现结合时，再生传感器表面以除去MAdCAM-IgG1Fc融合蛋白和试验抗体。取决于固定的抗体和存在的试验抗体，使用多种再生溶液。使用的再生条件的总结在表6中描述表6.用于进行BIAcore表位作图的再生条件的总结
(在全部再生步骤中流速为50μL/分钟)再生后，再次结合MAdCAM-IgG1Fc融合蛋白并注射另外的试验抗体。进行这些步骤直到全部克隆注射到结合有MAdCAM-IgG1Fc融合蛋白的固定化抗体的表面。然后将具有不同的固定化抗体和结合的MAdCAM的新的流动池用于用这九种试验克隆探测。基于它们重链和κ轻链相近的一级氨基酸序列同源性，其SEQ ID号分别是2、4、6、8，预计抗-MAdCAM抗体1.7.2和1.8.2识别相同的MAdCAM表位。因此，仅1.7.2通过BIAcore反应矩阵进行评估。从该分析中略去抗体6.14.2和6.73.2，但全部其它的抗-MAdCAM抗体对的组合以这种方式进行检验。将任意的100RU水平选作为结合/非结合之间的阈值并且基于是否观测到结合生成反应矩阵(表7)。
表7.BIAcore表位框并法反应矩阵 抗体对的全部组合的反应矩阵。-表示抗体探针不结合，x表示观测到结合(超过100RU的选择阈值水平)表7的矩阵对角线(灰色阴影)代表相同探针对的结合数据。在所有实例中，除了两个克隆7.16.6和9.8.2处，抗体是自我封阻的。抗体7.16.6和9.8.2不交叉竞争。自我封阻的缺失可能是由于在融合蛋白中mAb-诱导的构象变化引起的，这种变化允许mAb额外地结合至MAdCAM-IgFc的第二个位点上。
将显示相同反应性模式的克隆分组产生了至少六种不同的表位仓，如图示显示(图5)。抗-MAdCAM抗体与之相互作用的MAdCAM表位序列的进一步精确鉴定可以通过许多方法中的任何一种测定，所述的方法包括但不限于，斑点肽文库阵列的Western分析(Reineke等，Curr.Topicsin Microbiol.and Immunol 24323-36(1999)，M.Famulok，E-LWinnacker，C-H Wong eds.，Springer-Verlag，Berlin)、噬菌体或细菌鞭毛蛋白/fliC表达文库展示或有限蛋白水解后结合蛋白片段的简单MALDI-TOF分析。
免疫组织化学测定将OCT或蔗糖-包埋的回肠(派伊尔氏斑)、肠系膜淋巴结、脾、胃、十二指肠、空肠、结肠的冷冻组织标本用作抗-MAdCAMmAb的阳性染色对照。为了用人IgG2mAb对人切片染色，产生了抗-MAdCAM mAb的生物素化衍生物。切取10μm冷冻的组织切片于具L-赖氨酸包被的载玻片上，直接放入4℃的100％丙酮中(10分钟)，然后放入甲醇中的3％的过氧化氢中(10分钟)，在步骤之间用PBS洗涤。用生物素封闭体系(DAKO Cat.No.X0590)封闭载玻片，然后与PBS中的一抗(1∶100-1∶1000)温育(1小时)，用PBS-Tween 20(0.05％)洗涤并然后用HRP-抗生物素蛋白链菌素(BD Bioscience Cat.No.550946，30分钟)和DAB底物(Sigma Cat.No.D5905)显影结合。对于IgG4mAb，使用HRP-结合的小鼠抗-人IgG4(Zymed Cat.No.3840)二抗。用迈尔氏苏木精明矾染剂复染该载玻片(1分钟)，洗涤并然后安装在DPX中。比较对多个物种(小鼠、大鼠、家兔、狗、猪、短尾猴和人组织)的结合亲和性。通过免疫组织化学方法，抗-MAdCAM抗体对大鼠、家兔和猪组织没有反应性，并且当通过ELISA分析时，抗-MAdCAM抗体对重组小鼠MAdCAM没有交叉反应性。对人、短尾猴和狗组织的数据以表格形式表示，如下表8
表8.抗-MAdCAM抗体对MAdCAM物种直向同源物的交叉反应性的模式 根据注释，抗-MAdCAM抗体结合至专门的内皮结构和淋巴组织通过阴影表示。每一个抗体的基于Luminex表位分析的表位仓和MAdCAM交叉反应性的模式得以显示。抗-MAdCAM抗体6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.3和6.77.1(斜体)的Luminex表位框并法数据源于不同于1.7.2、1.8.2、7.16.6、7.20.5、7.26.4和9.8.2(黑体)的分开独立的试验，这通过字体特征中的不同表示。所有试验的抗-MAdCAM抗体具有识别在胃肠道血管内皮区室上表达的人MAdCAM表位的能力。除了1.7.2和1.8.2，所有其它试验的抗-MAdCAM抗体能特异性结合短尾猴胃肠道的血管内皮区室。某些其它抗-MAdCAM抗体，即6.14.2和6.67.1还具有特异性识别狗MAdCAM直向同源物以及短尾猴的MAdCAM的能力。
表达功能活性嵌合短尾猴/人MAdCAM的CHO细胞系的生成某些抗-MAdCAM抗体对人和短尾猴MAdCAM的结合亲和性的差异引导我们确定对该观测结果是否能得出一个结构基础。基于公开的短尾猴MAdCAM氨基酸序列(Shyjan AM等，J Immunol.，156，285-7(1996))，设计引物用于PCR扩增短尾猴MAdCAM α4β7结合结构域序列。根据厂商说明书，使用Trizol方法(Invitrogen)从冷冻的切取的短尾猴肠系膜淋巴结(约200mg)制备总RNA。将1-2μg用寡-dT作为引物并用AMV逆转录酶(Promega)逆转录。将一部分逆转录产物接受PCR处理，引物为正向5’-AGC ATGGAT CGG GGC CTG GCC-3’(SEQ ID NO67)和反向5’-GTG CAG GACCGG GAT GGC CTG-3’(SEQ ID NO68)，使用1M GC melt(Clontech)中的GC-2聚合酶，退火温度为62℃。切取合适大小的RT-PRC产物并在电泳后从1％琼脂糖凝胶纯化，然后TOPO-TA克隆(Invitrogen)在pCR2.1载体的EcoRI位点之间。通过测序确认插入序列。其核苷酸和预测翻译的氨基酸序列分别在SEQ ID NO 49和50中显示。当比对(图3提供了这种序列比对)时，预测的人和短尾猴MAdCAM的α4β7结合结构域的氨基酸序列显示出高度的序列同一性(90.8％)。为了产生表达功能活性短尾猴MAdCAM的细胞系，其模拟了表8中描述的抗-MAdCAM结合模式，将pCR 2.1载体中对应于短尾猴α4β7结合结构域序列的SacI片段直接亚克隆进C-末端人MAdCAMpIND-Hygro构建体中，该构建体含有羧基末端粘蛋白茎和跨膜结构域，如上描述的。核实序列和取向，然后将KpnI/NotI片段克隆进pEF5FRTV5GWCAT载体(Invitrogen)，替代CAT编码序列并根据厂商的说明书用于转染以在Flp In CHO细胞(Invitrogen)中产生单个稳定表达的克隆。抗-MAdCAM抗体克隆与表达短尾猴/人MAdCAM嵌合体的CHO细胞的结合通过流式细胞计量术评估，并且使用与上面描述十分相似的JY细胞粘附测定法测定抗-MAdCAM抗体的功能活性。抗-MAdCAM抗体的结合和功能活性在表9中表达。表9.一系列抗-MAdCAM抗体在短尾猴/人MAdCAM-CHO/JY粘附测定法中的功能活性与通过FACS测量的与人和短尾猴/人MAdCAM CHO细胞的结合之间的相关性。
总的来说，给定的抗-MAdCAM抗体与人或短尾猴MAdCAM结合的能力(这通过免疫组织化学(表8)通过基于重组细胞的结合而测定)与其功能活性(表9)之间存在好的相关性。例如，抗-MAdCAM抗体1.7.2、1.8.2和6.73.2，表现出一致缺乏与表达嵌合短尾猴/人MAdCAM蛋白的短尾猴组织和细胞的结合。抗-MAdCAM抗体1.7.2、1.8.2和6.73.2在短尾猴/人MAdCAM/JY粘附测定法中也不具有能检测功能性阻断活性的能力。相似的方法可以用于确定识别狗MAdCAM的抗-MAdCAM抗体6.14.2和6.67.1的表位。
实施例IV抗-MAdCAM mAb在检测循环的可溶性MAdCAM作为疾病诊断方法中的用途抗-MAdCAM抗体可用于检测循环的可溶性MAdCAM(sMAdCAM)。对在临床血浆、血清样品或其它生物液体例如但不限于粪便、尿、痰中的sMAdCAM的检测可能是对潜在的疾病包括但不限于炎性肠炎的有用的代替性疾病生物标记。基于表位框并法数据(表7和8)，抗-MAdCAM抗体1.7.2和7.16.6显示能识别人MAdCAM上的不同的表位。用100μL/孔的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的50μg/mL的1.7.2溶液包被ELISA板4℃过夜。温育后，将该板用含有10％牛奶的PBS封闭缓冲液(200μL/孔)封闭1.5小时。温育后，用PBS(2×100μL/孔)洗涤该板并系列稀释MAdCAM-IgG1-Fc融合蛋白，从PBS中的最高浓度50μg/mL降至约5ng/mL，终体积为100μL，将其加入至该板中，室温下温育2小时。以相似的方法，可将MAdCAM-IgG1-Fc蛋白在血浆或血清或一些其它这类相关生物液体中稀释并用于测定在临床样品中可溶性MAdCAM的表达，如下描述。作为阴性对照，仅将缓冲液加入至含有第一抗-MAdCAM抗体的孔中。此后，用PBS(3×100μL/孔)洗板并然后将该板与Alexa488-标记的7.16.6(100μL，5μg/mL)暗中温育。使用商业提供的试剂盒(Molecular Probes，A-20181)，按照厂商提供的方案产生Alexa488-标记的7.16.6。将该板用含有0.05％吐温-20的PBS洗涤，并且标记的7.16.6与捕获的可溶性MAdCAM的结合通过测量荧光(Wallac Victor21420多标记读取仪，激发λ485nm，发射λ535nm，从板的顶端距底端3mm处计数，用正常发射口径持续0.1秒)测定。当将荧光作为MAdCAM-IgG1-Fc融合蛋白的浓度的函数绘图时，见图6，表明1.7.2和经标记的7.16.6可用于诊断目的用以测定在生物液体或临床样品中表达的循环的可溶性MAdCAM水平。这种夹心ELISA方法不限于使用1.7.2和7.16.6，而是可使用识别MAdCAM上的不同表位的抗-MAdCAM抗体的任意组合，如由表7和图5的数据和解释概述的。相似的策略可应用于开发相似的测定法，例如免疫组织化学和蛋白质印迹法，使用其它描述的抗-MAdCAM抗体，用不同的配偶体、变体、标记等。
实施例V根据本发明制备的抗-MAdCAM mAb的氨基酸结构在下面的讨论中，提供了与根据本发明制备的抗-MAdCAM mAb相关的结构信息。为了分析根据本发明产生的mAb的结构，我们从特定的杂交瘤克隆中克隆出了编码重链和轻链片段的基因。基因的克隆和测序如下进行使用Fast-Track试剂盒(Invitrogen)从源于免疫过的XenoMouse小鼠的约2×105个杂交瘤细胞中分离聚(A)+mRNA。用随机引物产生cDNA后进行PCR。将人VH或Vκ家族特异性引物(Marks等，‘Oligonucleotide primers for polymerase chain reactionamplification of human immunoglobulin variable genese anddesign of family-specific oligonucleotide probes’；Eur.J.Immunol.，21，985-991(1991))或通用人VH引物MG-30(5’-CAG GTGCAG CTG GAG CAG TCI GG-3(SEQ ID NO108))与对人Cγ2，MG40-d(5’-GCT GAG GGA GTA GAG TCC TGA GGA-3(SEQ ID NO109))或Cγ4恒定区，MG-40d(5’GCT GAG GGA GTA GAG TCC TGA GGA CTG T-3(SEQ ID NO110))或Cκ恒定区(hκP2；如先前Green等人，1994所述)的特异性的引物结合使用。来自杂交瘤的源于人mAb的重链或κ链转录物的序列通过直接测序使用上述引物从聚(A+)RNA产生的PCR产物获得。使用TOPO-TA克隆试剂盒(Invitrogen)将PCR产物克隆进pCR2.1载体中并使用Prism染料终止测序试剂盒和ABI 377测序仪将两条链测序。通过与‘V BASE sequence directory’(Tomlinson等，J.Mol.Biol.，227，776-798(1992)；Hum.Mol.Genet.，3，853-860(1994)；EMBO J.，14，4628-4638(1995))比对分析全部序列。进一步，将每种抗体1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod和7.26.4-mod接受全长DNA测序。为此，使用RNeasy试剂盒(Qiagen)，从约3-6×106杂交瘤细胞分离总RNA。使用寡-dT和基于AMV的逆转录酶体系(Promega)逆转录mRNA。将V BASE用于设计5’特异性扩增引物，其含有优化的Kozak序列和ATG起始密码子(下划线)，和用于特定重链和κ链的3’反向引物，如表10中描述。
表10用于从表达抗-MAdCAM mAb的杂交瘤扩增cDNA的PCR引物对和用于抗-MAdCAM抗体修饰变种构建的引物。
使用Expand高保真Taq聚合酶(Roche)将引物对用于扩增cDNA，并且将PCR产物克隆进pCR2.1TOPO-TA(Invitrogen)用于随后的测序。然后分别使用XbaI/EcoRI和HindIII/EcoRI位点将核实了重链和κ轻链序列的克隆克隆进pEE6.1和pEE12.1载体(LONZA)。
基因利用分析表11显示了本发明概述的每种杂交瘤的重链和κ轻链基因利用。
表11重链和κ轻链基因利用
序列分析为了进一步检验抗体结构，从获自克隆的cDNA获得抗体的预测氨基酸序列。序列标识号(SEQ ID NO)1-48和51-68提供了抗-MAdCAM抗体1.7.2(SEQ ID NOS 1-4)、1.8.2(SEQ ID NOS 5-8)、6.14.2(SEQ ID NOS 9-12)、6.22.2(SEQ ID NOS 13-16)、6.34.2(SEQ ID NOS 17-20)、6.67.1(SEQ ID NOS 21-24)、6.73.2(SEQID NOS 25-28)、6.77.1(SEQ ID NOS 29-32)、7.16.6(SEQ ID NOS33-36)、7.20.5(SEQ ID NOS 37-40)、7.26.4(SEQ ID NOS 41-44)、9.8.2(SEQ ID NOS 45-48)和经修饰的抗-MAdCAM抗体6.22.2-mod(SEQ ID NOS 51-54)、6.34.2-mod(SEQ ID NOS 55-58)、6.67.1-mod(SEQ ID NOS 59-62)和6.77.1-mod(SEQ ID NOS 63-66)和7.26.4-mod(SEQ ID NOS 41-42，67-68)的重链和κ轻链的核苷酸和氨基酸序列。对于每种克隆的抗-MAdCAM抗体序列，将信号肽序列(或编码该序列的碱基)的序列以小写和下划线显示。图1A-1J提供了抗体1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4和9.8.2的预测的重链氨基酸序列与各自种系基因产物的氨基酸序列之间的序列比对。抗体的CDR1、CDR2和CDR3序列的位置用下划线标记，在表达的序列和相应种系序列之间的差异以粗体表示，并且较于种系序列在表达的序列中有添加的地方，在种系序列中以(-)表示。图1K-1T提供了抗体1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4和9.8.2的预测的κ轻链氨基酸序列与各自的种系基因产物的氨基酸序列之间的序列比对。抗体的CDR1、CDR2和CDR3序列的位置用下划线标记，在表达的序列和相应种系序列之间的差异以粗体表示，并且较于种系序列在表达的序列中有添加的地方，在种系序列中以(-)表示。
翻译后修饰糖基化和脱酰胺作用的存在较于衍生的种系序列，在表达的抗-MAdCAM抗体序列中的一些改变的效应，是用于引入可能可接受N-连接的糖基化(Asn-X-Ser/Thr)和脱酰胺作用(Asn-Gly)的残基(见表12)。编码抗-MAdCAM抗体6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.26.4和9.8.2的κ轻链可变结构域氨基酸序列(SEQ ID NO16、20、24、28、32、44和48)和抗体6.14.2的重链可变结构域(SEQ ID NO10)的核酸序列可预见N-连接糖基化的存在。使用SDS-PAGE和Pro-QEmerald 488糖蛋白(Molecular Probes)染色的组合，用mAb 6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.26.4和9.8.2来研究这种翻译后修饰的存在。简要地说，使用MOPS缓冲液将大约2μg还原的抗-MAdCAM抗体上样至4-12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上。电泳后，将该胶在50％MeOH、5％乙酸中固定并在3％乙酸中洗涤。然后用高碘酸氧化凝胶上的任何糖类并用Pro-QEmerald 488糖蛋白染色试剂盒(Molecular Probes)染色。在最后的洗涤步骤后，用荧光扫描仪设定波长473nm，显现糖蛋白染色。糖蛋白染色后，用SYPRO Ruby蛋白凝胶染料对凝胶进行总蛋白染色并用荧光扫描仪设定波长473nm分析。抗-MAdCAM抗体6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.26.4和9.8.2的κ轻链全部阳性染色，代表糖基化的存在。作为额外的确认，将抗-MAdCAM抗体7.26.4接受胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶消化，LC-MS/MS分析确认经修饰的胰蛋白酶肽的存在并额外地确认κ轻链糖基化。在抗-MAdCAM抗体1.7.2、1.8.2、6.22.2和7.20.5的CDR1区域中特定的Asn-Gly序列使得这些区域对脱酰胺作用敏感。在中性pH下的脱酰胺作用引入一个负电荷并且还可以导致β-异构化，这种异构化可以影响抗体的性质。对于抗-MAdCAM抗体1.7.2、1.8.2和7.20.5，脱去酰胺基的Asn-异天冬氨酸残基的存在通过用MeOH俘获异天冬氨酸侧链后用质谱法评估。简要地说，对于抗-MAdCAM抗体1.7.2，选取胰蛋白酶/Asp-N肽SSQSLLQSNGYNYL(SEQ ID NO69)(1573.7 Da)的状况通过LC-MS/MS监测。将抗-MAdCAM抗体1.7.2在10mM DTT中还原，在5mM碘乙酸钠中烷化并随后缓冲液交换到胰蛋白酶消化缓冲液(50mM Tris-HCl，1mM CaCl2，pH 7.6)中。然后将抗体与测序级经修饰的胰蛋白酶(Promega)以1∶20的蛋白酶∶蛋白比例混合。将蛋白在胰蛋白酶中于30℃消化15小时，然后使用Ettan LC系统上的C-18RPC通过HPLC分离得到的肽。将含33Asn的肽(4032Da)从柱中收集并稀释于Asp-N消化缓冲液(50mM磷酸钠缓冲液，pH 8.0)。然后以约10∶1的肽∶酶比例加入内蛋白酶Asp-N(Roche)。将乙酰氯(100μL)加入至甲醇样品(1mL，-20℃)中，将混合物升温至室温。在Speed-Vac中干燥胰蛋白酶+Asp-N消化物并然后加入5μL甲醇/乙酰氯(45分钟，室温)，然后再次在Speed-Vac中干燥。将得到的残余物在0.1％TFA中复原并将肽最初在Voyager-DE STR MALDI-TOF质谱仪上分析，用硝化纤维素薄层样品制备方法，或反相纯化法，使用C18ZipTips(Millipore)，随后与α-腈基基质液滴混合。也在如上的Deca XP Plus Ion Trap质谱仪上使用LC-MS/MS分析甲基化肽混合物。将洗脱物直接投入至Ion Trap MS中并随后通过MS和MS/MS分析肽。设置MS分析在300-2000 Da之间的全部离子。然后将在任何特定扫描中的最强离子接受MS/MS分析。
表12抗-MAdCAM抗体的翻译后修饰 诱变研究在本发明中示例的抗-MAdCAM抗体的一级氨基酸序列可以进行修饰，通过定点诱变，以除去翻译后修饰(例如，糖基化、脱酰胺作用)的潜在位点或用以改变同种型背景，或用以设计可以提高治疗效用的其它改变。举个例子，将PCR用于设计对抗-MAdCAM体6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.77.1和7.26.4的改变，用于恢复某些框架序列为种系序列，用以除去潜在的糖基化位点和/或改变同种型背景为人IgG2。pCR2.1TOPO-TA克隆的cDNA(100ng)，其对应于重链核苷酸SEQ ID NO13、17、21和29，以及κ轻链核苷酸SEQ IDNO15、19、23、31和43，将其在使用重叠-延伸和表10中描述的一组引物对的一系列PCR中用作模板。6.22.2重链使用Expand Taq聚合酶和核苷酸序列SEQ ID NO13表示的pCR2.1TOPO-TA cDNA模板(100ng)，将PCR引物对6.22.2_VH_F1和6.22.2VH_CS*(1)以及VH3-33和6.22.2_VH_R1(2)用于产生分别的PCR产物(1)和(2)。纯化产物(1)和(2)并在第三次PCR步骤中将它们(每种约50ng)与VH3-33和VK6.22.2_CS*引物组合，以产生修饰的6.22.2重链V-结构域。这种修饰的变种在FR1中含有His/Phe突变并引入一XbaI限制性位点使得能符合读框地克隆进pEE6.1衍生的载体，称为pEE6.1CH，该载体含有相应的人IgG2恒定区。将最终的PCR片段克隆进pEE6.1CH的XbaI位点，检查其取向并检验插入的全长序列。该修饰的6.22.2重链的核苷酸序列在SEQ ID NO51可以找到并且其相应的氨基酸序列在SEQID NO52中。较于亲本在核苷酸序列和氨基酸序列中的变化得以显示。6.22.2κ轻链使用Expand Taq聚合酶和由核苷酸序列SEQ ID NO15表示的pCR2.1 TOPO-TA cDNA模板(100ng)，将PCR引物对6.22.2_VK_F1和revKappa(1)以及A26和6.22.2_VK_R1(2)用于产生分别的PCR产物(1)和(2)。纯化产物(1)和(2)并在第三次PCR步骤中将它们(每种约50ng)与A26和revKappa引物组合，以产生修饰的6.22.2κ轻链V-结构域。该修饰的变种含有对FR3序列的Asn/Asp和Gly/Ser改变。使用HindIII/EcoR1位点将得到的PCR产物克隆进pEE12.1中并检验全长序列。修饰的6.22.2κ轻链的核苷酸序列可在SEQ ID NO53中找到并且其相应的氨基酸序列在SEQ ID NO54中。核苷酸序列和氨基酸序列较于亲本的变化得以显示。6.34.2重链使用Expand Taq聚合酶和由核苷酸序列SEQ ID NO17表示的pCR2.1 TOPO-TA cDNA模板(100ng)，将PCR引物对6.34.2_VH_F1和6.22.2VH_CS*(1)以及VH3-30和6.34.2_VH_R1(2)用于产生分别的PCR产物(1)和(2)。纯化产物(1)和(2)并在第三次PCR步骤中将它们(每种约50ng)与VH3-30和VK6.22.2_CS*引物组合，以产生修饰的6.34.2重链V-结构域。这种修饰的变种在FR3中含有Ser/Arg突变并引入一XbaI限制性位点使得能符合读框地克隆进pEE6.1衍生的载体，称为pEE6.1CH，该载体含有相应的人IgG2恒定结构域。将最终的PCR片段克隆进pEE6.1CH的XbaI位点，检查其取向并检验插入的全长序列。修饰的6.34.2重链的核苷酸序列可在SEQ ID NO55中发现并且其相应的氨基酸序列在SEQ ID NO56中。核苷酸序列和氨基酸序列较于亲本的变化得以显示。6.34.2κ轻链使用Expand Taq聚合酶和由核苷酸序列SEQ ID NO19表示的pCR2.1 TOPO-TA cDNA模板(100ng)，将PCR引物对O12和6.34.2_VK_R1(1)、6.34.2_VK_F1和6.34.2_VK_R2(2)以及6.34.2_VK_F2和revKappa(3)用于产生分别的PCR产物(1)、(2)和(3)。纯化产物(1)、(2)和(3)并在第三次PCR步骤中将(1)和(2)(每种约50ng)与O12和6.34.2_VK_R2引物组合，以产生PCR产物(4)。在第四次PCR步骤中将PCR产物(2)和(3)(每种约50ng)与6.34.2_VK_F1和revKappa组合，以产生PCR产物(5)。纯化PCR产物(4)和(5)并将它们(每种约50ng)与引物O12和revKappa组合以产生修饰的6.34.2κ轻链V-结构域。该修饰的变种含有CDR1中的Asn/Ser改变、FR2中的Phe/Tyr改变和FR3序列的Arg-Thr/Ser-Ser、Asp/Glu和Ser/Tyr改变。使用HindIII/EcoR1位点将得到的PCR产物克隆进pEE12.1中并检验全长序列。修饰的6.34.2κ轻链的核苷酸序列可在SEQ ID NO57中发现并且其相应的氨基酸序列在SEQ ID NO58中。核苷酸序列和氨基酸序列较于亲本的变化得以显示。6.67.1重链使用Expand Taq聚合酶和由核苷酸序列SEQ ID NO21表示的pCR2.1 TOPO-TA cDNA模板(100ng)，将PCR引物对6.67.1_VH_F1和6.67.1VH_CS*(1)以及VH4-4和6.67.1_VH_R1(2)用于产生分别的PCR产物(1)和(2)。纯化产物(1)和(2)并在第三次PCR步骤中将它们(每种约50ng)与VH4-4和VK6.67.1_CS*引物组合，以产生修饰的6.67.1重链V-结构域。这种修饰的变种在FR3中含有Ile-Leu-Ala/Met-Ser-Val转变并引入一XbaI限制性位点使得能符合读框地克隆进pEE6.1衍生的载体，称为pEE6.1CH，该载体含有相应的人IgG2恒定结构域。将最终的PCR片段克隆进pEE6.1CH的XbaI位点，检查其取向并检验插入的全长序列。修饰的6.67.1重链的核苷酸序列可在SEQ ID NO59中找到并且其相应的氨基酸序列在SEQ ID NO60中。核苷酸序列和氨基酸序列较于亲本的变化得以显示。6.67.1κ轻链使用Expand Taq聚合酶和由核苷酸序列SEQ ID NO23表示的pCR2.1 TOPO-TA cDNA模板(100ng)，将PCR引物对6.67.1_VK_F1和revKappa(1)以及B3和6.67.1_VK_R1(2)用于产生分别的PCR产物(1)和(2)。纯化产物(1)和(2)并在第三次PCR步骤中将它们(每种约50ng)与B3和revKappa引物组合，以产生修饰的6.67.1κ轻链V-结构域。该修饰的变种包含CDR1中的Thr/Asn改变和FR2中的Arg/Gly改变。使用HindIII/EcoR1位点将得到的PCR产物克隆进pEE12.1中并检验全长序列。修饰的6.67.1κ轻链的核苷酸序列可在SEQ ID NO61中发现并且其相应的氨基酸序列在SEQ ID NO62中。核苷酸序列和氨基酸序列较于亲本的变化得以显示。6.77.1重链使用Expand Taq聚合酶和由核苷酸序列SEQ ID NO29表示的pCR2.1 TOPO-TA cDNA模板(100ng)，将PCR引物对VH 3-21和6.22.2VH_CS*用于产生单个PCR产物。将该PCR产物用XbaI消化、凝胶纯化并克隆进pEE6.1CH的XbaI位点，检查取向。将插入序列进行全长序列检验。修饰的6.77.1重链的核苷酸序列可在SEQ ID NO63中发现并且其相应的氨基酸序列在SEQ ID NO64中。核苷酸序列和氨基酸序列较于亲本的变化得以显示。6.77.1κ轻链使用Expand Taq聚合酶和由核苷酸序列SEQ ID NO31表示的pCR2.1 TOPO-TA cDNA模板(100ng)，将PCR引物对A2和6.77.1_VK_R1(1)、6.77.1_VK_VK_F1和6.77.1_R2(2)以及6.77.1_VK_F2和revKappa(3)用于产生分别的PCR产物(1)、(2)和(3)。纯化产物(1)、(2)和(3)并在第三次PCR步骤中将(1)和(2)(每种约50ng)与A2和6.77.1_VK_R2引物组合，以产生PCR产物(4)。在第四次PCR步骤中将PCR产物(2)和(3)(每种约50ng)与6.77.1_VK_F1和revKappa引物组合，以产生PCR产物(5)。纯化PCR产物(4)和(5)并将它们(每种约50ng)与引物A2和JK2组合以产生修饰的6.77.1κ轻链V-结构域。该修饰的变种包含CDR1中的Asn/Lys改变、FR3中的Ser/Tyr改变和CDR3序列中的Cys/Ser残基改变。使用HindIII/EcoR1位点将得到的PCR产物克隆进pEE12.1中并检验全长序列。修饰的6.77.1κ轻链的核苷酸序列可在SEQ ID NO65中发现并且其相应的氨基酸序列在SEQID NO66中。核苷酸序列和氨基酸序列较于亲本的变化得以显示。7.26.4κ轻链使用Expand Taq聚合酶和由核苷酸序列SEQ ID NO43表示的pCR2.1TOPO-TA cDNA模板(100ng)，将PCR引物对7.26.4_VK_F1和revKappa(1)以及A2和7.26.4_VK_R1(2)用于产生分别的PCR产物(1)和(2)。纯化产物(1)和(2)并在第三次PCR步骤中将它们(每种约50ng)与A2和revKappa引物组合，以产生修饰的7.26.4κ轻链V-结构域。该修饰的变种包含CDR1中的Asn/Ser变化。使用HindIII/EcoR1位点将得到的PCR产物克隆进pEE12.1并检验全长序列。修饰的7.26.4κ轻链的核苷酸序列可在SEQ ID NO67中发现并且其相应的氨基酸序列在SEQ ID NO68中。核苷酸序列和氨基酸序列较于亲本的变化得以显示。6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.77.1和7.26.4的修饰的变种称为6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod和7.26.4-mod，并且其重链核苷酸序列分别表示为SEQ ID NO51、55、59、63和41，相应的氨基酸序列为SEQ ID NO52、56、60、64和42，以及κ轻链核苷酸序列为SEQ ID NO53、57、61、65和67，相应的氨基酸序列为SEQ ID NO54、58、62、66和68，用于其中每一个变种的功能性真核生物表达载体如下装配用NotI/SalI从pEE6.1CH载体切取对应于6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod和6.77.1-mod的重链cDNA插入序列，用NotI/SalI从pEE6.1载体上切取7.26.4的重链的亲本版本，并且将纯化的片段克隆进相应的含有6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod和7.26.4-mod修饰变种的κ轻链序列的pEE12.1载体中相同的位点。确认载体的序列，并将纯化量的载体用于瞬时转染HEK 293T细胞。简单地说，将9×106HEK 293T细胞(该细胞在转染前一天在T165瓶中接种并洗涤进Optimem中)根据厂商提供的说明书使用Lipofectamine PLU(Invitrogen)用对应于6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod和7.26.4-mod的载体cDNA(40μg)瞬时转染。将细胞温育3小时，然后用含有10％超低IgG胎牛血清(Invitrogen 16250-078)和L-谷氨酰胺(50mL)的DMEM(Invitrogen 21969-035)培养基代替转染培养基。5天后收获培养上清液，过滤除菌并以上面描述相似的方式将抗-MAdCAM抗体用G蛋白琼脂糖亲和色谱纯化。通过Bradford测定法定量回收的抗体的量(20-100μg)。将对应于6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod和7.26.4-mod的亲和纯化的抗体的抗-MAdCAM活性按先前描述的在MAdCAM-IgG1-Fc融合测定法中评估。与衍生它们的亲本抗-MAdCAM抗体相比较，这些抗-MADCAM抗体的IC50值在表13中显示。上面描述过的氨基酸置换对经修饰的抗-MAdCAM抗体的活性的影响与它们的亲本相比是很小的。所述抗体也保持了它们与表达重组人MAdCAM或短尾猴/人MAdCAM嵌合体的CHO细胞的结合。
表13.经修饰的抗-MADCAM抗体6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod和7.26.4-mod与它们的亲本相比的活性。
实施例VI由阻断性抗-MAdCAM抗体引起的在外周循环中β7+淋巴细胞的增加开发用以确定并关联抗-MAdCAM抗体的机制效应和其在血液中的循环水平的测定法。抑制性抗-MAdCAM抗体应该具有抑制表达α4β7整联蛋白的白细胞募集至肠胃道的效果。携带α4β7整联蛋白的白细胞的类别因而应该限于外周循环。这可在短尾猴中用完全人的抗-人MAdCAM mAb7.16.6证明。将纯化的抗-人MAdCAM mAb 7.16.6(1mg/kg)或载体(20mM乙酸钠、0.2mg/mL聚山梨酯80、45mg/mL甘露醇和0.02mg/mL EDTA，pH 5.5)经由隐静脉通过静脉内施用至两组短尾猴(n＝4/组)以类似的方式评估。给药后3天通过股静脉穿刺将血样收集于EDTA中。与短尾猴α4β7整联蛋白交叉反应的LPAM特异性抗体，不能商业提供，所以用抗-β7抗体(识别α4β7和αEβ7整联蛋白)代替。根据下面的表格即表格15，将抗体(30μL)加入至含有100μL短尾猴血液的试管中，通过轻轻涡旋混合并于4℃下温育20-30分钟。
表15.用于对短尾猴血液进行免疫分型的抗体(BD Pharmingen) 向每个试管加入1mL 1∶10 FACSlyse溶液(BD#349202)，通过轻轻涡旋混合并于室温下暗中温育约12分钟直至红细胞溶解完成。然后将2mL BD染色缓冲液(#554656)加至每个试管，混合并以250xg在室温下离心6-7分钟。倾析出上清液并将沉淀颗粒重悬于3mL染色缓冲液中，再次混合并在室温下以250xg离心6-7分钟。将含有w/v低聚甲醛(100μL)的Cytofix缓冲液(BD#554655)加入至来自猴外周血液的细胞沉淀颗粒中并通过低速/中速涡旋器充分混合。将样品在黑暗中4℃下保存直至采集用于FACSCalibur。在获取之前即刻，将PBS(100μL)加入所有试管。通过合适的门控分选和象限分析获得CD4+β7+CD95loCD28+(幼稚)，CD4+β7+CD95hiCD28+(中央记忆细胞)、CD4+β7-CD95hiCD28+(中央记忆细胞)、CD4+β7+CD95hiCD28-(效应记忆细胞)的绝对细胞数目。其它T细胞亚组，例如CD8+T中央记忆细胞(β7+CD8+CD28+CD95+)和携带MAdCAM配体的任何其它白细胞，也可通过这种方法用适宜的抗体分析。与载体对照相比较，抗-MAdCAM mAb 7.16.6引起循环CD4+β7+CD95hiCD28+中央记忆T细胞水平约3倍增加，如图7显示。对循环的CD4+β7-CD95hiCD28+中央记忆T细胞群没有影响，这表明抗-MAdCAM mAb 7.16.6的效应对归巢肠的T细胞是特异性的。抗-MAdCAM mAb 7.16.6在短尾猴中对循环的(α4)β7+淋巴细胞群的影响表明这是机制生物标记的一个强有力的替代证据，特别是在临床背景中的实际应用方面。
序列SEQ ID NO1-48和51-68提供了12种人抗-MAdCAM抗体的重链和κ轻链的核苷酸序列和氨基酸序列、短尾猴MAdCAMα4β7结合结构域的核苷酸和氨基酸序列以及五种经修饰的人抗-MAdCAM抗体的核苷酸和氨基酸序列。SEQ ID NO1-48提供了12种人单克隆抗-MAdCAM抗体的重链和κ轻链的核苷酸序列和氨基酸序列1.7.2(SEQ ID NO1-4)、1.8.2(SEQ ID NO5-8)、6.14.2(SEQ ID NO9-12)、6.22.2(SEQ ID NO13-16)、6.34.2(SEQ ID NO17-20)、6.67.1(SEQ ID NO21-24)、6.73.2(SEQ ID NO25-28)、6.77.1(SEQID NO29-32)、7.16.6(SEQ ID NO33-36)、7.20.5(SEQ ID NO37-40)、7.26.4(SEQ ID NO41-44)、和9.8.2(SEQ ID NO45-48)。SEQ ID NO49-50提供了短尾猴MAdCAMα4β7结合结构域的核苷酸和氨基酸序列。SEQ ID NO51-68提供了经修饰的单克隆抗-MAdCAM抗体的重链和κ轻链的核苷酸序列和氨基酸序列6.22.2(SEQ ID NO51-54)、修饰的6.34.2(SEQ ID NO55-58)、修饰的6.67.1(SEQID NO59-62)、修饰的6.77.1(SEQ ID NO63-66)；以及经修饰的单克隆抗-MAdCAM抗体修饰的7.26.4(SEQ ID NO67-68)的κ轻链的核苷酸序列和氨基酸序列。SEQ ID NOS70-106和108-110提供了各种引物序列。
序列表解释信号序列标下划线的小写字母与原始序列相比经修饰的抗MAdCAM抗体序列中的氨基酸改变标下划线的大写字母SEQ ID NO.11.7.2重链核苷酸序列1atggagtttg ggctgagctg gattttcctt gctgctattt taaaaggtgt51ccagtgtGAG GTGCAGCTGG TGGAGTCTGG GGGAGGCTTG GTGAAGCCTG101 GGGGGTCCCT TAGACTCTCC TGTGTAGCCT CTGGATTCAC TTTCACTAAC151 GCCTGGATGA TCTGGGTCCG CCAGGCTCCA GGGAAGGGGC TGGAGTGGGT201 TGGCCGTATT AAAAGGAAAA CTGATGGTGG GACAACAGAC TACGCTGCAC251 CCGTGAAAGG CAGATTCACC ATCTCAAGAG ATGATTCAAA AAACACGCTG301 TATCTGCAAA TGAACAGCCT GAAAACCGAG GACACAGCCG TGTATTACTG351 TACCACAGGG GGAGTGGCTG AGGACTACTG GGGCCAGGGA ACCCTGGTCA401 CCGTCTCCTC AGCCTCCACC AAGGGCCCAT CGGTCTTCCC CCTGGCGCCC451 TGCTCCAGGA GCACCTCCGA GAGCACAGCG GCCCTGGGCT GCCTGGTCAA501 GGACTACTTC CCCGAACCGG TGACGGTGTC GTGGAACTCA GGCGCTCTGA551 CCAGCGGCGT GCACACCTTC CCAGCTGTCC TACAGTCCTC AGGACTCTAC601 TCCCTCAGCA GCGTGGTGAC CGTGCCCTCC AGCAACTTCG GCACCCAGAC651 CTACACCTGC AACGTAGATC ACAAGCCCAG CAACACCAAG GTGGACAAGA701 CAGTTGAGCG CAAATGTTGT GTCGAGTGCC CACCGTGCCC AGCACCACCT751 GTGGCAGGAC CGTCAGTCTT CCTCTTCCCC CCAAAACCCA AGGACACCCT801 CATGATCTCC CGGACCCCTG AGGTCACGTG CGTGGTGGTG GACGTGAGCC851 ACGAAGACCC CGAGGTCCAG TTCAACTGGT ACGTGGACGG CGTGGAGGTG901 CATAATGCCA AGACAAAGCC ACGGGAGGAG CAGTTCAACA GCACGTTCCG951 TGTGGTCAGC GTCCTCACCG TTGTGCACCA GGACTGGCTG AACGGCAAGG1001 AGTACAAGTG CAAGGTCTCC AACAAAGGCC TCCCAGCCCC CATCGAGAAA1051 ACCATCTCCA AAACCAAAGG GCAGCCCCGA GAACCACAGG TGTACACCCT1101 GCCCCCATCC CGGGAGGAGA TGACCAAGAA CCAGGTCAGC CTGACCTGCC1151 TGGTCAAAGG CTTCTACCCC AGCGACATCG CCGTGGAGTG GGAGAGCAAT1201 GGGCAGCCGG AGAACAACTA CAAGACCACA CCTCCCATGC TGGACTCCGA1251 CGGCTCCTTC TTCCTCTACA GCAAGCTCAC CGTGGACAAG AGCAGGTGGC1301 AGCAGGGGAA CGTCTTCTCA TGCTCCGTGA TGCATGAGGC TCTGCACAAC1351 CACTACACGC AGAAGAGCCT CTCCCTGTCT CCGGGTAAAT GA
SEQ ID NO.21.7.2预测的重链蛋白质序列1mefglswifl aailkgvqcE VQLVESGGGL VKPGGSLRLS CVASGFTFTN51 AWMIWVRQAP GKGLEWVGRI KRKTDGGTTD YAAPVKGRFT ISRDDSKNTL101 YLQMNSLKTE DTAVYYCTTG GVAEDYWGQG TLVTVSSAST KGPSVFPLAP151 CSRSTSESTA ALGCLVKDYF PEPVTVSWNS GALTSGVHTF PAVLQSSGLY201 SLSSVVTVPS SNFGTQTYTC NVDHKPSNTK VDKTVERKCC VECPPCPAPP251 VAGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVQ FNWYVDGVEV301 HNAKTKPREE QFNSTFRVVS VLTVVHQDWL NGKEYKCKVS NKGLPAPIEK351 TISKTKGQPR EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN401 GQPENNYKTT PPMLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN451 HYTQKSLSLS PGKSEQ ID NO.31.7.2κ轻链核苷酸序列1atgaggctcc ctgctcagct cctggggctg ctaatgctct gggtctctgg51atccagtgggGATATTGTGA TGACTCAGTC TCCACTCTCC CTGCCCGTCA101 CCCCTGGAGA GCCGGCCTCC ATCTCCTGCA GGTCTAGTCA GAGCCTCCTG151 CAAAGTAATG GATACAACTA TTTGGATTGG TACCTGCAGA AGCCAGGGCA201 GTCTCCACAG CTCCTGATCT ATTTGGGTTC TAATCGGGCC TCCGGGGTCC251 CTGACAGGTT CAGTGGCAGT GGATCAGGCA CAGATTTTAC ACTGAAAATC301 AGCAGAGTGG AGGCTGAGGA TGTTGGGGTT TATTACTGCA TGCAAGCTCT351 ACAAACTATC ACCTTCGGCC AAGGGACACG ACTGGAGATT AAACGAACTG401 TGGCTGCACC ATCTGTCTTC ATCTTCCCGC CATCTGATGA GCAGTTGAAA451 TCTGGAACTG CCTCTGTTGT GTGCCTGCTG AATAACTTCT ATCCCAGAGA501 GGCCAAAGTA CAGTGGAAGG TGGATAACGC CCTCCAATCG GGTAACTCCC551 AGGAGAGTGT CACAGAGCAG GACAGCAAGG ACAGCACCTA CAGCCTCAGC601 AGCACCCTGA CGCTGAGCAA AGCAGACTAC GAGAAACACA AAGTCTACGC651 CTGCGAAGTC ACCCATCAGG GCCTGAGCTC GCCCGTCACA AAGAGCTTCA701 ACAGGGGAGA GTGTTAGTGASEQ ID NO.41.7.2预测的κ轻链蛋白质序列1mrlpagllgl lmlwvsgssgDIVMTQSPLS LPVTPGEPAS ISCRSSQSLL51 QSNGYNYLDW YLQKPGQSPQ LLIYLGSNRA SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI101 SRVEAEDVGV YYCMQALQTI TFGQGTRLEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK151 SGTASVVCLL NNFYPREAKV QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS202 STLTLSKADY EKHKVYACEV THQGLSSPVT KSFNRGEC
SEQ ID NO.51.8.2重链核苷酸序列1atggagtttg ggctgagctg gattttcctt gctgctattt taaaaggtgt51ccagtgtGAG GTGCAGCTGG TGGAGTCTGG GGGAGGCTTG GTGAAGCCTG101 GGGGGTCCCT TAGACTCTCC TGTGTAGTCT CTGGATTCAC TTTCACTAAC151 GCCTGGATGA TCTGGGTCCG CCAGGCTCCA GGGAAGGGGC TGGAGTGGGT201 TGGCCGTATT AAAAGGAAAA CTGATGGTGG GACAACAGAC TACGCTGCAC251 CCGTGAAAGG CAGATTCACC ATCTCAAGAG ATGATTCAAA AAACACGCTG301 TATCTGCAAA TGAACAGCCT GAAAACCGAG GACACAGCCG TGTATTACTG351 TACCACAGGG GGAGTGGCTG AGGACTACTG GGGCCAGGGA ACCCTGGTCA401 CCGTCTCCTC AGCCTCCACC AAGGGCCCAT CGGTCTTCCC CCTGGCGCCC451 TGCTCCAGGA GCACCTCCGA GAGCACAGCG GCCCTGGGCT GCCTGGTCAA501 GGACTACTTC CCCGAACCGG TGACGGTGTC GTGGAACTCA GGCGCTCTGA551 CCAGCGGCGT GCACACCTTC CCAGCTGTCC TACAGTCCTC AGGACTCTAC601 TCCCTCAGCA GCGTGGTGAC CGTGCCCTCC AGCAACTTCG GCACCCAGAC651 CTACACCTGC AACGTAGATC ACAAGCCCAG CAACACCAAG GTGGACAAGA701 CAGTTGAGCG CAAATGTTGT GTCGAGTGCC CACCGTGCCC AGCACCACCT751 GTGGCAGGAC CGTCAGTCTT CCTCTTCCCC CCAAAACCCA AGGACACCCT801 CATGATCTCC CGGACCCCTG AGGTCACGTG CGTGGTGGTG GACGTGAGCC851 ACGAAGACCC CGAGGTCCAG TTCAACTGGT ACGTGGACGG CCTGGAGGTG901 CATAATGCCA AGACAAAGCC ACGGGAGGAG CAGTTCAACA GCACGTTCCG951 TGTGGTCAGC GTCCTCACCG TTGTGCACCA GGACTGGCTG AACGGCAAGG1001 AGTACAAGTG CAAGGTCTCC AACAAAGGCC TCCCAGCCCC CATCGAGAAA1051 ACCATCTCCA AAACCAAAGG GCAGCCCCGA GAACCACAGG TGTACACCCT1101 GCCCCCATCC CGGGAGGAGA TGACCAAGAA CCAGGTCAGC CTGACCTGCC1151 TGGTCAAAGG CTTCTACCCC AGCGACATCG CCGTGGAGTG GGAGAGCAAT1201 GGGCAGCCGG AGAACAACTA CAAGACCACA CCTCCCATGC TGGACTCCGA1251 CGGCTCCTTC TTCCTCTACA GCAAGCTCAC CGTGGACAAG AGCAGGTGGC1301 AGCAGGGGAA CGTCTTCTCA TGCTCCGTGA TGCATGAGGC TCTGCACAAC1351 CACTACACGC AGAAGAGCCT CTCCCTGTCT CCGGGTAAAT GASEQ ID NO.61.8.2预测的重链蛋白质序列1mefglswifl aailkgvqcE VQLVESGGGL VKPGGSLRLS CVVSGFTFTN51 AWMIWVRQAP GKGLEWVGRI KRKTDGGTTD YAAPVKGRFT ISRDDSKNTL101 YLQMNSLKTE DTAVYYCTTG GVAEDYWGQG TLVTVSSAST KGPSVFPLAP151 CSRSTSESTA ALGCLVKDYF PEPVTVSWNS GALTSGVHTF PAVLQSSGLY201 SLSSVVTVPS SNFGTQTYTC NVDHKPSNTK VDKTVERKCC VECPPCPAPP251 VAGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVQ FNWYVDGVEV301 HNAKTKPREE QFNSTFRVVS VLTVVHQDWL NGKEYKCKVS NKGLPAPIEK351 TISKTKGQPR EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN401 GQPENNYKTT PPMLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN451 HYTQKSLSLS PGK
SEQ ID NO.71.8.2κ轻链核苷酸序列1atgaggctcc ctgctcagct cctggggctg ctaatgctct gggtctctgg51atccagtgggGATATTGTGA TGACTCAGTC TCCACTCTCC CTGCCCGTCA101 CCCCTGGAGA GCCGGCCTCC ATCTCCTGCA GGTCTAGTCA GAGCCTCCTG151 CAAAGTAATG GATTCAACTA TTTGGATTGG TACCTGCAGA AGCCAGGGCA201 GTCTCCACAG CTCCTGATCT ATTTGGGTTC TAATCGGGCC TCCGGGGTCC251 CTGACAGGTT CAGTGGCAGT GGGTCAGGCA CAGATTTTAC ACTGAAAATC301 AGCAGAGTGG AGGCTGAGGA TGTTGGGGTT TATTACTGCA TGCAAGCTCT351 ACAAACTATC ACCTTCGGCC AAGGGACACG ACTGGAGATT AAACGAACTG401 TGGCTGCACC ATCTGTCTTC ATCTTCCCGC CATCTGATGA GCAGTTGAAA451 TCTGGAACTG CCTCTGTTGT GTGCCTGCTG AATAACTTCT ATCCCAGAGA501 GGCCAAAGTA CAGTGGAAGG TGGATAACGC CCTCCAATCG GGTAACTCCC551 AGGAGAGTGT CACAGAGCAG GACAGCAAGG ACAGCACCTA CAGCCTCAGC601 AGCACCCTGA CGCTGAGCAA AGCAGACTAC GAGAAACACA AAGTCTACGC651 CTGCGAAGTC ACCCATCAGG GCCTGAGCTC GCCCGTCACA AAGAGCTTCA701 ACAGGGGAGA GTGTTAGTGASEO ID NO.81.8.2预测的κ轻链蛋白质序列1mrlpaqllgl lmlwvsgssgDIVMTQSPLS LPVTPGEPAS ISCRSSQSLL51 QSNGFNYLDW YLQKPGQSPQ LLIYLGSNRA SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI101 SRVEAEDVGV YYCMQALQTI TFGQGTRLEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK151 SGTASVVCLL NNFYPREAKV QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS202 STLTLSKADY EKHKVYACEV THQGLSSPVT KSFNRGEC
SEQ ID NO.96.14.2重链核苷酸序列1atggagtttg ggctgagctg gctttttctt gtggctattt taaaaggtgt51ccagtgtGAG GTGCAGCTGT TGGAGTCTGG GGGAGGCTTG GTACAGCCTG101 GGGGGTCCCT GAGACTCTCC TGTGCAGCCT CTGGACTCAC CTTTAACAAT151 TCTGCCATGA CCTGGGTCCG CCAGGCTCCA GGGAAGGGGC TGGAGTGGGT201 CTCAACTACT AGTGGAAGTG GTGGTACCAC ATACTACGCA GACTCCGTGA251 AGGGCCGGTT CACCATCTCC AGAGACTCTC CCAAGAACAC GCTCTATCTG301 CAAATGAACA GCCTGAGAGC CGAGGACACG GCCGTATATT ACTGTGCGGC351 CCGTGGATAC AGCTATGGTA CGACCCCCTA TGAGTACTGG GGCCAGGGAA401 CCCTGGTCAC CGTCTCCTCA GCTTCCACCA AGGGCCCATC CGTCTTCCCC451 CTGGCGCCCT GTTCCAGGAG CACCTCCGAG AGCACAGCCG CCCTGGGCTG501 CCTGGTCAAG GACTACTTCC CCGAACCGGT GACGGTGTCG TGGAACTCAG551 GCGCCCTGAC CAGCGGCGTG CACACCTTCC CGGCTGTCCT ACAGTCCTCA601 GGACTCTACT CCCTCAGCAG CGTGGTGACC GTGCCCTCCA GCAGCTTGGG651 CACGAAGACC TACACCTGCA ACGTAGATCA CAAGCCCAGC AACACCAAGG701 TGGACAAGAG AGTTGAGTCC AAATATGGTC CCCCATGCCC ATCATGCCCA751 GCACCTGAGT TCCTGGGGGG ACCATCAGTC TTCCTGTTCC CCCCAAAACC801 CAAGGACACT CTCATGATCT CCCGGACCCC TGAGGTCACG TGCGTGGTGG851 TGGACGTGAG CCAGGAAGAC CCCGAGGTCC AGTTCAACTG GTACGTGGAT901 GGCGTGGAGG TGCATAATGC CAAGACAAAG CCGCGGGAGG AGCAGTTCAA951 CAGCACGTAC CGTGTGGTCA GCGTCCTCAC CGTCCTGCAC CAGGACTGGC1001 TGAACGGCAA GGAGTACAAG TGCAAGGTCT CCAACAAAGG CCTCCCGTCC1051 TCCATCGAGA AAACCATCTC CAAAGCCAAA GGGCAGCCCC GAGAGCCACA1101 GGTGTACACC CTGCCCCCAT CCCAGGAGGA GATGACCAAG AACCAGGTCA1151 GCCTGACCTG CCTGGTCAAA GGCTTCTACC CCAGCGACAT CGCCGTGGAG1201 TGGGAGAGCA ATGGGCAGCC GGAGAACAAC TACAAGACCA CGCCTCCCGT1251 GCTGGACTCC GACGGCTCCT TCTTCCTCTA CAGCAGGCTA ACCGTGGACA1301 AGAGCAGGTG GCAGGAGGGG AATGTCTTCT CATGCTCCGT GATGCATGAG1351 GCTCTGCACA ACCACTACAC ACAGAAGAGC CTCTCCCTGT CTCTGGGTAA1401 ATGASEQ ID NO.106.14.2预测的重链蛋白质序列1mefglswlflvailkgvqcE VQLLESGGGL VQPGGSLRLS CAASGLTFNN51 SAMTWVRQAP GKGLEWVSTT SGSGGTTYYA DSVKGRFTIS RDSPKNTLYL101 QMNSLRAEDT AVYYCAARGY SYGTTPYEYW GQGTLVTVSS ASTKGPSVFP151 LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS201 GLYSLSSVVT VPSSSLGTKT YTCNVDHKPS NTKVDKRVES KYGPPCPSCP251 APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD301 GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS351 SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE401 WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE451 ALHNHYTQKS LSLSLGK
SEQ ID NO.116.14.2κ轻链核苷酸序列1atggacatga gggtccccgc tcagctcctg gggctcctgc tactctggct51ccgaggggcc agatgtGACA TCCAGATGAC CCAGTCTCCA TCCTCCCTGT101 CTGCATCTGT AGGAGACAGA GTCACCATCA CTTGCCGGGC AAGTCGGAGC151 ATTAGCAGCT ATTTAAATTG GTATCAGCAG AAACCAGGGA AAGCCCCTAA201 AGTCCTGATC TTTTTTGTGT CCAGTTTGCA AAGTGGGGTC CCATCAAGGT251 TCAGTGGCAG TGGCTCTGGG ACAGATTTCA CTCTCACCAT CAGCAGTCTG301 CAACCTGAAG ATTTTGCAAC TTACTACTGT CAACAGAATT ACATTCCCCC351 TATTACCTTC GGCCAGGGGA CACGACTGGA GATCAGACGA ACTGTGGCTG401 CACCATCTGT CTTCATCTTC CCGCCATCTG ATGAGCAGTT GAAATCTGGA451 ACTGCCTCTG TTGTGTGCCT GCTGAATAAC TTCTATCCCA GAGAGGCCAA501 AGTACAGTGG AAGGTGGATA ACGCCCTCCA ATCGGGTAAC TCCCAGGAGA551 GTGTCACAGA GCAGGACAGC AAGGACAGCA CCTACAGCCT CAGCAGCACC601 CTGACGCTGA GCAAAGCAGA CTACGAGAAA CACAAAGTCT ACGCCTGCGA651 AGTCACCCAT CAGGGCCTGA GCTCGCCCGT CACAAAGAGC TTCAACAGGG701 GAGAGTGTTA GSEQ ID NO.126.14.2预测的κ轻链蛋白质序列1mdmrvpaqllgllllwlrga rcDIQMTQSP SSLSASVGDR VTITCRASRS51 ISSYLNWYQQ KPGKAPKVLI FFVSSLQSGV PSRFSGSGSG TDFTLTISSL101 QPEDFATYYC QQNYIPPITF GQGTRLEIRR TVAAPSVFIF PPSDEQLKSG151 TASVVCLLNN FYPREAKVQW KVDNALQSGN SQESVTEQDS KDSTYSLSST202 LTLSKADYEK HKVYACEVTH QGLSSPVTKS FNRGEC
SEQ ID NO.136.22.2重链核苷酸序列1atggagtttg ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt taagaggtgt51ccagtgtCAG GTGCAGCTGG TGGAGTCTGG GGGAGGCGTG GTCCAGCCTG101 GGAGGTCCCT GAGACTCTCC TGTGCAGCGT CTGGACACAC CTTCAGTAGC151 GATGGCATGC ACTGGGTCCG CCAGGCTCCA GGCAAGGGGC TGGAGTGGGT201 GGCAATTATA TGGTATGATG GAAGTAATAA ATATTATGCA GACTCCGTGA251 AGGGCCGATT CACCATCTCC AGAGACAATT CCAAGAACAC GCTGTATCTG301 CAAATGAACA GCCTGAGAGC CGAGGACACG GCTGTATATT ACTGTGCGAG351 AGATCCCGGC TACTATTACG GTATGGACGT CTGGGGCCAA GGGACCACGG401 TCACCGTCTC CTCAGCTTCC ACCAAGGGCC CATCCGTCTT CCCCCTGGCG451 CCCTGCTCCA GGAGCACCTC CGAGAGCACA GCCGCCCTGG GCTGCCTGGT501 CAAGGACTAC TTCCCCGAAC CGGTGACGGT GTCGTGGAAC TCAGGCGCCC551 TGACCAGCGG CGTGCACACC TTCCCGGCTG TCCTACAGTC CTCAGGACTC601 TACTCCCTCA GCAGCGTGGT GACCGTGCCC TCCAGCAGCT TGGGCACGAA651 GACCTACACC TGCAACGTAG ATCACAAGCC CAGCAACACC AAGGTGGACA701 AGAGAGTTGA GTCCAAATAT GGTCCCCCAT GCCCATCATG CCCAGCACCT751 GAGTTCCTGG GGGGACCATC AGTCTTCCTG TTCCCCCCAA AACCCAAGGA801 CACTCTCATG ATCTCCCGGA CCCCTGAGGT CACGTGCGTG GTGGTGGACG851 TGAGCCAGGA AGACCCCGAG GTCCAGTTCA ACTGGTACGT GGATGGCGTG901 GAGGTGCATA ATGCCAAGAC AAAGCCGCGG GAGGAGCAGT TCAACAGCAC951 GTACCGTGTG GTCAGCGTCC TCACCGTCCT GCACCAGGAC TGGCTGAACG1001 GCAAGGAGTA CAAGTGCAAG GTCTCCAACA AAGGCCTCCC GTCCTCCATC1051 GAGAAAACCA TCTCCAAAGC CAAAGGGCAG CCCCGAGAGC CACAGGTGTA1101 CACCCTGCCC CCATCCCAGG AGGAGATGAC CAAGAACCAG GTCAGCCTGA1151 CCTGCCTGGT CAAAGGCTTC TACCCCAGCG ACATCGCCGT GGAGTGGGAG1201 AGCAATGGGC AGCCGGAGAA CAACTACAAG ACCGCGCCTC CCGTGCTGGA1251 CTCCGACGGC TCCTTCTTCC TCTACAGCAG GCTAACCGTG GACAAGAGCA1301 GGTGGCAGGA GGGGAATGTC TTCTCATGCT CCGTGATGCA TGAGGCTCTG1351 CACAACCACT ACACACAGAA GAGCCTCTCC CTGTCTCTGG GTAAATGASEQ ID NO.146.22.2预测的重链蛋白质序列1mefglswvflvallrgvqcQ VQLVESGGGV VQPGRSLRLS CAASGHTFSS51 DGMHWVRQAP GKGLEWVAII WYDGSNKYYA DSVKGRFTIS RDNSKNTLYL101 QMNSLRAEDT AVYYCARDPG YYYGMDVWGQ GTTVTVSSAS TKGPSVFPLA151 PCSRSTSEST AALGCLVKDY FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL201 YSLSSVVTVP SSSLGTKTYT CNVDHKPSNT KVDKRVESKY GPPCPSCPAP251 EFLGGPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV VVDVSQEDPE VQFNWYVDGV301 EVHNAKTKPR EEQFNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKGLPSSI351 EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSQEEMTKNQ VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE401 SNGQPENNYK TAPPVLDSDG SFFLYSRLTV DKSRWQEGNV FSCSVMHEAL451 HNHYTQKSLS LSLGK
SEQ ID NO.156.22.2κ轻链核苷酸序列1atgttgccat cacaactcat tgggtttctg ctgctctggg ttccagcttc51caggggtGAA ATTGTGCTGA CTCAGTCTCC AGACTTTCAG TCTGTGACTC101 CAAAAGAGAA AGTCACCATC ACCTGCCGGG CCAGTCAGAG AATTGGTAGT151 AGCTTACACT GGTACCAGCA GAAACCAGAT CAGTCTCCAA AACTCCTCAT201 CAAGTATGCT TCCCAGTCCT TCTCAGGGGT CCCCTCGAGG TTCAGTGGCA251 GTGGATCTGG GACAAATTTC ACCCTCACCA TCAATGGCCT GGAAGCTGAA301 GATGCTGCAA CTTATTACTG TCATCAGAGT GGTCGTTTAC CGCTCACTTT351 CGGCGGAGGG ACCAAGGTGG AGATCAAACG AACTGTGGCT GCACCATCTG401 TCTTCATCTT CCCGCCATCT GATGAGCAGT TGAAATCTGG AACTGCCTCT451 GTTGTGTGCC TGCTGAATAA CTTCTATCCC AGAGAGGCCA AAGTACAGTG501 GAAGGTGGAT AACGCCCTCC AATCGGGTAA CTCCCAGGAG AGTGTCACAG551 AGCAGGACAG CAAGGACAGC ACCTACAGCC TCAGCAGCAC CCTGACGCTG601 AGCAAAGCAG ACTACGAGAA ACACAAAGTC TACGCCTGCG AAGTCACCCA651 TCAGGGCCTG AGCTCGCCCG TCACAAAGAG CTTCAACAGG GGAGAGTGTT701 AGTGASEQ ID NO.166.22.2预测的κ轻链蛋白质序列1mlpsqligfl llwvpasrgE IVLTQSPDFQ SVTPKEKVTI TCRASQRIGS51 SLHWYQQKPD QSPKLLIKYA SQSFSGVPSR FSGSGSGTNF TLTINGLEAE101 DAATYYCHQS GRLPLTFGGG TKVEIKRTVA APSVFIFPPS DEQLKSGTAS151 VVCLLNNFYP REAKVQWKVD NALQSGNSQE SVTEQDSKDS TYSLSSTLTL201 SKADYEKHKV YACEVTHQGL SSPVTKSFNR GEC
SEQ ID NO.176.34.2重链核苷酸序列1atggagtttg ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt taagaggtgt51ccagtgtCAG GTGCAGCTGG TGGAGTCTGG GGGAGGCGTG GTCCAGCCTG101 GGAGGTCCCT GAGACTCTCC TGTGCAGCCT CTGGATTCAC CTTCAGTAGC151 TATGGCATGC ACTGGGTCCG CCAGGCTCCA GGCAAGGGGC TGGAGTGGGT201 GGCAGTTATA TCAAATGATG GAAATAATAA ATACTATGCA GACTCCGTGA251 AGGGCCGATT CACCATCTCC AGAGACAATT CCAAAAACAC GCTGTATCTG301 CAAATGAACA GCCTGAGCGC TGAGGACACG GCTGTGTATT ACTGTGCGAG351 AGATAGTACG GCGATAACCT ACTACTACTA CGGAATGGAC GTCTGGGGCC401 AAGGGACCAC GGTCACCGTC TCCTCAGCTT CCACCAAGGG CCCATCCGTC451 TTCCCCCTGG CGCCCTGCTC CAGGAGCACC TCCGAGAGCA CAGCCGCCCT501 GGGCTGCCTG GTCAAGGACT ACTTCCCCGA ACCGGTGACG GTGTCGTGGA551 ACTCAGGCGC CCTGACCAGC GGCGTGCACA CCTTCCCGGC TGTCCTACAG601 TCCTCAGGAC TCTACTCCCT CAGCAGCGTG GTGACCGTGC CCTCCAGCAG651 CTTGGGCACG AAGACCTACA CCTGCAACGT AGATCACAAG CCCAGCAACA701 CCAAGGTGGA CAAGAGAGTT GAGTCCAAAT ATGGTCCCCC ATGCCCATCA751 TGCCCAGCAC CTGAGTTCCT GGGGGGACCA TCAGTCTTCC TGTTCCCCCC801 AAAACCCAAG GACACTCTCA TGATCTCCCG GACCCCTGAG GTCACGTGCG851 TGGTGGTGGA CGTGAGCCAG GAAGACCCCG AGGTCCAGTT CAACTGGTAC901 GTGGATGGCG TGGAGGTGCA TAATGCCAAG ACAAAGCCGC GGGAGGAGCA951 GTTCAACAGC ACGTACCGTG TGGTCAGCGT CCTCACCGTC CTGCACCAGG1001 ACTGGCTGAA CGGCAAGGAG TACAAGTGCA AGGTCTCCAA CAAAGGCCTC1051 CCGTCCTCCA TCGAGAAAAC CATCTCCAAA GCCAAAGGGC AGCCCCGAGA1101 GCCACAGGTG TACACCCTGC CCCCATCCCA GGAGGAGATG ACCAAGAACC1151 AGGTCAGCCT GACCTGCCTG GTCAAAGGCT TCTACCCCAG CGACATCGCC1201 GTGGAGTGGG AGAGCAATGG ACAGCCGGAG AACAACTACA AGACCACGCC1251 TCCCGTGCTG GACTCCGACG GCTCCTTCTT CCTCTACAGC AGGCTAACCG1301 TGGACAAGAG CAGGTGGCAG GAGGGGAATG TCTTCTCATG CTCCGTGATG1351 CATGAGGCTC TGCACAACCA CTACACACAG AAGAGCCTCT CCCTGTCTCT1401 GGGTAAATGASEQ ID NO.186.34.2预测的重链蛋白质序列1mefglswvfl vallrgvqcQ VQLVESGGGV VQPGRSLRLS CAASGFTFSS51 YGMHWVRQAP GKGLEWVAVI SNDGNNKYYA DSVKGRFTIS RDNSKNTLYL101 QMNSLSAEDT AVYYCARDST AITYYYYGMD VWGQGTTVTV SSASTKGPSV151 FPLAPCSRST SESTAALGCL VKDYFPEPVT VSWNSGALTS GVHTFPAVLQ201 SSGLYSLSSV VTVPSSSLGT KTYTCNVDHK PSNTKVDKRV ESKYGPPCPS251 CPAPEFLGGP SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVVVDVSQ EDPEVQFNWY301 VDGVEVHNAK TKPREEQFNS TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKGL351 PSSIEKTISK AKGQPREPQV YTLPPSQEEM TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA401 VEWESNGQPE NNYKTTPPVL DSDGSFFLYS RLTVDKSRWQ EGNVFSCSVM451 HEALHNHYTQ KSLSLSLGK
SEQ ID NO.196.34.2κ轻链核苷酸序列1tggacatga gggtccccgc tcagctcctg gggctcctgc tactctggct51ccgaggtgcc agatgtGACA TCCAGATGAC CCAGTCTCCA TCCTCCCTGT101 CTGCATCTGT CGGAGACAGA GTCACCATCA CTTGCCGGGC AAGTCAGAAT151 ATTAGTAGCT ATTTAAATTG GTTTCAGCAG AAACCAGGGA AAGCCCCTAA201 GCTCCTGATC TATGCTGCAT CCGGTTTGAA GCGTGGGGTC CCATCACGGT251 TCAGTGGTAG TGGATCTGGG ACAGATTTCA CTCTCACCAT CAGGACTCTG301 CAACCTGATG ATTTTGCAAC TTACTCCTGT CACCAGAGTT ACAGTCTCCC351 ATTCACTTTC GGCCCTGGGA CCAAAGTGGA TATCAAACGA ACTGTGGCTG401 CACCATCTGT CTTCATCTTC CCGCCATCTG ATGAGCAGTT GAAATCTGGA451 ACTGCCTCTG TTGTGTGCCT GCTGAATAAC TTCTATCCCA GAGAGGCCAA501 AGTACAGTGG AAGGTGGATA ACGCCCTCCA ATCGGGTAAC TCCCAGGAGA551 GTGTCACAGA GCAGGACAGC AAGGACAGCA CCTACAGCCT CAGCAGCACC601 CTGACGCTGA GCAAAGCAGA CTACGAGAAA CACAAAGTCT ACGCCTGCGA651 AGTCACCCAT CAGGGCCTGA GCTCGCCCGT CACAAAGAGC TTCAACAGGG701 GAGAGTGTTA GTGASEQ ID NO.206.34.2预测的κ轻链蛋白质序列1mdmrvpaqllgllllwlrga rcDIQMTQSP SSLSASVGDR VTITCRASQN51 ISSYLNWFQQ KPGKAPKLLI YAASGLKRGV PSRFSGSGSG TDFTLTIRTL101 QPDDFATYSC HQSYSLPFTF GPGTKVDIKR TVAAPSVFIF PPSDEQLKSG151 TASVVCLLNN FYPREAKVQW KVDNALQSGN SQESVTEQDS KDSTYSLSST201 LTLSKADYEK HKVYACEVTH QGLSSPVTKS FNRGEC
SEQ ID NO.216.67.1重链核苷酸序列1atgaaacacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcagctc ccagatgggt51cctgtccCAG GTGCAGCTGC AGGAGTCGGG CCCAGGACTG GTGAAGCCTT101 CGGAGACCCT GTCCCTCACC TGCACTGTCT CTGGTGACTC CATCAGTAGT151 AACTATTGGA GCTGGATCCG GCAGCCCGCC GGGAAGGGAC TGGAGTGGAT201 TGGGCGTATC TATACCAGTG GGGGCACCAA CTCCAACCCC TCCCTCAGGG251 GTCGAGTCAC CATTTTAGCA GACACGTCCA AGAACCAGTT CTCTCTGAAA301 CTGAGTTCTG TGACCGCCGC GGACACGGCC GTGTATTACT GTGCGAGAGA351 TCGTATTACT ATAATTCGGG GACTTATTCC ATCCTTCTTT GACTACTGGG401 GCCAGGGAAC CCTGGTCACC GTCTCCTCAG CTTCCACCAA GGGCCCATCC451 GTCTTCCCCC TGGCGCCCTG CTCCAGGAGC ACCTCCGAGA GCACAGCCGC501 CCTGGGCTGC CTGGTCAAGG ACTACTTCCC CGAACCGGTG ACGGTGTCGT551 GGAACTCAGG CGCCCTGACC AGCGGCGTGC ACACCTTCCC GGCTGTCCTA601 CAGTCCTCAG GACTCTACTC CCTCAGCAGC GTGGTGACCG TGCCCTCCAG651 CAGCTTGGGC ACGAAGACCT ACACCTGCAA CGTAGATCAC AAGCCCAGCA701 ACACCAAGGT GGACAAGAGA GTTGAGTCCA AATATGGTCC CCCATGCCCA751 TCATGCCCAG CACCTGAGTT CCTGGGGGGA CCATCAGTCT TCCTGTTCCC801 CCCAAAACCC AAGGACACTC TCATGATCTC CCGGACCCCT GAGGTCACGT851 GCGTGGTGGT GGACGTGAGC CAGGAAGACC CCGAGGTCCA GTTCAACTGG901 TACGTGGATG GCGTGGAGGT GCATAATGCC AAGACAAAGC CGCGGGAGGA951 GCAGTTCAAC AGCACGTACC GTGTGGTCAG CGTCCTCACC GTCCTGCACC1001 AGGACTGGCT GAACGGCAAG GAGTACAAGT GCAAGGTCTC CAACAAAGGC1051 CTCCCGTCCT CCATCGAGAA AACCATCTCC AAAGCCAAAG GGCAGCCCCG1101 AGAGCCACAG GTGTACACCC TGCCCCCATC CCAGGAGGAG ATGACCAAGA1151 ACCAGGTCAG CCTGACCTGC CTGGTCAAAG GCTTCTACCC CAGCGACATC1201 GCCGTGGAGT GGGAGAGCAA TGGGCAGCCG GAGAACAACT ACAAGACCAC1251 GCCTCCCGTG CTGGACTCCG ACGGCTCCTT CTTCCTCTAC AGCAGGCTAA1301 CCGTGGACAA GAGCAGGTGG CAGGAGGGGA ATGTCTTCTC ATGCTCCGTG1351 ATGCATGAGG CTCTGCACAA CCACTACACA CAGAAGAGCC TCTCCCTGTC1401 TCTGGGTAAA TGASEO ID NO.226.67.1预测的重链蛋白质序列1mkhlwfflll vaaprwvlsQ VQLQESGPGL VKPSETLSLT CTVSGDSISS51 NYWSWIRQPA GKGLEWIGRI YTSGGTNSNP SLRGRVTILA DTSKNQFSLK101 LSSVTAADTA VYYCARDRIT IIRGLIPSFF DYWGQGTLVT VSSASTKGPS151 VFPLAPCSRS TSESTAALGC LVKDYFPEPV TVSWNSGALT SGVHTFPAVL201 QSSGLYSLSS VVTVPSSSLG TKTYTCNVDH KPSNTKVDKR VESKYGPPCP251 SCPAPEFLGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS QEDPEVQFNW301 YVDGVEVHNA KTKPREEQFN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKG351 LPSSIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSQEE MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI401 AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SRLTVDKSRW QEGNVFSCSV451 MHEALHNHYT QKSLSLSLGK
SEQ ID NO.236.67.1κ轻链核苷酸序列1atggtgttgc agacccaggt cttcatttct ctgttgctct ggatctctgg51tgcctacgggGACATCGTGA TGACCCAGTC TCCAGACTCC CTGGCTGTGT101 CTCTGGGCGA GAGGGCCACC ATCAACTGCA AGTCCAGCCA GAGTGTTTTA151 TACAGCTCCA ACAATAAGAC CTACTTAGCT TGGTACCAAC AGAAACCAAG201 ACAGCCTCCT AAATTGCTCA TTTACTGGGC ATCTATACGG GAATATGGGG251 TCCCTGACCG ATTCAGTGGC AGCGGGTCTG GGACAGATTT CACTCTCACC301 ATCAGCAGCC TGCAGGCTGA AGATGTGGCA GTTTATTTCT GTCAACAATA351 TTATAGTATT CCTCCCCTCA CTTTCGGCGG AGGGACCAAG GTGGAGATCA401 AACGAACTGT GGCTGCACCA TCTGTCTTCA TCTTCCCGCC ATCTGATGAG451 CAGTTGAAAT CTGGAACTGC CTCTGTTGTG TGCCTGCTGA ATAACTTCTA501 TCCCAGAGAG GCCAAAGTAC AGTGGAAGGT GGATAACGCC CTCCAATCGG551 GTAACTCCCA GGAGAGTGTC ACAGAGCAGG ACAGCAAGGA CAGCACCTAC601 AGCCTCAGCA GCACCCTGAC GCTGAGCAAA GCAGACTACG AGAAACACAA651 AGTCTACGCC TGCGAAGTCA CCCATCAGGG CCTGAGCTCG CCCGTCACAA701 AGAGCTTCAA CAGGGGAGAG TGTTAGTGASEQ ID NO.246.67.1预测的κ轻链蛋白质序列1mvlqtqvfis lllwisgaygDIVMTQSPDS LAVSLGERAT INCKSSQSVL51 YSSNNKTYLA WYQQKPRQPP KLLIYWASIR EYGVPDRFSG SGSGTDFTLT101 ISSLQAEDVA VYFCQQYYSI PPLTFGGGTK VEIKRTVAAP SVFIFPPSDE151 QLKSGTASVV CLLNNFYPRE AKVQWKVDNA LQSGNSQESV TEQDSKDSTY201 SLSSTLTLSK ADYEKHKVYA CEVTHQGLSS PVTKSFNRGE C
SEQ ID NO.256.73.2重链核苷酸序列1atggagtttg ggctgagctg gctttttctt gtggctattt taaaaggtgt51ccagtgtGAG GTGCAGCTGT TGGAGTCTGG GGGAGACTTG GTCCAGCCTG101 GGGGGTCCCT GAGACTCTCC TGTGCAGCCT CTGGATTCAC CTTTAGAAGT151 TATGCCATGA ACTGGGTCCG ACAGGCTCCA GGGAAGGGGC TGGAGTGGGT201 CTCAGTTATT AGTGGTCGTG GTGGTACTAC ATACTACGCA GACTCCGTGA251 AGGGCCGGTT CACCATCTCC AGAGACAATT CCAAGAACAC GCTGTATCTG301 CAAATGAACA GCCTGAGAGC CGAGGACGCG GCCGTATATT ACTGTGCGAA351 GATAGCAGTG GCTGGAGAGG GGCTCTACTA CTACTACGGT ATGGACGTCT401 GGGGCCAAGG GACCACGGTC ACCGTCTCCT CAGCTTCCAC CAAGGGCCCA451 TCCGTCTTCC CCCTGGCGCC CTGCTCCAGG AGCACCTCCG AGAACACAGC501 CGCCCTGGGC TGCCTGGTCA AGGACTACTT CCCCGAACCG GTGACGGTGT551 CGTGGAACTC AGGCGCCCTG ACCAGCGGCG TGCACACCTT CCCGGCTGTC601 CTACAGTCCT CAGGACTCTA CTCCCTCAGC AGCGTGGTGA CCGTGCCCTC651 TAGCAGCTTG GGCACGAAGA CCTACACCTG CAACGTAGAT CACAAGCCCA701 GCAACACCAA GGTGGACAAG AGAGTTGAGT CCAAATATGG TCCCCCATGC751 CCATCATGCC CAGCACCTGA GTTCCTGGGG GGACCATCAG TCTTCCTGTT801 CCCCCCAAAA CCCAAGGACA CTCTCATGAT CTCCCGGACC CCTGAGGTCA851 CGTGCGTGGT GGTGGACGTG AGCCAGGAAG ACCCCGAGGT CCAGTTCAAC901 TGGTACGTGG ATGGCGTGGA GGTGCATAAT GCCAAGACAA AGCCGCGGGA951 GGAGCAGTTC AACAGCACGT ACCGTGTGGT CAGCGTCCTC ACCGTCCTGC1001 ACCAGGACTG GCTGAACGGC AAGGAGTACA AGTGCAAGGT CTCCAACAAA1051 GGCCTCCCGT CCTCCATCGA GAAAACCATC TCCAAAGCCA AAGGGCAGCC1101 CCGAGAGCCA CAGGTGTACA CCCTGCCCCC ATCCCAGGAG GAGATGACCA1151 AGAACCAGGT CAGCCTGACC TGCCTGGTCA AAGGCTTCTA CCCCAGCGAC1201 ATCGCCGTGG AGTGGGAGAG CAATGGGCAG CCGGAGAACA ACTACAAGAC1251 CACGCCTCCC GTGCTGGACT CCGACGGCTC CTTCTTCCTC TACAGCAGGC1301 TAACCGTGGA CAAGAGCAGG TGGCAGGAGG GGAATGTCTT CTCATGCTCC1351 GTGATGCATG AGGCTCTGCA CAACCACTAC ACACAGAAGA GCCTCTCCCT1401 GTCTCTGGGT AAATGATAGSEQ ID NO.266.73.2预测的重链蛋白质序列1mefglswlfl vailkgvqcE VQLLESGGDL VQPGGSLRLS CAASGFTFRS51 YAMNWVRQAP GKGLEWVSVI SGRGGTTYYA DSVKGRFTIS RDNSKNTLYL101 QMNSLRAEDA AVYYCAKIAV AGEGLYYYYG MDVWGQGTTV TVSSASTKGP151 SVFPLAPCSR STSENTAALG CLVKDYFPEP VTVSWNSGAL TSGVHTFPAV201 LQSSGLYSLS SVVTVPSSSL GTKTYTCNVD HKPSNTKVDK RVESKYGPPC251 PSCPAPEFLG GPSVFLFPPK PKDTLMISRT PEVTCVVVDV SQEDPEVQFN301 WYVDGVEVHN AKTKPREEQF NSTYRVVSVL TVLHQDWLNG KEYKCKVSNK351 GLPSSIEKTI SKAKGQPREP QVYTLPPSQE EMTKNQVSLT CLVKGFYPSD401 IAVEWESNGQ PENNYKTTPP VLDSDGSFFL YSRLTVDKSR WQEGNVFSCS451 VMHEALHNHY TQKSLSLSLG K
SEQ ID NO.276.73.2κ轻链核苷酸序列1atggacatga gggtccccgc tcagctcctg gggctcctgc tactctggct51ccgaggtgcc agatgtGACA TCCAGATGAC CCAGTCTCCA TCCTCCCTGT101 CTGCATCTGT AGGTGACAGA GTCACCTTCA CTTGCCGGGC AAGTCAGAAC151 ATTACCAACT ATTTAAATTG GTATCAGCAG AAACCAGGGA AGGCCCCTAA201 GCTCCTGATC TATGCTGCGT CCAGTTTGCC AAGAGGGGTC CCATCAAGGT251 TCCGTGGCAG TGGATCTGGG ACAGATTTCA CTCTCACCAT CAGCAGTCTG301 CAACCTGAAG ATTTTGCAAC TTACTACTGT CAACAGAGTT ACAGTAATCC351 TCCGGAGTGC GGTTTTGGCC AGGGGACCAC GCTGGATATC AAACGAACTG401 TGGCTGCACC ATCTGTCTTC ATCTTCCCGC CATCTGATGA GCAGTTGAAA451 TCTGGAACTG CCTCTGTTGT GTGCCTGCTG AATAACTTCT ATCCCAGAGA501 GGCCAAAGTA CAGTGGAAGG TGGATAACGC CCTCCAATCG GGTAACTCCC551 AGGAGAGTGT CACAGAGCAG GACAGCAAGG ACAGCACCTA CAGCCTCAGC601 AGCACCCTGA CGCTGAGCAA AGCAGACTAC GAGAAACACA AAGTCTACGC651 CTGCGAAGTC ACCCATCAGG GCCTGAGCTC GCCCGTCACA AAGAGCTTCA701 ACAGGGGAGA GTGTTAGTGASEQ ID NO.286.73.2预测的κ轻链蛋白质序列1mdmrvpagll gllllwlrga rcDIQMTQSP SSLSASVGDR VTFTCRASQN51 ITNYLNWYQQ KPGKAPKLLI YAASSLPRGV PSRFRGSGSG TDFTLTISSL101 QPEDFATYYC QQSYSNPPEC GFGQGTTLDI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK151 SGTASVVCLL NNFYPREAKV QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS201 STLTLSKADY EKHKVYACEV THQGLSSPVT KSFNRGEC
SEQ ID NO.296.77.1重链核苷酸序列1atggaactgg ggctccgctg ggttttcctt gttgctattt tagaaggtgt51ccagtgtGAG GTGCAGCTGG TGGAGTCTGG GGGAGGCCTG GTCAAGCCTG101 GGGGGTCCCT GAGACTCTCC TGTGCAGCCT CTGGATTCAC CTTCAGTAGC151 TATAGCATGA ACTGGGTCCG CCAGGCTCCA GGGAAGGGGC TGGAGTGGGT201 CTCATCCATT AGTAGTAGTA GTAGTTACAT ATACTACGCA GACTCAGTGA251 AGGGCCGATT CACCATCTCC AGAGACAACG CCAAGAACTC ACTGTATCTG301 CAAATGAACA GCCTGAGAGC CGAGGACACG GCTGTGTATT ACTGTGCGAG351 AGATGGGTAT AGCAGTGGCT GGTCCTACTA CTACTACTAC GGTATGGACG401 TCTGGGGCCA AGGGACCACG GTCACCGTCT CCTCAGCTTC CACCAAGGGC451 CCATCCGTCT TCCCCCTGGC GCCCTGCTCC AGGAGCACCT CCGAGAGCAC501 AGCCGCCCTG GGCTGCCTGG TCAAGGACTA CTTCCCCGAA CCGGTGACGG551 TGTCGTGGAA CTCAGGCGCC CTGACCAGCG GCGTGCACAC CTTCCCGGCT601 GTCCTACAGT CCTCAGGACT CTACTCCCTC AGCAGCGTGG TGACCGTGCC651 CTCCAGCAGC TTGGGCACGA AGACCTACAC CTGCAACGTA GATCACAAGC701 CCAGCAACAC CAAGGTGGAC AAGAGAGTTG AGTCCAAATA TGGTCCCCCA751 TGCCCATCAT GCCCAGCACC TGAGTTCCTG GGGGGACCAT CAGTCTTCCT801 GTTCCCCCCA AAACCCAAGG ACACTCTCAT GATCTCCCGG ACCCCTGAGG851 TCACGTGCGT GGTGGTGGAC GTGAGCCAGG AAGACCCCGA GGTCCAGTTC901 AACTGGTACG TGGATGGCGT GGAGGTGCAT AATGCCAAGA CAAAGCCGCG951 GGAGGAGCAG TTCAACAGCA CGTACCGTGT GGTCAGCGTC CTCACCGTCC1001 TGCACCAGGA CTGGCTGAAC GGCAAGGAGT ACAAGTGCAA GGTCTCCAAC1051 AAAGGCCTCC CGTCCTCCAT CGAGAAAACC ATCTCCAAAG CCAAAGGGCA1101 GCCCCGAGAG CCACAGGTGT ACACCCTGCC CCCATCCCAG GAGGAGATGA1151 CCAAGAACCA GGTCAGCCTG ACCTGCCTGG TCAAAGGCTT CTACCCCAGC1201 GACATCGCCG TGGAGTGGGA GAGCAATGGG CAGCCGGAGA ACAACTACAA1251 GACCACGCCT CCCGTGCTGG ACTCCGACGG CTCCTTCTTC CTCTACAGCA1301 GGCTAACCGT GGACAAGAGC AGGTGGCAGG AGGGGAATGT CTTTTCACGC1351 TCCGTGATGC ATGAGGCTCT GCACAACCAC TACACACAGA AGAGCCTCTC1401 CCTGTCTCTG GGTAAATGAT AGGAATTCTG ATGASEQ ID NO.306.77.1预测的重链蛋白质序列1melglrwvfl vailegvqcE VQLVESGGGL VKPGGSLRLS CAASGFTFSS51 YSMNWVRQAP GKGLEWVSSI SSSSSYIYYA DSVKGRFTIS RDNAKNSLYL101 QMNSLRAEDT AVYYCARDGY SSGWSYYYYY GMDVWGQGTT VTVSSASTKG151 PSVFPLAPCS RSTSESTAAL GCLVKDYFPE PVTVSWNSGA LTSGVHTFPA201 VLQSSGLYSL SSVVTVPSSS LGTKTYTCNV DHKPSNTKVD KRVESKYGPP251 CPSCPAPEFL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVD VSQEDPEVQF301 NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ FNSTYRVVSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN351 KGLPSSIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSQ EEMTKNQVSL TCLVKGFYPS401 DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSRLTVDKS RWQEGNVFSR451 SVMHEALHNH YTQKSLSLSL GK
SEQ ID NO.316.77.1κ轻链核苷酸序列1atgaggctcc ctgctcagct cctggggctg ctaatgctct ggatacctgg51atccagtgcaGATATTGTGA TGACCCAGAC TCCACTCTCT CTGTCCGTCA101 CTCCTGGACA GCCGGCCTCC ATCTCCTGCA ACTCTAGTCA GAGCCTCCTG151 CTTAGTGATG GAAAGACCTA TTTGAATTGG TACCTGCAGA AGCCCGGCCA201 GCCTCCACAG CTCCTGATCT ATGAAGTTTC CAACCGGTTC TCTGGAGTGC251 CAGACAGGTT CAGTGGCAGC GGGTCAGGGA CAGATTTCAC ACTGAAAATC301 AGCCGGGTGG AGGCTGAGGA TGTTGGGGTT TATTCCTGCA TGCAAAGTAT351 ACAGCTTATG TGCAGTTTTG GCCAGGGGAC CAAGCTGGAG ATCAAACGAA401 CTGTGGCTGC ACCATCTGTC TTCATCTTCC CGCCATCTGA TGAGCAGTTG451 AAATCTGGAA CTGCCTCTGT TGTGTGCCTG CTGAATAACT TCTATCCCAG501 AGAGGCCAAA GTACAGTGGA AGGTGGATAA CGCCCTCCAA TCGGGTAACT551 CCCAGGAGAG TGTCACAGAG CAGGACAGCA AGGACAGCAC CTACAGCCTC601 AGCAGCACCC TGACGCTGAG CAAAGCAGAC TACGAGAAAC ACAAAGTCTA651 CGCCTGCGAA GTCACCCATC AGGGCCTGAG CTCGCCCGTC ACAAAGAGCT701 TCAACAGGGG AGAGTGTTAG TGASEQ ID NO.326.77.1预测的κ轻链蛋白质序列1mrlpaqllgl lmlwipgssaDIVMTQTPLS LSVTPGQPAS ISCNSSQSLL51 LSDGKTYLNW YLQKPGQPPQ LLIYEVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI101 SRVEAEDVGV YSCMQSIQLM CSFGQGTKLE IKRTVAAPSV FIFPPSDEQL151 KSGTASVVCL LNNFYPREAK VQWKVDNALQ SGNSQESVTE QDSKDSTYSL201 SSTLTLSKAD YEKHKVYACE VTHQGLSSPV TKSFNRGEC
SEQ ID NO.337.16.6重链核苷酸序列1atggactgga cctggagcat ccttttcttg gtggcagcag caacaggtgc51ccactccCAG GTTCAGCTGG TGCAGTCTGG AGCTGAGGTG AAGAAGCCTG101 GGGCCTCAGT GAAGGTCTCC TGCAAGGCTT CTGGTTACAC CTTTACCAGC151 TATGGTATCA ACTGGGTGCG ACAGGCCCCT GGACAAGGGC TTGAGTGGAT201 GGGATGGATC AGCGTTTACA GTGGTAACAC AAACTATGCA CAGAAGGTCC251 AGGGCAGAGT CACCATGACC GCAGACACAT CCACGAGCAC AGCCTACATG301 GACCTGAGGA GCCTGAGATC TGACGACACG GCCGTGTATT ACTGTGCGAG351 AGAGGGTAGC AGCTCGTCCG GAGACTACTA TTACGGTATG GACGTCTGGG401 GCCAAGGGAC CACGGTCACC GTCTCCTCAG CCTCCACCAA GGGCCCATCG451 GTCTTCCCCC TGGCGCCCTG CTCCAGGAGC ACCTCCGAGA GCACAGCGGC501 CCTGGGCTGC CTGGTCAAGG ACTACTTCCC CGAACCGGTG ACGGTGTCGT551 GGAACTCAGG CGCTCTGACC AGCGGCGTGC ACACCTTCCC AGCTGTCCTA601 CAGTCCTCAG GACTCTACTC CCTCAGCAGC GTGGTGACCG TGCCCTCCAG651 CAACTTCGGC ACCCAGACCT ACACCTGCAA CGTAGATCAC AAGCCCAGCA701 ACACCAAGGT GGACAAGACA GTTGAGCGCA AATGTTGTGT CGAGTGCCCA751 CCGTGCCCAG CACCACCTGT GGCAGGACCG TCAGTCTTCC TCTTCCCCCC801 AAAACCCAAG GACACCCTCA TGATCTCCCG GACCCCTGAG GTCACGTGCG851 TGGTGGTGGA CGTGAGCCAC GAAGACCCCG AGGTCCAGTT CAACTGGTAC901 GTGGACGGCG TGGAGGTGCA TAATGCCAAG ACAAAGCCAC GGGAGGAGCA951 GTTCAACAGC ACGTTCCGTG TGGTCAGCGT CCTCACCGTT GTGCACCAGG1001 ACTGGCTGAA CGGCAAGGAG TACAAGTGCA AGGTCTCCAA CAAAGGCCTC1051 CCAGCCCCCA TCGAGAAAAC CATCTCCAAA ACCAAAGGGC AGCCCCGAGA1101 ACCACAGGTG TACACCCTGC CCCCATCCCG GGAGGAGATG ACCAAGAACC1151 AGGTCAGCCT GACCTGCCTG GTCAAAGGCT TCTACCCCAG CGACATCGCC1201 GTGGAGTGGG AGAGCAATGG GCAGCCGGAG AACAACTACA AGACCACACC1251 TCCCATGCTG GACTCCGACG GCTCCTTCTT CCTCTACAGC AAGCTCACCG1301 TGGACAAGAG CAGGTGGCAG CAGGGGAACG TCTTCTCATG CTCCGTGATG1351 CATGAGGCTC TGCACAACCA CTACACGCAG AAGAGCCTCT CCCTGTCTCC1401 GGGTAAATGASEQ ID NO.347.16.6预测的重链蛋白质序列1mdwtwsilfl vaaatgahsQ VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGYTFTS51 YGINWVRQAP GQGLEWMGWI SVYSGNTNYA QKVQGRVTMT ADTSTSTAYM101 DLRSLRSDDT AVYYCAREGS SSSGDYYYGM DVWGQGTTVT VSSASTKGPS151 VFPLAPCSRS TSESTAALGC LVKDYFPEPV TVSWNSGALT SGVHTFPAVL201 QSSGLYSLSS VVTVPSSNFG TQTYTCNVDH KPSNTKVDKT VERKCCVECP251 PCPAPPVAGP SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVQFNWY301 VDGVEVHNAK TKPREEQFNS TFRVVSVLTV VHQDWLNGKE YKCKVSNKGL351 PAPIEKTISK TKGQPREPQV YTLPPSREEM TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA401 VEWESNGQPE NNYKTTPPML DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM451 HEALHNHYTQ KSLSLSPGK
SEQ ID NO.357.16.6κ轻链核甘酸序列1atgaggctcc ctgctcagct cctggggctg ctaatgctct ggatacctgg51atccagtgcaGATATTGTGA TGACCCAGAC TCCACTCTCT CTGTCCGTCA101 CCCCTGGACA GCCGGCCTCC ATCTCCTGCA AGTCTAGTCA GAGCCTCCTG151 CATACTGATG GAACGACCTA TTTGTATTGG TACCTGCAGA AGCCAGGCCA201 GCCTCCACAG CTCCTGATCT ATGAAGTTTC CAACCGGTTC TCTGGAGTGC251 CAGATAGGTT CAGTGGCAGC GGGTCAGGGA CAGATTTCAC ACTGAAAATC301 AGCCGGGTGG AGGCTGAGGA TGTTGGGATT TATTACTGCA TGCAAAATAT351 ACAGCTTCCG TGGACGTTCG GCCAAGGGAC CAAGGTGGAA ATCAAACGAA401 CTGTGGCTGC ACCATCTGTC TTCATCTTCC CGCCATCTGA TGAGCAGTTG451 AAATCTGGAA CTGCCTCTGT TGTGTGCCTG CTGAATAACT TCTATCCCAG501 AGAGGCCAAA GTACAGTGGA AGGTGGATAA CGCCCTCCAA TCGGGTAACT551 CCCAGGAGAG TGTCACAGAG CAGGACAGCA AGGACAGCAC CTACAGCCTC601 AGCAGCACCC TGACGCTGAG CAAAGCAGAC TACGAGAAAC ACAAAGTCTA651 CGCCTGCGAA GTCACCCATC AGGGCCTGAG CTCGCCCGTC ACAAAGAGCT701 TCAACAGGGG AGAGTGTTAG TGASEQ ID NO.367.16.6κ轻链蛋白质序列1mrlpaqllgl lmlwipgssaDIVMTQTPLS LSVTPGQPAS ISCKSSQSLL51 HTDGTTYLYW YLQKPGQPPQ LLIYEVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI101 SRVEAEDVGI YYCMQNIQLP WTFGQGTKVE IKRTVAAPSV FIFPPSDEQL151 KSGTASVVCL LNNFYPREAK VQWKVDNALQ SGNSQESVTE QDSKDSTYSL201 SSTLTLSKAD YEKHKVYACE VTHQGLSSPV TKSFNRGEC
SEQ ID NO.377.20.5重链核苷酸序列1atgaaacacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcagctc ccagatgggt51cctgtccCAG GTGCAGCTGC AGGAGTCGGG CCCAGGACTG GTGAAGCCTT101 CGGAGACCCT GTCCCTCACC TGCACTGTCT CTGGTAGCTC CATCAGTAGT151 TACCACTGGA ACTGGATCCG GCAGCCCGCC GGGAAGGGAC TGGAGTGGAT201 TGGGCGTATC TATACCAGTG GGAGCACCAA CTACAACCCC TCCCTCAAGA251 GTCGAGTCAC CATGTCACTA GACACGTCCA AGAACCAGTT CTCCCTGAAG301 CTGAGCTCTG TGACCGCCGC GGACACGGCC GTGTATTACT GTGCGAGAGA351 GGGGGTCAGG TATTACTATG CTTCGGGGAG TTATTACTAC GGTCTGGACG401 TCTGGGGCCA AGGGACCACG GTCACCGTCT CCTCAGCCTC CACCAAGGGC451 CCATCGGTCT TCCCCCTGGC GCCCTGCTCC AGGAGCACCT CCGAGAGCAC501 AGCGGCCCTG GGCTGCCTGG TCAAGGACTA CTTCCCCGAA CCGGTGACGG551 TGTCGTGGAA CTCAGGCGCT CTGACCAGCG GCGTGCACAC CTTCCCAGCT601 GTCCTACAGT CCTCAGGACT CTACTCCCTC AGCAGCGTGG TGACCGTGCC651 CTCCAGCAAC TTCGGCACCC AGACCTACAC CTGCAACGTA GATCACAAGC701 CCAGCAACAC CAAGGTGGAC AAGACAGTTG AGCGCAAATG TTGTGTCGAG751 TGCCCACCGT GCCCAGCACC ACCTGTGGCA GGACCGTCAG TCTTCCTCTT801 CCCCCCAAAA CCCAAGGACA CCCTCATGAT CTCCCGGACC CCTGAGGTCA851 CGTGCGTGGT GGTGGACGTG AGCCACGAAG ACCCCGAGGT CCAGTTCAAC901 TGGTACGTGG ACGGCGTGGA GGTGCATAAT GCCAAGACAA AGCCACGGGA951 GGAGCAGTTC AACAGCACGT TCCGTGTGGT CAGCGTCCTC ACCGTTGTGC1001 ACCAGGACTG GCTGAACGGC AAGGAGTACA AGTGCAAGGT CTCCAACAAA1051 GGCCTCCCAG CCCCCATCGA GAAAACCATC TCCAAAACCA AAGGGCAGCC1101 CCGAGAACCA CAGGTGTACA CCCTGCCCCC ATCCCGGGAG GAGATGACCA1151 AGAACCAGGT CAGCCTGACC TGCCTGGTCA AAGGCTTCTA CCCCAGCGAC1201 ATCGCCGTGG AGTGGGAGAG CAATGGGCAG CCGGAGAACA ACTACAAGAC1251 CACACCTCCC ATGCTGGACT CCGACGGCTC CTTCTTCCTC TACAGCAAGC1301 TCACCGTGGA CAAGAGCAGG TGGCAGCAGG GGAACGTCTT CTCATGCTCC1351 GTGATGCATG AGGCTCTGCA CAACCACTAC ACGCAGAAGA GCCTCTCCCT1401 GTCTCCGGGT AAATGASEQ ID NO.387.20.5预测的重链蛋白质序列1mkhlwfflll vaaprwvlsQ VQLQESGPGL VKPSETLSLT CTVSGSSISS51 YHWNWIRQPA GKGLEWIGRI YTSGSTNYNP SLKSRVTMSL DTSKNQFSLK101 LSSVTAADTA VYYCAREGVR YYYASGSYYY GLDVWGQGTT VTVSSASTKG151 PSVFPLAPCS RSTSESTAAL GCLVKDYFPE PVTVSWNSGA LTSGVHTFPA201 VLQSSGLYSL SSVVTVPSSN FGTQTYTCNV DHKPSNTKVD KTVERKCCVE251 CPPCPAPPVA GPSVFLFPPK PKDTLMISRT PEVTCVVVDV SHEDPEVQFN301 WYVDGVEVHN AKTKPREEQF NSTFRVVSVL TVVHQDWLNG KEYKCKVSNK351 GLPAPIEKTI SKTKGQPREP QVYTLPPSRE EMTKNQVSLT CLVKGFYPSD401 IAVEWESNGQ PENNYKTTPP MLDSDGSFFL YSKLTVDKSR WQQGNVFSCS451 VMHEALHNHY TQKSLSLSPG K
SEQ ID NO.397.20.5κ轻链核苷酸序列1atgaggctcc ctgctcagct cctggggctg ctaatgctct gggtctctgg51atccagtgggGATATTGTGA TGACTCAGTC TCCACTCTCC CTGCCCGTCA101 CCCCTGGAGA GCCGGCCTCC ATCTCCTGCA GGTCTAGTCA GAGCCTCCTG151 CATGGTAATG GATACAACTA TTTGGATTGG TACCTGCAGA AGCCAGGGCA201 GTCTCCACAG CTCCTGATCT ATTTGGGTTC TAATCGGGCC TCCGGGGTCC251 CTGACAGGTT CAGTGGCAGT GGATCAGGCA CAGATTTTAC ACTGAAAATC301 AGCAGAGTGG AGGCTGAGGA TGTTGGGGTT TATTACTGCA TGCAAGCTCT351 ACAAACTCTC ACTTTCGGCG GAGGGACCAA GGTGGAGATC AAACGAACTG401 TGGCTGCACC ATCTGTCTTC ATCTTCCCGC CATCTGATGA GCAGTTGAAA451 TCTGGAACTG CCTCTGTTGT GTGCCTGCTG AATAACTTCT ATCCCAGAGA501 GGCCAAAGTA CAGTGGAAGG TGGATAACGC CCTCCAATCG GGTAACTCCC551 AGGAGAGTGT CACAGAGCAG GACAGCAAGG ACAGCACCTA CAGCCTCAGC601 AGCACCCTGA CGCTGAGCAA AGCAGACTAC GAGAAACACA AAGTCTACGC651 CTGCGAAGTC ACCCATCAGG GCCTGAGCTC GCCCGTCACA AAGAGCTTCA701 ACAGGGGAGA GTGTTAGTGASEQ ID NO.407.20.5预测的κ轻链蛋白质序列1mrlpaqllgl lmlwvsgssgDIVMTQSPLS LPVTPGEPAS ISCRSSQSLL51 HGNGYNYLDW YLQKPGQSPQ LLIYLGSNRA SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI101 SRVEAEDVGV YYCMQALQTL TFGGGTKVEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK151 SGTASVVCLL NNFYPREAKV QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS201 STLTLSKADY EKHKVYACEV THQGLSSPVT KSFNRGEC
SEQ ID NO.417.26.4重链核苷酸序列1atggactgga cctggagcat ccttttcttg gtggcagcag caacaggtgc51ccactccCAG GTTCAGCTGG TGCAGTCTGG AGCTGAGGTG AAGAAGCCTG451 GTCTTCCCCC TGGCGCCCTG CTCCAGGAGC ACCTCCGAGA GCACAGCGGC501 CCTGGGCTGC CTGGTCAAGG ACTACTTCCC CGAACCGGTG ACGGTGTCGT551 GGAACTCAGG CGCTCTGACC AGCGGCGTGC ACACCTTCCC AGCTGTCCTA601 CAGTCCTCAG GACTCTACTC CCTCAGCAGC GTGGTGACCG TGCCCTCCAG651 CAACTTCGGC ACCCAGACCT ACACCTGCAA CGTAGATCAC AAGCCCAGCA701 ACACCAAGGT GGACAAGACA GTTGAGCGCA AATGTTGTGT CGAGTGCCCA751 CCGTGCCCAG CACCACCTGT GGCAGGACCG TCAGTCTTCC TCTTCCCCCC801 AAAACCCAAG GACACCCTCA TGATCTCCCG GACCCCTGAG GTCACGTGCG851 TGGTGGTGGA CGTGAGCCAC GAAGACCCCG AGGTCCAGTT CAACTGGTAC901 GTGGACGGCG TGGAGGTGCA TAATGCCAAG ACAAAGCCAC GGGAGGAGCA951 GTTCAACAGC ACGTTCCGTG TGGTCAGCGT CCTCACCGTT GTGCACCAGG1001 ACTGGCTGAA CGGCAAGGAG TACAAGTGCA AGGTCTCCAA CAAAGGCCTC1051 CCAGCCCCCA TTGAGAAAAC CATCTCCAAA ACCAAAGGGC AGCCCCGAGA1101 ACCACAGGTG TACACCCTGC CCCCATCCCG GGAGGAGATG ACCAAGAACC1151 AGGTCAGCCT GACCTGCCTG GTCAAAGGCT TCTACCCCAG CGACATCGCC1201 GTGGAGTGGG AGAGCAATGG GCAGCCGGAG AACAACTACA AGACCACACC1251 TCCCATGCTG GACTCCGACG GCTCCTTCTT CCTCTACAGC AAGCTCACCG1301 TGGACAAGAG CAGGTGGCAG CAGGGGAACG TCTTCTCATG CTCCGTGATG1351 CATGAGGCTC TGCACAACCA CTACACGCAG AAGAGCCTCT CCCTGTCTCC1402 GGGTAAATGASEQ ID NO.427.26.4预测的重链蛋白质序列1mdwtwsilfl vaaatgahsQ VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CEASGYTFTS51 YGIDWVRQAP GQGLEWMGWI SVYSGNTNYA QKLQGRVTMS TDTSTSTAYM101 ELRSLRSDDT AVYYCAREGS SSSGDYYYGM DVWGQGTTVT VSSASTKGPS151 VFPLAPCSRS TSESTAALGC LVKDYFPEPV TVSWNSGALT SGVHTFPAVL201 QSSGLYSLSS VVTVPSSNFG TQTYTCNVDH KPSNTKVDKT VERKCCVECP251 PCPAPPVAGP SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVQFNWY301 VDGVEVHNAK TKPREEQFNS TFRVVSVLTV VHQDWLNGKE YKCKVSNKGL351 PAPIEKTISK TKGQPREPQV YTLPPSREEM TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA401 VEWESNGQPE NNYKTTPPML DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM451 HEALHNHYTQ KSLSLSPGK
SEQ ID NO.437.26.4κ轻链核苷酸序列1atgaggctcc ctgctcagct cctggggctg ctaatgctct ggatacctgg51atccagtgcgGATATTGTGA TGACCCAGAC TCCACTCTCT CTGTCCGTCA101 CCCCTGGACA GCCGGCCTCC ATCTCCTGCA AGTCTAATCA GAGCCTCCTG151 TATAGTGATG GAAAGACCTA TTTGTTTTGG TACCTGCAGA AGCCAGGCCA201 GCCTCCACAG CTCCTGATCT ATGAAGTTTC CAACCGATTC TCTGGAGTGC251 CAGATAGGTT CAGTGGCAGC GGGTCAGGGA CAGATTTCAC ACTGAAAATC301 AGCCGGGTGG AGGCTGAGGA TGTTGGGGTT TATTACTGCA TGCAAAGTAT351 ACAGCTTCCG TGGACGTTCG GCCAAGGGAC CAAGGTGGAA ATCAAACGAA401 CTGTGGCTGC ACCATCTGTC TTCATCTTCC CGCCATCTGA TGAGCAGTTG451 AAATCTGGAA CTGCCTCTGT TGTGTGCCTG CTGAATAACT TCTATCCCAG501 AGAGGCCAAA GTACAGTGGA AGGTGGATAA CGCCCTCCAA TCGGGTAACT551 CCCAGGAGAG TGTCACAGAG CAGGACAGCA AGGACAGCAC CTACAGCCTC601 AGCAGCACCC TGACGCTGAG CAAAGCAGAC TACGAGAAAC ACAAAGTCTA651 CGCCTGCGAA GTCACCCATC AGGGCCTGAG CTCGCCCGTC ACAAAGAGCT701 TCAACAGGGG AGAGTGTTAG TGASEQ ID NO.447.26.4预测的κ轻链蛋白质序列1mrlpaqllgl lmlwipgssaDIVMTQTPLS LSVTPGQPAS ISCKSNQSLL51 YSDGKTYLFW YLQKPGQPPQ LLIYEVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI101 SRVEAEDVGV YYCMQSIQLP WTFGQGTKVE IKRTVAAPSV FIFPPSDEQL151 KSGTASVVCL LNNFYPREAK VQWKVDNALQ SGNSQESVTE QDSKDSTYSL201 SSTLTLSKAD YEKHKVYACE VTHQGLSSPV TKSFNRGEC
SEQ ID NO.459.8.2重链核苷酸序列1atggagtttg ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt taagaggtgt51ccagtgtCAG GTGCAGCTGG TGGAGTCTGG GGGAGGCGTG GTCCAGCCTG101 GGAGGTCCCT GAGACTCTCC TGTGCAGCGT CTGGATTCAC CTTCAGTAGC151 TATGGCATGC ACTGGGTCCG CCAGGCTCCA GGCAAGGGGC TGGAGTGGGT201 GGCAGTTATA TGGTATGATG GAAGTAATGA ATACTATGCA GACTCCGTGA251 AGGGCCGATT CACCATCTCC AGAGACAATT CCAAGAACAC GCTGTATCTG301 CAAATGAACA GCCTGAGAGC CGAGGACACG GCTGTGTATT ACTGTGCGAG351 GGGGGCGTAC CACTTTGCCT ACTGGGGCCA GGGAACCCTG GTCACCGTCT401 CCTCAGCTTC CACCAAGGGC CCATCCGTCT TCCCCCTGGC GCCCTGCTCC451 AGGAGCACCT CCGAGAGCAC AGCCGCCCTG GGCTGCCTGG TCAAGGACTA501 CTTCCCCGAA CCGGTGACGG TGTCGTGGAA CTCAGGCGCC CTGACCAGCG551 GCGTGCACAC CTTCCCGGCT GTCCTACAGT CCTCAGGACT CTACTCCCTC601 AGCAGCGTGG TGACCGTGCC CTCCAGCAGC TTGGGCACGA AGACCTACAC651 CTGCAACGTA GATCACAAGC CCAGCAACAC CAAGGTGGAC AAGAGAGTTG701 AGTCCAAATA TGGTCCCCCA TGCCCATCAT GCCCAGCACC TGAGTTCCTG751 GGGGGACCAT CAGTCTTCCT GTTCCCCCCA AAACCCAAGG ACACTCTCAT801 GATCTCCCGG ACCCCTGAGG TCACGTGCGT GGTGGTGGAC GTGAGCCAGG851 AAGACCCCGA GGTCCAGTTC AACTGGTACG TGGATGGCGT GGAGGTGCAT901 AATGCCAAGA CAAAGCCGCG GGAGGAGCAG TTCAACAGCA CGTACCGTGT951 GGTCAGCGTC CTCACCGTCC TGCACCAGGA CTGGCTGAAC GGCAAGGAGT1001 ACAAGTGCAA GGTCTCCAAC AAAGGCCTCC CGTCCTCCAT CGAGAAAACC1051 ATCTCCAAAG CCAAAGGGCA GCCCCGAGAG CCACAGGTGT ACACCCTGCC1101 CCCATCCCAG GAGGAGATGA CCAAGAACCA GGTCAGCCTG ACCTGCCTGG1151 TCAAAGGCTT CTACCCCAGC GACATCGCCG TGGAGTGGGA GAGCAATGGG1201 CAGCCGGAGA ACAACTACAA GACCACGCCT CCCGTGCTGG ACTCCGACGG1251 CTCCTTCTTC CTCTACAGCA GGCTAACCGT GGACAAGAGC AGGTGGCAGG1301 AGGGGAATGT CTTCTCATGC TCCGTGATGC ATGAGGCTCT GCACAACCAC1351 TACACACAGA AGAGCCTCTC CCTGTCTCTG GGTAAATGASEQ ID NO.469.8.2预测的重链蛋白质序列1mefglswvfl vallrgvqcQ VQLVESGGGV VQPGRSLRLS CAASGFTFSS51 YGMHWVRQAP GKGLEWVAVI WYDGSNEYYA DSVKGRFTIS RDNSKNTLYL101 QMNSLRAEDT AVYYCARGAY HFAYWGQGTL VTVSSASTKG PSVFPLAPCS151 RSTSESTAAL GCLVKDYFPE PVTVSWNSGA LTSGVHTFPA VLQSSGLYSL201 SSVVTVPSSS LGTKTYTCNV DHKPSNTKVD KRVESKYGPP CPSCPAPEFL251 GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVD VSQEDPEVQF NWYVDGVEVH301 NAKTKPREEQ FNSTYRVVSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KGLPSSIEKT351 ISKAKGQPRE PQVYTLPPSQ EEMTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG401 QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSRLTVDKS RWQEGNVFSC SVMHEALHNH451 YTQKSLSLSL GK
SEQ ID NO.479.8.2κ轻链核苷酸序列1atggacatga gggtccctgc tcagctcctg gggctcctgc tgctctggct51ctcagtcgca ggtgccagat gtGACATCCA GATGACCCAG TCTCCATCCT101 CCCTGTCTGC ATCTGTAGGA GACAGAGTCA CCATCACTTG CCAGGCGAGT151 CAGGACATTA GCAACTATTT AAATTGGTAT CAGCAGAAAC CAGGGAAAGC201 CCCTAAGCTC CTGATCTACG ATGCATCCAA TTTGGAAACA GGGGTCCCAT251 CAAGGTTCAG TGGAAGTGGA TCTGGGACAG ATTTTACTTT CACCATCAGC301 AGCCTGCAGC CTGAAGATAT TGCAACATAT TCCTGTCAAC ACTCTGATAA351 TCTCTCGATC ACCTTCGGCC AGGGGACACG ACTGGAGATT AAACGAACTG401 TGGCTGCACC ATCTGTCTTC ATCTTCCCGC CATCTGATGA GCAGTTGAAA451 TCTGGAACTG CCTCTGTTGT GTGCCTGCTG AATAACTTCT ACCCCAGAGA501 GGCCAAAGTA CAGTGGAAGG TGGATAACGC CCTCCAATCG GGTAACTCCC551 AGGAGAGTGT CACAGAGCAG GACAGCAAGG ACAGCACCTA CAGCCTCAGC601 AGCACCCTGA CGCTGAGCAA AGCAGACTAC GAGAAACACA AAGTCTACGC651 CTGCGAAGTC ACCCATCAGG GCCTGAGCTC GCCCGTCACA AAGAGCTTCA701 ACAGGGGAGA GTGTTAGTGASEQ ID NO.489.8.2预测的κ轻链蛋白质序列1mdmrvpaqll gllllwlsva garcDIQMTQ SPSSLSASVG DRVTITCQAS51 QDISNYLNWY QQKPGKAPKL LIYDASNLET GVPSRFSGSG SGTDFTFTIS101 SLQPEDIATY SCQHSDNLSI TFGQGTRLEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK151 SGTASVVCLL NNFYPREAKV QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS201 STLTLSKADY EKHKVYACEV THQGLSSPVT KSFNRGEC
SEQ ID NO.49短尾猴MAdCAMα4β7结合结构域的核苷酸序列1ATGGATCGGG GCCTGGCCCT CCTGCTGGCG GGGCTTCTGG GGCTCCTCCA51 GCCGGGCTGC GGCCAGTCCC TCCAGGTGAA GCCCCTGCAG GTGGAGCCCC101 CGGAGCCGGT GGTGGCCGTG GCCCTGGGCG CCTCTCGCCA GCTCACCTGC151 CGCCTGGACT GCGCGGACGG CGGGGCCACG GTGCAGTGGC GGGGCCTGGA201 CACCAGCCTG GGCGCGGTGC AGTCGGACGC GGGCCGCAGC GTCCTCACCG501 GGGCCCGGAG GTGGAGGAGG AGGAGGAGCC CCAGGAGGAG GAGGACGTGC551 TGTTCAGGGT GACAGAGCGC TGGCGGCTGC CGACCCTGGC AACCCCTGTC601 CTGCCCGCGC TCTACTGCCA GGCCACGATG AGGCTGCCTG GCTTGGAGCT651 CAGCCACCGC CAGGCCATCC CGGTCCTGCA CSEQ ID NO.50短尾猴MAdCAMα4β7结合结构域的氨基酸序列1MDRGLALLLA GLLGLLQPGC GQSLQVKPLQ VEPPEPVVAV ALGASRQLTC51 RLDCADGGAT VQWRGLDTSL GAVQSDAGRS VLTVRNASLS AAGTRVCVGS101 CGGRTFQHTV RLLVYAFPDQ LTISPAALVP GDPEVACTAH KVTPVDPNAL151 SFSLLLGDQE LEGAQALGPE VEEEEEPQEE EDVLFRVTER WRLPTLATPV201 LPALYCQATM RLPGLELSHR QAIPVLH
SEQ ID NO.51经修饰的6.22.2重链核苷酸序列1atggagtttg ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt taagaggtgt51ccagtgtCAG GTGCAGCTGG TGGAGTCTGG GGGAGGCGTG GTCCAGCCTG101 GGAGGTCCCT GAGACTCTCC TGTGCAGCGT CTGGATTCAC CTTCAGTAGC151 GATGGCATGC ACTGGGTCCG CCAGGCTCCA GGCAAGGGGC TGGAGTGGGT201 GGCAATTATA TGGTATGATG GAAGTAATAA ATATTATGCA GACTCCGTGA251 AGGGCCGATT CACCATCTCC AGAGACAATT CCAAGAACAC GCTGTATCTG301 CAAATGAACA GCCTGAGAGC CGAGGACACG GCTGTATATT ACTGTGCGAG351 AGATCCCGGC TACTATTACG GTATGGACGT CTGGGGCCAA GGGACCACGG401 TCACCGTCTC CTCAGCTTCC ACCAAGGGCC CATCCGTCTT CCCCCTGGCG451 CCCTGCTCTA GAAGCACCTC CGAGAGCACA GCGGCCCTGG GCTGCCTGGT501CAAGGACTAC TTCCCCGAAC CGGTGACGGT GTCGTGGAAC TCAGGCGCTC551TGACCAGCGG CGTGCACACC TTCCCAGCTG TCCTACAGTC CTCAGGACTC601TACTCCCTCA GCAGCGTGGT GACCGTGCCC TCCAGCAACT TCGGCACCCA651GACCTACACC TGCAACGTAG ATCACAAGCC CAGCAACACC AAGGTGGACA701AGACAGTTGA GCGCAAATGT TGTGTCGAGT GCCCACCGTG CCCAGCACCA751CCTGTGGCAG GACCGTCAGT CTTCCTCTTC CCCCCAAAAC CCAAGGACAC801CCTCATGATC TCCCGGACCC CTGAGGTCAC GTGCGTGGTG GTGGACGTGA851GCCACGAAGA CCCCGAGGTC CAGTTCAACT GGTACGTGGA CGGCGTGGAG901GTGCATAATG CCAAGACAAA GCCACGGGAG GAGCAGTTCA ACAGCACGTT951CCGTGTGGTC AGCGTCCTCA CCGTTGTGCA CCAGGACTGG CTGAACGGCA1001AGGAGTACAA GTGCAAGGTC TCCAACAAAG GCCTCCCAGC CCCCATCGAG1051AAAACCATCT CCAAAACCAA AGGGCAGCCC CGAGAACCAC AGGTGTACAC1101CCTGCCCCCA TCCCGGGAGG AGATGACCAA GAACCAGGTC AGCCTGACCT1151GCCTGGTCAA AGGCTTCTAC CCCAGCGACA TCGCCGTGGA GTGGGAGAGC1201AATGGGCAGC CGGAGAACAA CTACAAGACC ACACCTCCCA TGCTGGACTC1251CGACGGCTCC TTCTTCCTCT ACAGCAAGCT CACCGTGGAC AAGAGCAGGT1301GGCAGCAGGG GAACGTCTTC TCATGCTCCG TGATGCATGA GGCTCTGCAC1351AACCACTACA CGCAGAAGAG CCTCTCCCTG TCTCCGGGTA AATGATAGSEQ ID NO.52经修饰的6.22.2重链氨基酸序列1mefglswvflvallrgvqcQ VQLVESGGGV VQPGRSLRLS CAASGFTFSS51 DGMHWVRQAP GKGLEWVAII WYDGSNKYYA DSVKGRFTIS RDNSKNTLYL101 QMNSLRAEDT AVYYCARDPG YYYGMDVWGQ GTTVTVSSAS TKGPSVFPLA151 PCSRSTSEST AALGCLVKDY FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL201YSLSSVVTVP SSNFGTQTYT CNVDHKPSNT KVDKTVERKC CVECPPCPAP251PVAGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV QFNWYVDGVE301VHNAKTKPRE EQFNSTFRVV SVLTVVHQDW LNGKEYKCKV SNKGLPAPIE351KTISKTKGQP REPQVYTLPP SREEMTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES401NGQPENNYKT TPPMLDSDGS FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH451NHYTQKSLSL SPGK
SEQ ID NO.53经修饰的6.22.2κ轻链核苷酸序列1atgttgccat cacaactcat tgggtttctg ctgctctggg ttccagcttc51caggggtGAA ATTGTGCTGA CTCAGTCTCC AGACTTTCAG TCTGTGACTC101 CAAAAGAGAA AGTCACCATC ACCTGCCGGG CCAGTCAGAG AATTGGTAGT151 AGCTTACACT GGTACCAGCA GAAACCAGAT CAGTCTCCAA AACTCCTCAT201 CAAGTATGCT TCCCAGTCCT TCTCAGGGGT CCCCTCGAGG TTCAGTGGCA251 GTGGATCTGG GACAGATTTC ACCCTCACCA TCAATAGCCT GGAAGCTGAA301 GATGCTGCAA CTTATTACTG TCATCAGAGT GGTCGTTTAC CGCTCACTTT351 CGGCGGAGGG ACCAAGGTGG AGATCAAACG AACTGTGGCT GCACCATCTG401 TCTTCATCTT CCCGCCATCT GATGAGCAGT TGAAATCTGG AACTGCCTCT451 GTTGTGTGCC TGCTGAATAA CTTCTATCCC AGAGAGGCCA AAGTACAGTG501 GAAGGTGGAT AACGCCCTCC AATCGGGTAA CTCCCAGGAG AGTGTCACAG551 AGCAGGACAG CAAGGACAGC ACCTACAGCC TCAGCAGCAC CCTGACGCTG601 AGCAAAGCAG ACTACGAGAA ACACAAAGTC TACGCCTGCG AAGTCACCCA651 TCAGGGCCTG AGCTCGCCCG TCACAAAGAG CTTCAACAGG GGAGAGTGTT701 AGTGASEQ ID NO.54经修饰的6.22.2κ轻链氨基酸序列1mlpsqligfl llwvpasrgE IVLTQSPDFQ SVTPKEKVTI TCRASQRIGS51 SLHWYQQKPD QSPKLLIKYA SQSFSGVPSR FSGSGSGTDF TLTINSLEAE101 DAATYYCHQS GRLPLTFGGG TKVEIKRTVA APSVFIFPPS DEQLKSGTAS151 VVCLLNNFYP REAKVQWKVD NALQSGNSQE SVTEQDSKDS TYSLSSTLTL201 SKADYEKHKV YACEVTHQGL SSPVTKSFNR GEC
SEQ ID NO.55经修饰的6.34.2重链核苷酸序列1atggagtttg ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt taagaggtgt51ccagtgtCAG GTGCAGCTGG TGGAGTCTGG GGGAGGCGTG GTCCAGCCTG101 GGAGGTCCCT GAGACTCTCC TGTGCAGCCT CTGGATTCAC CTTCAGTAGC151 TATGGCATGC ACTGGGTCCG CCAGGCTCCA GGCAAGGGGC TGGAGTGGGT201 GGCAGTTATA TCAAATGATG GAAATAATAA ATACTATGCA GACTCCGTGA251 AGGGCCGATT CACCATCTCC AGAGACAATT CCAAAAACAC GCTGTATCTG301 CAAATGAACA GCCTGCGCGC TGAGGACACG GCTGTGTATT ACTGTGCGAG351 AGATAGTACG GCGATAACCT ACTACTACTA CGGAATGGAC GTCTGGGGCC401 AAGGGACCAC GGTCACCGTC TCCTCAGCTT CCACCAAGGG CCCATCCGTC451 TTCCCCCTGG CGCCCTGCTC TAGAAGCACC TCCGAGAGCA CAGCGGCCCT501GGGCTGCCTG GTCAAGGACT ACTTCCCCGA ACCGGTGACG GTGTCGTGGA551ACTCAGGCGC TCTGACCAGC GGCGTGCACA CCTTCCCAGC TGTCCTACAG601TCCTCAGGAC TCTACTCCCT CAGCAGCGTG GTGACCGTGC CCTCCAGCAA651CTTCGGCACC CAGACCTACA CCTGCAACGT AGATCACAAG CCCAGCAACA701CCAAGGTGGA CAAGACAGTT GAGCGCAAAT GTTGTGTCGA GTGCCCACCG751TGCCCAGCAC CACCTGTGGC AGGACCGTCA GTCTTCCTCT TCCCCCCAAA801ACCCAAGGAC ACCCTCATGA TCTCCCGGAC CCCTGAGGTC ACGTGCGTGG851TGGTGGACGT GAGCCACGAA GACCCCGAGG TCCAGTTCAA CTGGTACGTG901GACGGCGTGG AGGTGCATAA TGCCAAGACA AAGCCACGGG AGGAGCAGTT951CAACAGCACG TTCCGTGTGG TCAGCGTCCT CACCGTTGTG CACCAGGACT1001GGCTGAACGG CAAGGAGTAC AAGTGCAAGG TCTCCAACAA AGGCCTCCCA1051GCCCCCATCG AGAAAACCAT CTCCAAAACC AAAGGGCAGC CCCGAGAACC1101ACAGGTGTAC ACCCTGCCCC CATCCCGGGA GGAGATGACC AAGAACCAGG1151TCAGCCTGAC CTGCCTGGTC AAAGGCTTCT ACCCCAGCGA CATCGCCGTG1201GAGTGGGAGA GCAATGGGCA GCCGGAGAAC AACTACAAGA CCACACCTCC1251CATGCTGGAC TCCGACGGCT CCTTCTTCCT CTACAGCAAG CTCACCGTGG1301ACAAGAGCAG GTGGCAGCAG GGGAACGTCT TCTCATGCTC CGTGATGCAT1351GAGGCTCTGC ACAACCACTA CACGCAGAAG AGCCTCTCCC TGTCTCCGGG1401TAAATGATAGSEQ ID NO.56经修饰的6.34.2重链氨基酸序列1mefglswvfl vallrgvqcQ VQLVESGGGV VQPGRSLRLS CAASGFTFSS51 YGMHWVRQAP GKGLEWVAVI SNDGNNKYYA DSVKGRFTIS RDNSKNTLYL101 QMNSLRAEDT AVYYCARDST AITYYYYGMD VWGQGTTVTV SSASTKGPSV151 FPLAPCSRST SESTAALGCL VKDYFPEPVT VSWNSGALTS GVHTFPAVLQ201SSGLYSLSSV VTVPSSNFGT QTYTCNVDHK PSNTKVDKTV ERKCCVECPP251CPAPPVAGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVQFNWYV301DGVEVHNAKT KPREEQFNST FRVVSVLTVV HQDWLNGKEY KCKVSNKGLP351APIEKTISKT KGQPREPQVY TLPPSREEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV401EWESNGQPEN NYKTTPPMLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH451EALHNHYTQK SLSLSPGK
SEQ ID NO.57经修饰的6.34.2κ轻链核苷酸序列1atggacatga gggtccccgc tcagctcctg gggctcctgc tactctggct51ccgaggtgcc agatgtGACA TCCAGATGAC CCAGTCTCCA TCCTCCCTGT101 CTGCATCTGT CGGAGACAGA GTCACCATCA CTTGCCGGGC AAGTCAGAGT151 ATTAGTAGCT ATTTAAATTG GTATCAGCAG AAACCAGGGA AAGCCCCTAA201 GCTCCTGATC TATGCTGCAT CCGGTTTGAA GCGTGGGGTC CCATCACGGT251 TCAGTGGTAG TGGATCTGGG ACAGATTTCA CTCTCACCAT CAGTTCTCTG301 CAACCTGAGG ATTTTGCAAC TTACTACTGT CACCAGAGTT ACAGTCTCCC351 ATTCACTTTC GGCCCTGGGA CCAAAGTGGA TATCAAACGA ACTGTGGCTG401 CACCATCTGT CTTCATCTTC CCGCCATCTG ATGAGCAGTT GAAATCTGGA451 ACTGCCTCTG TTGTGTGCCT GCTGAATAAC TTCTATCCCA GAGAGGCCAA501 AGTACAGTGG AAGGTGGATA ACGCCCTCCA ATCGGGTAAC TCCCAGGAGA551 GTGTCACAGA GCAGGACAGC AAGGACAGCA CCTACAGCCT CAGCAGCACC601 CTGACGCTGA GCAAAGCAGA CTACGAGAAA CACAAAGTCT ACGCCTGCGA651 AGTCACCCAT CAGGGCCTGA GCTCGCCCGT CACAAAGAGC TTCAACAGGG701 GAGAGTGTTA GTGASEQ ID NO.58经修饰的6.34.2κ轻链氨基酸序列1mdmrvpagll gllllwlrga rcDIQMTQSP SSLSASVGDR VTITCRASQS51 ISSYLNWYQQ KPGKAPKLLI YAASGLKRGV PSRFSGSGSG TDFTLTISSL101 QPEDFATYYC HQSYSLPFTF GPGTKVDIKR TVAAPSVFIF PPSDEQLKSG151 TASVVCLLNN FYPREAKVQW KVDNALQSGN SQESVTEQDS KDSTYSLSST201 LTLSKADYEK HKVYACEVTH QGLSSPVTKS FNRGEC
SEQ ID NO.59经修饰的6.67.1重链核苷酸序列1atgaaacacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcagctc ccagatgggt51cctgtccCAG GTGCAGCTGC AGGAGTCGGG CCCAGGACTG GTGAAGCCTT101 CGGAGACCCT GTCCCTCACC TGCACTGTCT CTGGTGACTC CATCAGTAGT151 AACTATTGGA GCTGGATCCG GCAGCCCGCC GGGAAGGGAC TGGAGTGGAT201 TGGGCGTATC TATACCAGTG GGGGCACCAA CTCCAACCCC TCCCTCAGGG251 GTCGAGTCAC CATGTCAGTA GACACGTCCA AGAACCAGTT CTCTCTGAAA301 CTGAGTTCTG TGACCGCCGC GGACACGGCC GTGTATTACT GTGCGAGAGA351 TCGTATTACT ATAATTCGGG GACTTATTCC ATCCTTCTTT GACTACTGGG401 GCCAGGGAAC CCTGGTCACC GTCTCCTCAG CTTCCACCAA GGGCCCATCC451 GTCTTCCCCC TGGCGCCCTG CTCTAGAAGC ACCTCCGAGA GCACAGCGGC501CCTGGGCTGC CTGGTCAAGG ACTACTTCCC CGAACCGGTG ACGGTGTCGT551GGAACTCAGG CGCTCTGACC AGCGGCGTGC ACACCTTCCC AGCTGTCCTA601CAGTCCTCAG GACTCTACTC CCTCAGCAGC GTGGTGACCG TGCCCTCCAG651CAACTTCGGC ACCCAGACCT ACACCTGCAA CGTAGATCAC AAGCCCAGCA701ACACCAAGGT GGACAAGACA GTTGAGCGCA AATGTTGTGT CGAGTGCCCA751CCGTGCCCAG CACCACCTGT GGCAGGACCG TCAGTCTTCC TCTTCCCCCC801AAAACCCAAG GACACCCTCA TGATCTCCCG GACCCCTGAG GTCACGTGCG851TGGTGGTGGA CGTGAGCCAC GAAGACCCCG AGGTCCAGTT CAACTGGTAC901GTGGACGGCG TGGAGGTGCA TAATGCCAAG ACAAAGCCAC GGGAGGAGCA951GTTCAACAGC ACGTTCCGTG TGGTCAGCGT CCTCACCGTT GTGCACCAGG1001ACTGGCTGAA CGGCAAGGAG TACAAGTGCA AGGTCTCCAA CAAAGGCCTC1051CCAGCCCCCA TCGAGAAAAC CATCTCCAAA ACCAAAGGGC AGCCCCGAGA1101ACCACAGGTG TACACCCTGC CCCCATCCCG GGAGGAGATG ACCAAGAACC1151AGGTCAGCCT GACCTGCCTG GTCAAAGGCT TCTACCCCAG CGACATCGCC1201GTGGAGTGGG AGAGCAATGG GCAGCCGGAG AACAACTACA AGACCACACC1251TCCCATGCTG GACTCCGACG GCTCCTTCTT CCTCTACAGC AAGCTCACCG1301TGGACAAGAG CAGGTGGCAG CAGGGGAACG TCTTCTCATG CTCCGTGATG1351CATGAGGCTC TGCACAACCA CTACACGCAG AAGAGCCTCT CCCTGTCTCC1401GGGTAAATGA TAGSEQ ID NO.60经修饰的6.67.1重链氨基酸序列1mkhlwfflll vaaprwvlsQ VQLQESGPGL VKPSETLSLT CTVSGDSISS51 NYWSWIRQPA GKGLEWIGRI YTSGGTNSNP SLRGRVTMSVDTSKNQFSLK101 LSSVTAADTA VYYCARDRIT IIRGLIPSFF DYWGQGTLVT VSSASTKGPS151 VFPLAPCSRS TSESTAALGC LVKDYFPEPV TVSWNSGALT SGVHTFPAVL201QSSGLYSLSS VVTVPSSNFG TQTYTCNVDH KPSNTKVDKT VERKCCVECP251PCPAGPVAGP SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVQFNWY301VDGVEVHNAK TKPREEQFNS TFRVVSVLTV VHQDWLNGKE YKCKVSNKGL351PAPIEKTISK TKGQPREPQV YTLPPSREEM TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA401VEWESNGQPE NNYKTTPPML DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM451HEALHNHYTQ KSLSLSPGK
SEQ ID NO.61经修饰的6.67.1κ轻链核苷酸序列1atggtgttgc agacccaggt cttcatttct ctgttgctct ggatctctgg51tgcctacgggGACATCGTGA TGACCCAGTC TCCAGACTCC CTGGCTGTGT101 CTCTGGGCGA GAGGGCCACC ATCAACTGCA AGTCCAGCCA GAGTGTTTTA151 TACAGCTCCA ACAATAAGAACTACTTAGCT TGGTACCAAC AGAAACCAGG201 ACAGCCTCCT AAATTGCTCA TTTACTGGGC ATCTATACGG GAATATGGGG251 TCCCTGACCG ATTCAGTGGC AGCGGGTCTG GGACAGATTT CACTCTCACC301 ATCAGCAGCC TGCAGGCTGA AGATGTGGCA GTTTATTTCT GTCAACAATA351 TTATAGTATT CCTCCCCTCA CTTTCGGCGG AGGGACCAAG GTGGAGATCA401 AACGAACTGT GGCTGCACCA TCTGTCTTCA TCTTCCCGCC ATCTGATGAG451 CAGTTGAAAT CTGGAACTGC CTCTGTTGTG TGCCTGCTGA ATAACTTCTA501 TCCCAGAGAG GCCAAAGTAC AGTGGAAGGT GGATAACGCC CTCCAATCGG551 GTAACTCCCA GGAGAGTGTC ACAGAGCAGG ACAGCAAGGA CAGCACCTAC601 AGCCTCAGCA GCACCCTGAC GCTGAGCAAA GCAGACTACG AGAAACACAA651 AGTCTACGCC TGCGAAGTCA CCCATCAGGG CCTGAGCTCG CCCGTCACAA701 AGAGCTTCAA CAGGGGAGAG TGTTAGTGASEQ ID NO.62经修饰的6.67.1κ轻链氨基酸序列1mvlqtqvfis lllwisgaygDIVMTQSPDS LAVSLGERAT INCKSSQSVL51 YSSNNKNYLA WYQQKPGQPP KLLIYWASIR EYGVPDRFSG SGSGTDFTLT101 ISSLQAEDVA VYFCQQYYSI PPLTFGGGTK VEIKRTVAAP SVFIFPPSDE151 QLKSGTASVV CLLNNFYPRE AKVQWKVDNA LQSGNSQESV TEQDSKDSTY201 SLSSTLTLSK ADYEKHKVYA CEVTHQGLSS PVTKSFNRGE C
SEQ ID NO.63经修饰的6.77.1重链核苷酸序列1atggaactgg ggctccgctg ggttttcctt gttgctattt tagaaggtgt51ccagtgtGAG GTGCAGCTGG TGGAGTCTGG GGGAGGCCTG GTCAAGCCTG101 GGGGGTCCCT GAGACTCTCC TGTGCAGCCT CTGGATTCAC CTTCAGTAGC151 TATAGCATGA ACTGGGTCCG CCAGGCTCCA GGGAAGGGGC TGGAGTGGGT201 CTCATCCATT AGTAGTAGTA GTAGTTACAT ATACTACGCA GACTCAGTGA251 AGGGCCGATT CACCATCTCC AGAGACAACG CCAAGAACTC ACTGTATCTG301 CAAATGAACA GCCTGAGAGC CGAGGACACG GCTGTGTATT ACTGTGCGAG351 AGATGGGTAT AGCAGTGGCT GGTCCTACTA CTACTACTAC GGTATGGACG401 TCTGGGGCCA AGGGACCACG GTCACCGTCT CCTCAGCTTC CACCAAGGGC451 CCATCCGTCT TCCCCCTGGC GCCCTGCTCT AGAAGCACCT CCGAGAGCAC501AGCGGCCCTG GGCTGCCTGG TCAAGGACTA CTTCCCCGAA CCGGTGACGG551TGTCGTGGAA CTCAGGCGCT CTGACCAGCG GCGTGCACAC CTTCCCAGCT601GTCCTACAGT CCTCAGGACT CTACTCCCTC AGCAGCGTGG TGACCGTGCC651CTCCAGCAAC TTCGGCACCC AGACCTACAC CTGCAACGTA GATCACAAGC701CCAGCAACAC CAAGGTGGAC AAGACAGTTG AGCGCAAATG TTGTGTCGAG751TGCCCACCGT GCCCAGCACC ACCTGTGGCA GGACCGTCAG TCTTCCTCTT801CCCCCCAAAA CCCAAGGACA CCCTCATGAT CTCCCGGACC CCTGAGGTCA851CGTGCGTGGT GGTGGACGTG AGCCACGAAG ACCCCGAGGT CCAGTTCAAC901TGGTACGTGG ACGGCGTGGA GGTGCATAAT GCCAAGACAA AGCCACGGGA951GGAGCAGTTC AACAGCACGT TCCGTGTGGT CAGCGTCCTC ACCGTTGTGC1001ACCAGGACTG GCTGAACGGC AAGGAGTACA AGTGCAAGGT CTCCAACAAA1051GGCCTCCCAG CCCCCATCGA GAAAACCATC TCCAAAACCA AAGGGCAGCC1101CCGAGAACCA CAGGTGTACA CCCTGCCCCC ATCCCGGGAG GAGATGACCA1151AGAACCAGGT CAGCCTGACC TGCCTGGTCA AAGGCTTCTA CCCCAGCGAC1201ATCGCCGTGG AGTGGGAGAG CAATGGGCAG CCGGAGAACA ACTACAAGAC1251CACACCTCCC ATGCTGGACT CCGACGGCTC CTTCTTCCTC TACAGCAAGC1301TCACCGTGGA CAAGAGCAGG TGGCAGCAGG GGAACGTCTT CTCATGCTCC1351GTGATGCATG AGGCTCTGCA CAACCACTAC ACGCAGAAGA GCCTCTCCCT1401GTCTCCGGGT AAATGATAGSEQ ID NO.64经修饰的6.77.1重链蛋白质序列1melglrwvfl vailegvqcE VQLVESGGGL VKPGGSLRLS CAASGFTFSS51 YSMNWVRQAP GKGLEWVSSI SSSSSYIYYA DSVKGRFTIS RDNAKNSLYL101 QMNSLRAEDT AVYYCARDGY SSGWSYYYYY GMDVWGQGTT VTVSSASTKG151 PSVFPLAPCS RSTSESTAAL GCLVKDYFPE PVTVSWNSGA LTSGVHTFPA201VLQSSGLYSL SSVVTVPSSN FGTQTYTCNV DHKPSNTKVD KTVERKCCVE251CPPCPAPPVA GPSVFLFPPK PKDTLMISRT PEVTCVVVDV SHEDPEVQFN301WYVDGVEVHN AKTKPREEQF NSTFRVVSVL TVVHQDWLNG KEYKCKVSNK351GLPAPIEKTI SKTKGQPREP QVYTLPPSRE EMTKNQVSLT CLVKGFYPSD401IAVEWESNGQ PENNYKTTPP MLDSDGSFFL YSKLTVDKSR WQQGNVFSCS451VMHEALHNHY TQKSLSLSPG K
SEQ ID NO.65经修饰的6.77.1κ轻链核苷酸序列1atgaggctcc ctgctcagct cctggggctg ctaatgctct ggatacctgg51atccagtgcaGATATTGTGA TGACCCAGAC TCCACTCTCT CTGTCCGTCA101 CTCCTGGACA GCCGGCCTCC ATCTCCTGCA AGTCTAGTCA GAGCCTCCTG151 CTTAGTGATG GAAAGACCTA TTTGAATTGG TACCTGCAGA AGCCCGGCCA201 GCCTCCACAG CTCCTGATCT ATGAAGTTTC CAACCGGTTC TCTGGAGTGC251 CAGACAGGTT CAGTGGCAGC GGGTCAGGGA CAGATTTCAC ACTGAAAATC301 AGCCGGGTGG AGGCTGAGGA TGTTGGGGTT TATTACTGCA TGCAAAGTAT351 ACAGCTTATG TGCAGTTTTG GCCAGGGGAC CAAGCTGGAG ATCAAACGAA401 CTGTGGCTGC ACCATCTGTC TTCATCTTCC CGCCATCTGA TGAGCAGTTG451 AAATCTGGAA CTGCCTCTGT TGTGTGCCTG CTGAATAACT TCTATCCCAG501 AGAGGCCAAA GTACAGTGGA AGGTGGATAA CGCCCTCCAA TCGGGTAACT551 CCCAGGAGAG TGTCACAGAG CAGGACAGCA AGGACAGCAC CTACAGCCTC601 AGCAGCACCC TGACGCTGAG CAAAGCAGAC TACGAGAAAC ACAAAGTCTA651 CGCCTGCGAA GTCACCCATC AGGGCCTGAG CTCGCCCGTC ACAAAGAGCT701 TCAACAGGGG AGAGTGTTAG TGASEQ ID NO.66经修饰的6.77.1κ轻链氨基酸序列1mrlpagllgl lmlwipgssaDIVMTQTPLS LSVTPGQPAS ISCKSSQSLL51 LSDGKTYLNW YLQKPGQPPQ LLIYEVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI101 SRVEAEDVGV YSCMQSIQLMSSFGQGTKLE IKRTVAADSV FIFPPSDEQL151 KSGTASVVCL LNNFYPREAK VQWKVDNALQ SGNSQESVTE QDSKDSTYSL201 SSTLTLSKAD YEKHKVYACE VTHQGLSSPV TKSFNRGEC
SEQ ID NO.67经修饰的7.26.4κ轻链核苷酸序列1atgaggctcc ctgctcagct cctggggctg ctaatgctct ggatacctgg51atccagtgcgGATATTGTGA TGACCCAGAC TCCACTCTCT CTGTCCGTCA101 CCCCTGGACA GCCGGCCTCC ATCTCCTGCA AGTCTAGTCA GAGCCTCCTG151 TATAGTGATG GAAAGACCTA TTTGTTTTGG TACCTGCAGA AGCCAGGCCA201 GCCTCCACAG CTCCTGATCT ATGAAGTTTC CAACCGATTC TCTGGAGTGC251 CAGATAGGTT CAGTGGCAGC GGGTCAGGGA CAGATTTCAC ACTGAAAATC301 AGCCGGGTGG AGGCTGAGGA TGTTGGGGTT TATTACTGCA TGCAAAGTAT351 ACAGCTTCCG TGGACGTTCG GCCAAGGGAC CAAGGTGGAA ATCAAACGAA401 CTGTGGCTGC ACCATCTGTC TTCATCTTCC CGCCATCTGA TGAGCAGTTG451 AAATCTGGAA CTGCCTCTGT TGTGTGCCTG CTGAATAACT TCTATCCCAG501 AGAGGCCAAA GTACAGTGGA AGGTGGATAA CGCCCTCCAA TCGGGTAACT551 CCCAGGAGAG TGTCACAGAG CAGGACAGCA AGGACAGCAC CTACAGCCTC601 AGCAGCACCC TGACGCTGAG CAAAGCAGAC TACGAGAAAC ACAAAGTCTA651 CGCCTGCGAA GTCACCCATC AGGGCCTGAG CTCGCCCGTC ACAAAGAGCT701 TCAACAGGGG AGAGTGTTAG TGASEQ ID NO.68经修饰的7.26.4κ轻链氨基酸序列1mrlpaqllgl lmlwipgssaDIVMTQTPLS LSVTPGQPAS ISCKSSQSLL51 YSDGKTYLFW YLQKPGQPPQ LLIYEVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI101 SRVEAEDVGV YYCMQSIQLP WTFGQGTKVE IKRTVAAPSV FIFPPSDEQL151 KSGTASVVCL LNNFYPREAK VQWKVDNALQ SGNSQESVTE QDSKDSTYSL201 SSTLTLSKAD YEKHKVYACE VTHQGLSSPV TKSFNRGEC
权利要求
1.特异性结合粘膜地址素细胞粘附分子(MAdCAM)的人单克隆抗体或其抗原结合部分。
2.根据权利要求1所述的人单克隆抗体或抗原结合部分，其中所述的抗体或部分具有至少一种下面的性质(a)结合人细胞；(b)对MAdCAM的选择性超过对VCAM或纤连蛋白至少100倍；(c)以3×10-10M或更小的Kd结合至人MAdCAM；或(d)抑制表达α4β7的细胞结合至人MAdCAM；(e)抑制淋巴细胞募集至胃肠道淋巴组织。
3.根据权利要求2所述的人单克隆抗体或抗原结合部分，其中所述的抗体或部分以3×10-10M或更小的Kd结合人MAdCAM并抑制α4β7结合至人MAdCAM。
4.产生根据权利要求1所述的人单克隆抗体的杂交瘤细胞系，其中所述的杂交瘤选自1.7.2(ECACC登录号03090901)、1.8.2(ECACC登录号03090902)、6.14.2(ECACC登录号03090903)、6.22.2(ECACC登录号03090904)、6.34.2(ECACC登录号03090905)、6.67.1(ECACC登录号03090906)、6.73.2(ECACC登录号03090907)、6.77.1(ECACC登录号03090908)、7.16.6(ECACC登录号03090909)、7.20.5(ECACC登录号03090910)、7.26.4(ECACC登录号03090911)和9.8.2(ECACC登录号03090912)。
5.由根据权利要求4所述的杂交瘤细胞系产生的人单克隆抗体或所述单克隆抗体的抗原结合部分。
6.根据权利要求5所述的人单克隆抗体，其中重链C-末端赖氨酸被切割。
7.根据权利要求1或5所述的人单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述的抗体或抗原结合部分抑制人MAdCAM结合至α4β7，并且其中该抗体或其部分具有至少一种下面的特性(a)与参考抗体交叉竞争结合至MAdCAM；(b)与参考抗体竞争结合至MAdCAM；(c)与参考抗体结合至相同的MAdCAM表位；(d)以与参考抗体基本相同的Kd结合至MAdCAM；(e)以与参考抗体基本相同的解离速率结合至MAdCAM；其中参考抗体选自单克隆抗体1.7.2、单克隆抗体1.8.2、单克隆抗体6.14.2、单克隆抗体6.22.2、单克隆抗体6.34.2、单克隆抗体6.67.1、单克隆抗体6.73.2、单克隆抗体6.77.1、单克隆抗体7.16.6、单克隆抗体7.20.5、单克隆抗体7.26.4、单克隆抗体9.8.2、单克隆抗体6.22.2-mod、单克隆抗体6.34.2-mod、单克隆抗体6.67.1-mod、单克隆抗体6.77.1-mod和单克隆抗体7.26.4-mod。
8.特异性结合MAdCAM的单克隆抗体，其中该抗体选自(a)含有在SEQ ID NO2和SEQ ID NO4中列出的氨基酸序列的抗体，无信号序列；(b)含有在SEQ ID NO6和SEQ ID NO8中列出的氨基酸序列的抗体，无信号序列；(c)含有在SEQ ID NO10和SEQ ID NO12中列出的氨基酸序列的抗体，无信号序列；(d)含有在SEQ ID NO14和SEQ ID NO16中列出的氨基酸序列的抗体，无信号序列；(e)含有在SEQ ID NO18和SEQ ID NO20中列出的氨基酸序列的抗体，无信号序列；(f)含有在SEQ ID NO22和SEQ ID NO24中列出的氨基酸序列的抗体，无信号序列；(g)含有在SEQ ID NO26和SEQ ID NO28中列出的氨基酸序列的抗体，无信号序列；(h)含有在SEQ ID NO30和SEQ ID NO32中列出的氨基酸序列的抗体，无信号序列；(i)含有在SEQ ID NO34和SEQ ID NO36中列出的氨基酸序列的抗体，无信号序列；(j)含有在SEQ ID NO38和SEQ ID NO40中列出的氨基酸序列的抗体，无信号序列；(k)含有在SEQ ID NO42和SEQ ID NO44中列出的氨基酸序列的抗体，无信号序列；(l)含有在SEQ ID NO46和SEQ ID NO48中列出的氨基酸序列的抗体，无信号序列；(m)含有在SEQ ID NO52和SEQ ID NO54中列出的氨基酸序列的抗体，无信号序列；(n)含有在SEQ ID NO56和SEQ ID NO58中列出的氨基酸序列的抗体，无信号序列；(o)含有在SEQ ID NO60和SEQ ID NO62中列出的氨基酸序列的抗体，无信号序列；(p)含有在SEQ ID NO64和SEQ ID NO66中列出的氨基酸序列的抗体，无信号序列；和(q)含有在SEQ ID NO42和SEQ ID NO68中列出的氨基酸序列的抗体，无信号序列。
9.单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其部分的重链包含下列单克隆抗体的重链CDR1、CDR2和CDR3，或其中轻链包含下列单克隆抗体的轻链CDR1、CDR2和CDR3，所述的单克隆抗体选自1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod和7.26.4-mod。
10.根据权利要求9所述的单克隆抗体或抗原结合部分，其中所述的抗体或部分含有利用人VH 1-18基因、人VH 3-15基因、人VH 3-21基因、人VH 3-23基因、人VH 3-30基因、人VH 3-33基因或人VH 4-4基因的重链。
11.根据权利要求10所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述的抗体或部分含有利用人VKA2基因、人VKA3基因、人VKA26基因、人VKB3基因、人VKO12基因或人VKO18基因的轻链。
12.根据权利要求1所述的人单克隆抗体或抗原结合部分，其中重链可变区、轻链可变区或两者的氨基酸序列与选自下列的单克隆抗体的相应区至少90％一致单克隆抗体1.7.2、单克隆抗体1.8.2、单克隆抗体6.14.2、单克隆抗体6.22.2、单克隆抗体6.34.2、单克隆抗体6.67.1、单克隆抗体6.73.2、单克隆抗体6.77.1、单克隆抗体7.16.6、单克隆抗体7.20.5、单克隆抗体7.26.4、单克隆抗体9.8.2、单克隆抗体6.22.2-mod、单克隆抗体6.34.2-mod、单克隆抗体6.67.1-mod、单克隆抗体6.77.1-mod和单克隆抗体7.26.4-mod。
13.特异性结合MAdCAM的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中(a)重链包含选自1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod和7.26.4-mod的参考抗体的重链CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列(b)轻链包含选自1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod和7.26.4-mod的参考抗体的轻链CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列(c)抗体包含(a)的重链和(b)的轻链；和(d)(c)的抗体，其中重链和轻链CDR氨基酸序列选自相同的参考抗体。
14.根据权利要求13所述的单克隆抗体或抗原结合部分，其中重链、轻链或两者分别包含参考抗体重链、轻链或两者从CDR1开始到CDR 3结束的氨基酸序列。
15.根据权利要求13所述的单克隆抗体或抗原结合部分，其中所述的抗体包含(a)包含选自以下的抗体的重链可变区氨基酸序列的重链1.7.2(SEQ ID NO2)；1.8.2(SEQ ID NO6)；6.14.2(SEQ IDNO10)；6.22.2(SEQ ID NO14)；6.34.2(SEQ ID NO18)；6.67.1(SEQ ID NO22)；6.73.2(SEQ ID NO26)；6.77.1(SEQID NO30)；7.16.6(SEQ ID NO34)；7.20.5(SEQ ID NO38)；7.26.4(SEQ ID NO42)和9.8.2(SEQ ID NO46)；6.22.2-mod(SEQ ID NO52)；6.34.2-mod(SEQ ID NO56)；6.67.1-mod(SEQID NO60)；6.77.1-mod(SEQ ID NO64)和7.26.4-mod(SEQ IDNO42)；(b)包含选自以下的抗体的轻链可变区氨基酸序列的轻链1.7.2(SEQ ID NO4)；1.8.2(SEQ ID NO8)；6.14.2(SEQ IDNO12)；6.22.2(SEQ ID NO16)；6.34.2(SEQ ID NO20)；6.67.1(SEQ ID NO24)；6.73.2(SEQ ID NO28)；6.77.1(SEQID NO32)；7.16.6(SEQ ID NO36)；7.20.5(SEQ ID NO40)；7.26.4(SEQ ID NO44)和9.8.2(SEQ ID NO48)；6.22.2-mod(SEQ ID NO54)；6.34.2-mod(SEQ ID NO58)；6.67.1-mod(SEQID NO62)；6.77.1-mod(SEQ ID NO66)和7.26.4-mod(SEQ IDNO68)；或(c)(a)的重链和(b)的轻链。
16.根据权利要求1-3和5-15任意之一所述的单克隆抗体，所述的单克隆抗体是免疫球蛋白G(IgG)、IgM、IgE和IgA或IgD分子、人源化抗体、嵌合抗体或双特异性抗体。
17.根据权利要求1-3、5-7和9-16任意之一所述的抗原结合部分，所述的抗原结合部分是Fab片段、F(ab’)2片段、FV片段或单链抗体。
18.一种药物组合物，其中所述的药物组合物含有有效量的根据权利要求1-3和5-17任意之一所述的单克隆抗体或其抗原结合部分和可药用载体。
19.一种在有此需要的受试者中治疗炎性疾病的方法，所述的方法包括步骤对所述的受试者施用根据权利要求1-3和5-17任意之一所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述的抗体或抗原结合部分抑制MAdCAM结合至α4β7。
20.根据权利要求19所述的方法，其中炎性疾病是胃肠道炎性疾病。
21.根据权利要求20所述的方法，其中胃肠道炎性疾病选自炎性肠病、克隆氏病、溃疡性结肠炎、憩室疾病、胃炎、肝病、原发性胆管纤维硬化和硬化性胆管炎。
22.根据权利要求20所述的方法，其中炎性肠病是克隆氏病、溃疡性结肠炎或两者。
23.根据权利要求20所述的方法，其中炎性疾病是胰岛素依赖型糖尿病和移植物抗宿主病。
24.一种产生根据权利要求1-3和5-17任意之一所述的单克隆抗体或抗原结合部分或所述抗体或所述其部分的重链或轻链的分离的细胞系。
25.根据权利要求4或24所述的细胞系，其中所述的细胞系产生选自1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4和9.8.2的抗体或含有所述抗体之一的氨基酸序列的抗体。
26.根据权利要求25所述的细胞系，其中所述的细胞系产生选自6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod和7.26.4-mod的单克隆抗体或含有所述抗体之一的氨基酸序列的抗体。
27.一种分离的核酸分子，其中所述的核酸分子含有编码根据权利要求1-3和5-17任意之一所述的抗体的重链或重链抗原结合部分或者轻链或轻链抗原结合部分的核苷酸序列。
28.含有根据权利要求27所述的核酸分子的载体，其中所述的载体任选地含有有效地连接至该核酸分子的表达控制序列。
29.一种宿主细胞，其中所述的宿主细胞包含根据权利要求28所述的载体或根据权利要求27所述的核酸分子。
30.根据权利要求29所述的宿主细胞，其中所述的宿主细胞包含编码根据权利要求1-3和5-17任意之一所述的抗体或抗原结合部分的重链或其抗原结合部分的核酸分子和编码根据权利要求1-3和5-17任意之一所述的抗体或抗原结合部分的轻链或其抗原结合部分的核酸分子。
31.一种用于产生特异性结合MAdCAM的人单克隆抗体或其抗原结合部分的方法，所述的方法包括在合适条件下培养根据权利要求29或30所述的宿主细胞或根据权利要求4或24所述的细胞系并回收所述的抗体或抗原结合部分。
32.一种非人转基因动物或转基因植物，所述非人转基因动物或转基因植物包含(a)编码根据权利要求1-3或5-17任意之一所述的抗体的重链或其抗原结合部分的核酸分子；(b)编码根据权利要求1-3或5-17任意之一所述的抗体的轻链或其抗原结合部分的核酸分子；或(c)(a)和(b)两者，其中所述的非人转基因动物或转基因植物表达所述的重链或轻链或两者。
33.一种分离特异性结合MAdCAM的抗体或其抗原结合部分的方法，所述的方法包括从根据权利要求32所述的非人转基因动物或转基因植物中分离该抗体的步骤。
34.一种用特异性结合MAdCAM并抑制其与α4β7结合的人抗体或其抗原结合部分治疗有此需要的受试者的方法，所述的方法包括步骤(a)施用有效量的编码重链或其抗原结合部分的分离的核酸分子、编码轻链或其抗原结合部分的分离的核酸分子，或编码轻链和重链或其抗原结合部分的核酸分子；和(b)表达所述核酸分子。
35.一种用于产生特异性结合MAdCAM的人单克隆抗体的方法，所述的方法包括步骤(a)用MAdCAM、MAdCAM的免疫原性部分或表达MAdCAM的细胞或组织免疫能产生人抗体的非人转基因动物；和(b)使转基因动物产生对MAdCAM的免疫应答。
36.一种人单克隆抗体，所述的人单克隆抗体由根据权利要求35所述的方法产生。
37.一种抑制α4β7结合至表达人MAdCAM的细胞的方法，所述的方法包括用根据权利要求1-3和5-17任意之一所述的单克隆抗体或其抗原结合部分接触该细胞。
38.一种用于抑制MAdCAM介导的白细胞-内皮细胞粘附的方法，所述的方法包括用根据权利要求1-3和5-17任意之一所述的单克隆抗体或其抗原结合部分接触所述内皮细胞。
39.一种用于抑制MAdCAM介导的白细胞粘附、迁移和浸润入组织的方法，所述的方法包括用根据权利要求1-3和5-17任意之一所述的单克隆抗体或其抗原结合部分接触所述内皮细胞的步骤。
40.一种用于抑制α4β7/MAdCAM依赖性的细胞粘附的方法，所述的方法包括用根据权利要求1-3和5-17任意之一所述的单克隆抗体或其抗原结合部分接触表达人MAdCAM的细胞的步骤。
41.一种用于抑制MAdCAM介导的淋巴细胞募集至胃肠淋巴组织的方法，所述的方法包括用根据权利要求1-3和5-17任意之一所述的单克隆抗体或其抗原结合部分接触表达人MAdCAM的细胞的步骤。
42.特异性结合MAdCAM的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述的抗体或其部分包含选自1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod和7.26.4-mod的人单克隆抗体的FR1、FR2、FR3或FR4氨基酸序列中的一个或多个。
43.根据权利要求1所述的人单克隆抗体或抗原结合部分，其中所述抗体包含(a)重链氨基酸序列，所述的重链氨基酸序列与选自1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod和7.26.4-mod的单克隆抗体的重链氨基酸序列至少90％一致；(b)轻链氨基酸序列，所述的轻链氨基酸序列与选自1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod和7.26.4-mod的单克隆抗体的轻链氨基酸序列至少90％一致；(c)(a)和(b)两者；或(d)(a)、(b)或(c)，有或无信号序列。
44.一种用于诊断以循环的可溶性人MAdCAM为特征的病症的方法，所述的方法包括步骤(1)用根据权利要求1-3和5-17任意之一所述的单克隆抗体或抗原结合部分接触生物样品，和(2)测定结合。
45.一种用于检测受试者中的炎症的方法，所述的方法包括步骤(1)对所述的受试者施用根据权利要求1-3和5-17任意之一所述的单克隆抗体或抗原结合部分，其中所述的抗体或其部分经可检测地标记，并(2)测定结合。
46.一种诊断试剂盒，所述的试剂盒包含根据权利要求1-3和5-17任意之一所述的单克隆抗体或抗原结合部分。
47.根据权利要求18所述的药物组合物，所述的药物组合物进一步包含一种或多种额外的抗炎剂或免疫调节剂。
48.根据权利要求47所述的药物组合物，其中一种或多种额外的抗炎剂或免疫调节剂选自皮质激素、氨基水杨酸盐、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、环孢菌素、FK506、IL-10、GM-CSF、雷怕霉素、抗TNFα剂和粘附分子拮抗剂。
49.一种疫苗，所述的疫苗含有有效量的根据权利要求1-3和5-17任意之一所述的人抗体或其抗原结合部分及药用载体。
50.根据权利要求49所述的疫苗，其中该疫苗是粘膜疫苗。
51.一种检测对受试者施用抑制性抗-MAdCAM抗体或其抗原结合部分的效果的方法，所述的方法包括步骤(a)对受试者施用特异性结合MAdCAM的人单克隆抗体；和(b)测定是否存在循环的表达α4β7的白细胞水平的增加。
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述的白细胞是淋巴细胞。
53.根据权利要求51所述的方法，其中所述循环的表达α4β7的白细胞水平的增加通过FACS分析测定。
全文摘要
本发明涉及抗体，所述的抗体包括人抗体和其抗原结合部分，其特异性结合至MAdCAM，优选结合至人MAdCAM，并作用于抑制MAdCAM。本发明也涉及人抗－MAdCAM抗体和其抗原结合部分。本发明也涉及嵌合的、双特异性的、衍生的、单链的抗体或融合蛋白部分。本发明也涉及源于人抗－MAdCAM抗体的分离的重链和轻链免疫球蛋白和编码这种免疫球蛋白的核酸分子。本发明也涉及产生人抗－MAdCAM抗体的方法、含有这些抗体的组合物和将该抗体和组合物用于诊断和治疗的方法。本发明也提供使用编码构成人抗－MAdCAM抗体的重链和/或轻链免疫球蛋白分子的核酸分子的基因疗法。本发明也涉及包含本发明核酸分子的转基因动物或植物。
文档编号C12N5/06GK1956738SQ200580002122
公开日2007年5月2日 申请日期2005年1月7日 优先权日2004年1月9日
发明者N·普伦, E·莫洛伊, S-A·科勒曼, L·L·格林, M·哈克－弗兰德索 申请人:辉瑞大药厂, 安进弗里蒙特公司