来自非哺乳动物组织的脱细胞化的生物材料的制作方法
【专利说明】来自非哺乳动物组织的脱细胞化的生物材料
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请根据35USC § 119 (e)要求于2013年1月9日提交的美国临时申请 61/750, 555的权益，其全部内容通过引用以其整体并入本文。
[0003] 发明背景
[0004] 正在进行组织工程学努力以产生用于替代生物学功能，通常是修复或替代整个组 织或其一部分的方法和材料。在这点上，伤口处理和皮肤修复是主要关注的领域，因为由于 疾病或损伤造成的皮肤完整性的损失可导致慢性的危及生命的并发症。
[0005] 伤口愈合涉及细胞、生长因子和胞外基质（ECM)成分之间复杂的相互作用，以在 损伤后重构组织。已经很好地表征了成年哺乳动物组织中的伤口愈合过程，其可以被分为 三个阶段-炎症、增殖和重塑。
[0006] 通常，响应于切口或创伤，身体输送血液、血液制品以及蛋白质到伤口处形成的空 隙（void)(也称为腔或负空间（negative space))中。在早期的炎症期间，在炎症介质的 影响下以及由于血管舒张，伤口渗出物开始形成。存在于凝结血液中的血纤蛋白和纤连蛋 白提供骨架（scaffold)，在该骨架之上，细胞（例如角质形成细胞、血小板和白细胞）迀移 到伤口部位。吞噬并除去细菌和碎片，并且释放出刺激成纤维细胞迀移和分裂的生长因子。
[0007] 随后的伤口愈合阶段涉及随着称为肉芽组织（由成纤维细胞、巨噬细胞和新血管 构成）的纤维结缔组织替代血纤蛋白凝块，新组织形成。在这个阶段期间，新血管形成，成 纤维细胞增殖并通过分泌胶原蛋白和纤连蛋白产生临时ECM。几乎所有的哺乳动物细胞都 需要粘附到表面以使得增殖并正确地发挥功能。ECM实现了这一功能。最初，临时ECM包 含III型胶原蛋白（一种迅速产生的较弱形式的胶原蛋白）的网络。随后其被更强的I型 胶原蛋白（其有助于瘢痕形成）所替代。与此同时，发生表皮的再上皮化。在此过程中，上 皮细胞增殖并由于在迀移细胞前缘的蛋白酶（例如金属蛋白酶（MMP))和胶原酶帮助侵入 凝块而迀移到新形成的组织之上。除了生长因子信号转导（细胞-细胞相互作用）和细 胞-ECM相互作用（来自细胞、整合素（细胞表面受体）、层粘连蛋白、胶原蛋白、纤连蛋白和 其他ECM蛋白质之间相互作用的信号转导），这些酶还刺激细胞迀移进入伤口以及ECM降 解。
[0008] 最后，在重塑阶段中，胶原蛋白被重塑并沿着张力线（tension line)重新排列，并 且通过凋亡除去不再需要的细胞。随着成纤维细胞通过其与ECM蛋白和生长因子的相互作 用转化为肌成纤维细胞，发生伤口收缩。然后，肌成纤维细胞与胶原蛋白、玻连蛋白和其他 ECM蛋白相互作用以收缩伤口。随着重塑阶段的进行，纤连蛋白和透明质酸被向组织提供强 度的胶原蛋白束所替代。
[0009] 通过对组织修复和再生应用生物学、化学和工程学的原理，组织工程师们已经开 发出用于促进组织修复和再生过程的可移植产品。恢复受损组织的生物力学功能的能力提 出了真正的挑战。作为回应，已经开发出模拟（在一定程度上）组织结构和机械特性的合 成和生物学骨架产品两者以促进组织修复。对于受损的、病变的或缺失的组织，这样的产品 充当机械上和功能上的临时替代物。
[0010] 理想地，可移植骨架产品应支持细胞粘附、增殖和分化，并在新的组织形成之前作 为细胞临时的合成胞外基质（ECM)起作用。骨架材料应为生物相容的、生物可降解的且表 现出低的抗原性。植入物应该以与新组织形成大致相等的速率降解。一旦被植入，骨架必 须具有临时提供结构支持所必需的机械性能，直到形成新的组织。此外，骨架产品必须是 多孔的，从而为营养物传输和组织向内生长提供合适的路径。组织骨架还应促进快速愈合 并促进在外观和功能上均类似于正常宿主组织之新组织的发育或再生。为此，植入的骨架 产品应该提供（i)生物活性刺激，例如，蛋白质和分子信号转导以促进细胞迀移、增殖和分 化，和（ii)用于这些过程的机械或结构支持。
[0011] 现今，合成骨架的开发是一个活跃的研究领域。已由化合物（例如纤维状聚合物、 明胶、磷灰石、和聚合物/陶瓷复合物、聚乳酸、胶原蛋白）制造了合成骨架。这些骨架被设 计为模拟天然存在的ECM的结构并在骨组织工程方面显示出一些成功。
[0012] 除了合成骨架产品之外，获自哺乳动物组织的生物学骨架是市售的，其可用作同 种异体移植物（来自相同物种供体的移植细胞或组织）或异种移植物（来自不同物种供体 的移植细胞或组织）。生物学骨架由哺乳动物ECM构成，所述哺乳动物ECM是从例如多种 哺乳动物包括人（活体供者或尸体）、猪、牛和马的真皮、膀胱、小肠、间皮、心包、骨或羊膜 (aminiotic membrane)中收获的。这些市售产品通常用于修复和重建受损的或缺失的组织 和器官，例如软组织、腱、心脏组织、神经组织、慢性伤口、硬脑膜、骨和角膜。
[0013] 除了由组织产生并进行脱细胞化过程的胞外基质，生物学骨架产品还可包含皮肤 细胞。其与伤口部位接触以对作为伤口愈合过程一部分的细胞迀移和增殖提供机械支持。 此外，也可提供促进伤口愈合过程的因子，例如生长因子或其他蛋白质。认为生物学骨架的 机械和材料性能以及宿主组织对这些生物材料的响应受到材料的三维构型和生产加工方 法的影响。还认为生长因子、表面配体的表面拓扑结构和分布以及宿主先天免疫应答的调 节都有助于用于组织修复或重建的生物学骨架的最终功能表现。Tottey等，Biomaterials 32 :128-36(2011) 〇
[0014] 在移植中使用人羊膜（AM)具有特别的优势，原因是其相对厚的基膜结构，相关 的失活（devitalize)羊膜上皮细胞和基质以及相应的生长因子谱和结构蛋白质组成。 Meller 等，DtschArztebl Int' 1108:243-8(2011)。例如，AM 包含表皮生长因子（EGF) 和角质形成细胞生长因子（KGF)，这是用于促进伤口愈合的重要生长因子。此外，存在于AM 中的层粘连蛋白和VII型胶原蛋白引起趋上皮效应。AM也被认为降低多种生长因子和促炎 性细胞因子的表达，同时释放抗炎性细胞因子（例如IL-10、IL-1受体拮抗剂），从而调节 对于伤口愈合有利的炎症反应。AM是免疫豁免的（immumoprivileged)，而且，有可能由于 低的MHC I表达，所以AM组织的排斥是罕见的。这些特征使得AM成为例如关于眼表重建、 骨盆重建以及在溃疡的治疗，尤其是伤口愈合应用中的理想基材（substrate)。
[0015] 然而，常规的组织骨架产品的使用也并不是没有缺点。从人供体收获的组织可产 生不希望的后果，例如与用于捐献之皮肤的移除相关的供体部位的发病或感染。疾病传播 风险和样品间的变化是与生物学骨架产品相关的另外的缺点。此外，可能难以获得覆盖大 面积受损组织所必需的充分的组织成分。另外，常规的生物学材料和合成材料可能成本昂 贵，在许多情况下没有效果并且可用性有限。
[0016] 因此，持续需要在移植中使用的合适的组织基材生物材料以促进组织再生，同时 恢复功能。研究行业和医学移植界两者都将受益于这样的产品，这样的产品易于获得，不对 供体或接受者造成额外的并发症（例如需要额外的手术来收获基材），并表现出反映自然 组织之生理化学、电化学和生物化学特性的所有或一些固有材料功能。
【发明内容】
[0017] 本发明的生物材料是从有尾目动物（urodele)的组织获得的。"有尾目动 物"在这里表示两栖纲中的有尾目（order Urodela)(也称为order Caudata)的蝾 觸（salamander)。按照系统发生，相关的科包括钝口觸科（Ambystomatidae)、隐鲍 銳科（Cryptobranchidae)、两栖銳科（Amphiumidae)、洞觸科（Proteidae)和暢觸科 (Sirenidae)。参见Wiens等，Syst. Biol. 54 :91-110 (2005)，其内容通过引用以其整体并 入全文。因此，有尾目动物种类包括，例如，太平洋大鲵（Pacific Giant Salamander)(中 国大鲵（Andrias davidianus))、虎纹钝口觸（Ambystoma tigrinum)以及墨西哥钝口觸 (Ambystoma mexicanum)。本发明人已经认识到有尾目动物的皮肤和ECM具有类似于AM特 征的所期望的特征，这使得它们成为用于异种移植之生物材料的一种理想来源。
[0018] 有尾目动物ECM和组织再生
[0019] 作为两栖动物，大多数有尾目动物在幼体状态以水生动物开始生活，并经历从具 有鳃的幼年形式到具有肺的陆生的呼吸空气的成体形式的变态。在变态过程中，有尾目动 物的身体特征改变以准备在陆地上生活。这些改变包括尾鳍的再吸收、皮肤的增厚、真皮腺 体的发育和鳃的吸收。在此期间在大多数有尾目动物中也发生性成熟。一些科的有尾目动 物是"幼态持续的"，这意味着，这样科中的个体可表现出幼体特征，例如鳃和鳍，甚至是在 达到性成熟后亦如此。事实上，幼态持续的有尾目动物在其生命的整个时期内往往保留其 水生的（幼体的）形式。因此，墨西哥蝾螈（Mexican Axolotl)通常在其整个成体生活中 保持幼态持续状态，但是，在某些情况下，其可经历变态并转变成陆生形式。
[0020] 蝾螈还因其再生切断的身体部位的能力而闻名，这通常导致受损肢体或器官的结 构和功能两者的完全恢复。水生蝾螈在伤口愈合和肢体再生期间（这两者都是无瘢痕过程 (scar-less process))经历迅速的再上皮化。类似地，变态的陆生蝾觸保留许多幼体的皮 肤特征，并且还表现出无瘢痕的伤口愈合，尽管愈合速率比其水生的预变态的对应体要慢。
[0021] 在蝾螈中的愈合过程与在成年哺乳动物中观察到的不同。蝾螈的过程更类似于胎 儿和胚胎伤口的无瘢痕愈合过程。因此，这样的伤口也表现出以比出生后的哺乳动物的相 应事件以更快的速率（是"增强的"）发生的再上皮化和基膜再形成（reformation)。
[0022] 此外，就蝾螈的皮肤由融合的外胚层的中胚层构成方面而言，蝾螈的皮肤和皮下 结构类似于羊膜/绒毛膜界面的结构。蝾螈的皮肤也富含生长因子和抗微生物肽，类似于 AM。此外，蝾螈ECM是免疫豁免的，并且尤其包含胶原蛋白III和金属蛋白酶的组织抑制剂 (??ΜΡ)，也类似于AM。
[0023