针对多种登革病毒亚型的新颖疫苗的制作方法
【专利说明】针对多种登革病毒亚型的新颖疫苗 发明领域
[0001] 本发明涉及改进的登革疫苗、用于诱导针对登革病毒的免疫反应和用于预防性地 和/或治疗性地针对登革病毒免疫个体的改进的方法。
[0002] 背景
[0003] 登革病毒（DENV)是一种新出现的引起登革热（DF)和严重的威胁生命的疾病登革 出血热/登革休克综合征（DHF/DSS)的蚊媒病原。DENV是一种小的、包膜的正链RNA病毒， 它属于黄病毒科（Flaviviridae)家族的黄病毒属。登革病毒的四种不同的亚型或血清型 (DV-1到DV-4)通过蚊种埃及伊蚊（Aedes aegypti)和白纹伊蚊（Aedes albopictus)的 叮咬传播给人类。据估计每年出现5千万至1亿的DF病例和250, 000至500000的DHF病 例。登革成为了巨大的国际公共卫生问题，因为世界人口的五分之二生活在登革的流行区 域并且每年出现估计5千万至1亿的登革感染病例。此外，在不存在有效干涉的情况下，在 世界的亚热带和热带区域，25亿人处在感染的危险之下。
[0004] 超过100个热带国家具有流行性登革病毒感染，并且已证明DHF在大于60个这些 国家中存在。在大多数国家缺乏对DF/DHF的监视并且过去主要集中于DHF ;因此只能估计 每年出现的DF病例的数目。然而在1998年，主要的流行病发生遍及亚洲和美国，其中向 世界卫生组织（WHO)报告了大于120万例DF/DHF病例。DHF的全球报告在过去20年内已 平均增加五倍。在21世纪初，根据流行病活性，估计每年出现5千万至1亿的DF病例和几 十万DHF病例。病死率（CFR)在国家之间有差异，但是在一些国家可以高达10- 15%而在 另一些国家〈1%。
[0005] 存在四种登革病毒亚型：登革1型（DV-1)、登革2型（DV-2)、登革3型（DV-3)和 登革4型（DV-4)。这些亚型中的每一个在黄病毒家族内形成抗原上不同的亚类。它们是 编码十种蛋白的包膜的RNA病毒：三种结构蛋白和七种非结构蛋白。所述结构蛋白是衣壳 (C)、包膜（E)和预膜前体（preM)。DV的生命周期开始于受体介导的病毒进入细胞的胞吞作 用，接着病毒的包膜蛋白与晚期内含体膜融合，这导致病毒的基因组释放到细胞质中复制。
[0006] DV感染可能无症状或者以发热、寒战、额痛、肌痛、关节痛和疹为特征。随后感染不 同的血清型可导致包括血浆渗漏或出血（登革出血热）和休克（登革休克综合征）的更为 严重的疾病表现。虽然多年来已进行广泛研究来了解DENV感染的病原性，但在特效的抗DV 化合物的研制上没有取得什么进展。目前在美国没有批准的针对登革感染的特定抗病毒剂 或疫苗。
[0007] 包膜（E)糖基化蛋白是成熟的登革病毒粒子表面上存在的主要结构蛋白，是一种 I型整合膜蛋白。已证明成熟登革病毒的E蛋白以反向平行方式（头到尾方向）形成同型 二聚体。每个单体被折叠成三种不同的结构域，即结构域I (DI，中心的N端结构域）、结构 域II (DII，二聚化结构域）和结构域III (PRM/E，免疫球蛋白（Ig)样的C端结构域）。E蛋 白的PRM/E结构域由C端的100个氨基酸（残基303-395)组成。这个结构域已表明是受 体识别和结合结构域。PRM/E蛋白中存在的Ig样折叠通常与具有附着功能的结构有关。这 个结构域垂直地延伸到病毒的表面，具有一个从病毒粒子表面伸出的比E蛋白的任何其他 部分更远的尖端。此外，研究已证明重组PRM/E蛋白和产生的抗黄病毒的E蛋白的PRM/E 的抗体均能抑制黄病毒进入靶细胞。此外，具有E蛋白的PRM/E的突变的黄病毒显示出减 弱的毒力或逃避免疫中和的能力。
[0008] 研制安全且有效的针对登革病毒感染的疫苗仍是一个主要的公共卫生目标。假 定免疫性与登革病毒的主要关联被认为是中和抗体的存在，那么用于比较和优化疫苗候 选物的前提是精确地测量由疫苗诱发的中和抗体反应的能力。来自所有四种血清型的包 含减弱的活病毒的疫苗的组合已显示导致几种并发症（Guy B, Almond JW, Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 2008年3月；31 (2-3):239-52)。此外，存在很少的关于基于腺病 毒的登革抗原的递送的报告。尽管如此，腺病毒系统的这个众所周知的问题是大多数的人 类群体已知具有抗腺病毒之一的抗体，并且此类预先存在的抗体能够引起这些基于腺病毒 的疫苗失效。
[0009] 因此，仍有必要研制提供针对多种且优选所有四种血清型的登革病毒的广泛免疫 性或通用免疫性（universal immunity)的疫苗，以及优选地是经济的且在所有血清型之间 有效的疫苗。此外，存有需要向哺乳动物施用疫苗诸如DNA疫苗或DNA质粒疫苗以在预防 上或治疗上提供针对登革病毒的免疫的有效方法。
[0010] 发明概述
[0011] 本发明的一个方面提供能够表达引发哺乳动物针对多于一种登革病毒亚型的免 疫反应的多肽的核酸构建体。所述核酸构建体由编码核苷酸序列和与所述编码核苷酸序列 可操作地连接的启动子组成。所述编码核苷酸序列表达所述多肽，其中所述多肽包括来自 至少两种不同的登革病毒亚型的包膜蛋白的结构域π I (PRM/E结构域或PRM/E)。所述启动 子调节哺乳动物中所述多肽的表达。
[0012] 本发明的另一个方面提供了能够在哺乳动物中产生针对多种登革病毒亚型的免 疫反应的DNA质粒疫苗。所述DNA质粒疫苗由能够在所述哺乳动物中表达共有登革抗原的 DNA质粒和药学上可接受的赋形剂组成。所述DNA质粒由与编码所述共有登革PRM/E抗原 的编码序列可操作地连接的启动子组成。所述共有登革抗原由登革病毒亚型1、登革病毒亚 型2、登革病毒亚型3或登革病毒亚型4的共有PRM/E结构域组成。
[0013] 本发明的另一方面提供了引发哺乳动物针对多种病毒亚型的免疫反应的方法，所 述方法包括向所述哺乳动物的组织递送DNA质粒疫苗，并用能量脉冲以有效允许所述DNA 质粒进入所述细胞的恒定电流将所述组织的细胞电穿孔，所述DNA质粒疫苗包含能够在所 述哺乳动物的细胞中表达衍生自所述病毒亚型的多种共有抗原以引发所述哺乳动物的免 疫反应的DNA质粒，所述多种共有抗原包含来自所述至少两种不同的病毒亚型的抗原结构 域。
[0014] 附图简述
[0015] 图1示出对比来自接种DlprME的小鼠的血清与来自接种DU的小鼠的血清的、针 对来自亚型1的所有登革PRM/E结构域的结合滴度。
[0016] 图2示出对比来自接种D2prME的小鼠的血清与来自接种DU的小鼠的血清的、针 对来自亚型2的所有登革PRM/E结构域的结合滴度。
[0017] 图3示出对比来自接种D3prME的小鼠的血清与来自接种DU的小鼠的血清的、针 对来自亚型3的所有登革PRM/E结构域的结合滴度。
[0018] 图4示出对比来自接种D4prME的小鼠的血清与来自接种DU的小鼠的血清的、针 对来自亚型4的所有登革PRM/E结构域的结合滴度。
[0019] 图5示出染色凝胶，所述染色凝胶展示对用来自血清型1、2、3或4的PRM/E结构 域免疫的小鼠来说，针对prME蛋白类型Dl、D2、D3和D4产生的结合抗体。
[0020] 图6示出展示对于对照豚鼠血清来说针对登革PRM/E蛋白类型（1至4)中的每一 种的中和抗体的图。
[0021] 图7示出展示对于DU-DIII豚鼠血清来说针对登革PRM/E蛋白类型（1至4)中的 每一种的中和抗体的图。
[0022] 图8示出展示对于Dl_D4prME豚鼠血清（所有四种疫苗组合成一种混合物并且一 起施用）来说针对登革PRM/E蛋白类型（1至4)中的每一种的中和抗体的图。
[0023] 图9示出展示对于Dl_D4prME豚鼠血清（单独地施用每一种疫苗）来说针对登革 PRM/E蛋白类型（1至4)中的每一种的中和抗体的图。
[0024] 图10示出展示对于DlprME豚鼠血清来说针对登革PRM/E蛋白类型（1至4)中的 每一种的中和抗体的图。
[0025] 图11示出展示对于D2prME豚鼠血清来说针对登革PRM/E蛋白类型（1至4)中的 每一种的中和抗体的图。
[0026] 图12示出展示对于D3prME豚鼠血清来说针对登革PRM/E蛋白类型（1至4)中的 每一种的中和抗体的图。
[0027] 图13示出展示对于D4prME豚鼠血清来说针对登革PRM/E蛋白类型（1至4)中的 每一种的中和抗体的图。
[0028] 图14示出展示对于来自用所有四种Dl_D4prME接种的动物的血清来说针对登革 1病毒的中和抗体的图。
[0029] 图15示出展示对于来自用所有四种Dl_D4prME接种的动物的血清来说针对登革 2病毒的中和抗体的图。
[0030] 图16示出展示对于来自用所有四种Dl-D4prME接种的动物的血清来说针对登革 3病毒的中和抗体的图。
[0031] 图17示出展示对于来自用所有四种Dl-D4prME接种的动物的血清来说针对登革 4病毒的中和抗体的图。
[0032] 优选实施方案的详细描述
[0033] 给出下述简略或简短的定义以帮助理解本发明的优选实施方案。这里所给出的简 略的定义绝不是详尽的，它们与本领域理解的定义或字典含义也绝不矛盾。在这里给出简 略的定义是为了补充或更清晰地界定本领域中已知的定义。
[0034] 定义
[0035] 如本文使用，核苷酸和氨基酸的序列同源性可使用FASTA、BLAST和Gapped BLAST(Altschul等人，Nuc. Acids Res.，1997, 25, 3389,其通过引用将其全部内容并入本 文）以及 PAUP*4. OblO 软件（D. L. Swofford, Sinauer Associates, Massachusetts)确定。 简言之，BLAST算法代表基本局部比对搜索工具（Basic Local Alignment Search Tool)， 它适合于确定序列相似性（Altschul等人，J. Mol. Biol.，1990, 215, 403-410,其通过引用 将其全部内容并入本文）。用于执行BLAST分析的软件是通过国家生物技术信息中心公共 可利用的。由BLAST算法提供的相似性的一个量度是最小和概率（P(N))法，它提供了两 条核苷酸序列之间的匹配偶然发生的概率的指示。例如，如果在检测核酸与另一种核酸的 比较中最小和概率小于大约1、优选地小于大约0. 1、更优选地小于大约0. 01且最优选地小 于大约0. 001，那么认为所述核酸与所述另一种核酸是相似的。可使用PAUP*4. OblO软件 (D.L.Swofford，Sinauer Associates, Massachusetts)计算"相似性的百分比"。计算出共 有序列与系统树（phylogenic tree)中的所有序列相比的平均相似性。
[0036] 如本文所用，术语"核酸构建体"是指包含编码蛋白质的核苷酸序列的DNA或RNA 分子。编码序列或"编码核