体。豚鼠1产生结合来自D1和D2的Dili蛋白的抗体。仅几只豚鼠产生结合（最小程度 地）来自D2和D3的Dili蛋白的抗体。
[0124] 图8和9与图7的比较指示：用DlprME、D2prME、D3prME和D4prME的组合（无论 单独还是混合）进行的免疫比用DU进行免疫产生对Dili更好的免疫原性。
[0125] 实施例3 :登革PRNT5。和FRNT测定
[0126] 用100 μ g的DU、DlprME、D2prME、D3prME或D4prME免疫豚鼠。如以下详细描述， 在一些组中，用所有四种DlprME、D2prME、D3prME或D4prME在单个免疫位点或单独免疫位 点中免疫每一豚鼠。如在实施例2和3中，DlprME、D2prME、D3prME和D4prME是编码包含 分别来自血清型Dl、D2、D3或D4的pRM(预膜前体）蛋白和E(包膜）蛋白两者的抗原的 构建体。DU是编码包含以下共有序列的抗原的构建体：针对血清型D1的E(包膜）蛋白的 Dili结构域的共有序列、针对血清型D2的E(包膜）蛋白的Dili结构域的共有序列、针对 血清型D3的E(包膜）蛋白的Dili结构域的共有序列和针对血清型D4的E(包膜）蛋白 的Dili结构域的共有序列，所述共有序列各自由连接体分开，如在实施例2中详细所述。
[0127] 对于登革PRNT50测定来说，在第1天将VER0细胞以6孔格式接种（7. 5x10s至 1. OxlO6个细胞/孔）。在第2天，在37°C下，用来自豚鼠的血清孵育50pfu的登革热病毒 /孔达1小时。所使用的登革热病毒是菌株夏威夷、NGC、H87或H241中的一种。将混合物 加入板中的细胞单层，并且在37°C下孵育1小时。用在2%培养基199中的1%甲基纤维素 覆盖细胞。在37°C下将细胞孵育达感染后5天。在第7天，用结晶紫/20%甲醇混合物固 定并染色细胞（孵育2小时）。用dH20洗涤板并且加以干燥。对噬斑计数。中和滴度被定 义为：与无血清的对照相比，噬斑计数减少>50%的最高血清稀释度的倒数。
[0128] 对于Focus Diagnostics FRNT测定来说，使用24孔板与血清的4倍稀释。将板 孵育4天。使用免疫聚焦来测定并计数噬斑的发展。
[0129] 以下表2中以及图14-17中示出结果。如图14所示，来自用所有DlprME、D2prME、 D3prME或D4prME构建体免疫的豚鼠以及来自只用DlprME免疫的豚鼠的血清产生结合来 自夏威夷登革热病毒的蛋白质的抗体。用DU进行的免疫则不产生。如图15所示，来自用 所有DlprME、D2prME、D3prME或D4prME构建体免疫的豚鼠以及来自只用D2prME免疫的豚 鼠的血清产生结合来自NGC登革热病毒的蛋白质的抗体。用DU进行的免疫则不产生。如 图16所示，来自用所有DlprME、D2prME、D3prME或D4prME构建体免疫的豚鼠以及来自只 用D3prME免疫的豚鼠的血清产生结合来自H87登革热病毒的蛋白质的抗体。在用DU进行 的免疫之后观察到的滴度是最小的。如图17所示，来自用所有DlprME、D2prME、D3prME或 D4prME构建体免疫的豚鼠以及来自只用D4prME免疫的豚鼠的血清产生结合来自H241登革 热病毒的蛋白质的抗体。用DU进行的免疫则不产生。
[0130] 表2.通过LiCor、FRNT和PRNT测定来测定的1期临床研究病毒中和抗体反应。
【主权项】
1. 一种能够表达引发哺乳动物的针对多于一种登革病毒亚型的免疫反应的多肽的核 酸构建体，所述核酸构建体包含： 表达所述多肽的编码核苷酸序列，其中所述多肽包括来自至少两种不同的登革病毒亚 型的PRM/E结构域， 在所述哺乳动物中调控所述多肽的表达并且与所述编码核苷酸序列可操作地连接的 启动子。2. 如权利要求1所述的核酸构建体，还包含与所述编码序列的N端末端可操作地连接 并且与所述启动子可操作地连接的IgE前导序列。3. 如权利要求1-2中任一项所述的核酸构建体，还包含与所述编码序列的C端末端相 连的聚腺苷酸化序列。4. 如权利要求1-3中任一项所述的核酸构建体，其中所述核酸构建体是密码子优化 的。5. 如权利要求1-4中任一项所述的核酸构建体，其中所述编码核苷酸序列编码包括来 自登革病毒-亚型1、登革病毒-亚型2、登革病毒-亚型3或登革病毒-亚型4或它们的 组合的DIII结构域的多肽。6. 如权利要求1-5中任一项所述的核酸构建体，其中所述编码核苷酸序列选自由以下 组成的组：SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4 和 SEQ ID N0:5。7. -种能够在哺乳动物中产生针对多种登革病毒亚型的免疫反应的DNA质粒疫苗，所 述疫苗包含： 能够在所述哺乳动物的细胞中以有效引发所述哺乳动物的免疫反应的量表达共有登 革抗原的DNA质粒，所述共有登革抗原包括登革病毒-亚型1、登革病毒-亚型2、登革病 毒-亚型3或登革病毒-亚型4或它们的组合的共有DIII结构域，和 药学上可接受的赋形剂； 所述DNA质粒包含与编码所述共有登革抗原的编码序列可操作地连接的启动子。8. 如权利要求7所述的DNA质粒疫苗，其中所述DNA质粒还包含与所述编码序列的N 端末端相连并且与所述启动子可操作地连接的IgE前导序列。9. 如权利要求7-8中任一项所述的DNA质粒疫苗，其中所述DNA质粒还包含与所述编 码序列的C端末端相连的聚腺苷酸化序列。10. 如权利要求7-9中任一项所述的DNA质粒疫苗，其中所述DNA质粒是密码子优化 的。11. 如权利要求7-10中任一项所述的DNA质粒疫苗，其中所述药学上可接受的赋形剂 是佐剂。12. 如权利要求11所述的DNA质粒疫苗，其中所述佐剂选自由IL-12和IL-15组成的 组。13. 如权利要求7-10中任一项所述的DNA质粒疫苗，其中所述药学上可接受的赋形剂 是转染促进剂。14. 如权利要求13所述的DNA质粒疫苗，其中所述转染促进剂是聚阴离子、聚阳离子或 脂质。15. 如权利要求13所述的DNA质粒疫苗，其中所述转染促进剂是浓度小于6mg/mL的聚 L谷氨酸。16. 如权利要求7-15中任一项所述的DNA质粒疫苗，其中所述DNA质粒疫苗具有lmg/ mL或更大的总DNA质粒的浓度。17. 如权利要求7-16中任一项所述的DNA质粒疫苗，其中所述DNA质粒包括多种单 一 DNA质粒，其中所述多种单一 DNA质粒的每一种编码包含来自登革病毒-亚型1、登革病 毒-亚型2、登革病毒-亚型3或登革病毒-亚型4或它们的组合的PRM/E结构域的多肽。18. 如权利要求7-17中任一项所述的DNA质粒疫苗，其中所述编码核苷酸序列包括SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4 或 SEQ ID N0:5。19. 如权利要求7-18中任一项所述的DNA质粒疫苗，所述疫苗包含表达登革病毒PRM/ E结构域的至少两种不同的DNA质粒，所述质粒选自由以下组成的组： 包含编码共有登革病毒-亚型1的PRM/E结构域的序列的DNA质粒， 包含编码共有登革病毒-亚型2的PRM/E结构域的序列的DNA质粒， 包含编码共有登革病毒-亚型3的PRM/E结构域的序列的DNA质粒，和 包含编码共有登革病毒-亚型4的PRM/E结构域的序列的DNA质粒。20. 如权利要求7-19中任一项所述的DNA质粒疫苗，所述疫苗包含： 所述包含编码共有登革病毒-亚型1的PRM/E结构域的序列的DNA质粒， 所述包含编码共有登革病毒-亚型2的PRM/E结构域的序列的DNA质粒， 所述包含编码共有登革病毒-亚型3的PRM/E结构域的序列的DNA质粒，和 所述包含编码共有登革病毒-亚型4的PRM/E结构域的序列的DNA质粒。21. 如权利要求7-20中任一项所述的DNA质粒疫苗，其中所述共有登革病毒-亚型1 的PRM/E结构域是SEQ ID NO:l。22. 如权利要求7-21中任一项所述的DNA质粒疫苗，其中所述共有登革病毒-亚型2 的PRM/E结构域是SEQ ID NO:2。23. 如权利要求7-22中任一项所述的DNA质粒疫苗，其中所述共有登革病毒-亚型3 的PRM/E结构域是SEQ ID NO:3。24. 如权利要求7-23中任一项所述的DNA质粒疫苗，其中所述共有登革病毒-亚型4 的PRM/E结构域是SEQ ID N0:4。25. 如权利要求7-24中任一项所述的DNA质粒疫苗，其中所述哺乳动物是非人的灵长 类。26. 如权利要求7-25中任一项所述的DNA质粒疫苗，其中所述免疫反应是体液反应。27. 如权利要求7-25中任一项所述的DNA质粒疫苗，其中所述免疫反应是细胞反应。28. 如权利要求7-25中任一项所述的DNA质粒疫苗，其中所述免疫反应是联合的体液 反应和细胞反应。29. -种引发哺乳动物针对多种病毒亚型的免疫反应的方法，包括， 向所述哺乳动物的组织递送DNA质粒疫苗，所述DNA质粒疫苗包含能够在所述哺乳动 物的细胞中表达衍生自所述病毒的亚型的多种共有抗原以在所述哺乳动物中引发免疫反 应的DNA质粒，所述多种共有抗原包括来自所述病毒的至少两种不同亚型的抗原结构域， 并且 用能量脉冲以有效允许所述DNA质粒进入所述细胞的恒定电流将所述组织的细胞电 穿孔。30. 如权利要求29所述的方法，其中所述病毒包括西尼罗病毒、人免疫缺陷病毒、流感 病毒或登革病毒。31. 如权利要求29-30中任一项所述的方法，其中所述递送步骤包括： 将所述DNA质粒疫苗注射到皮内组织、皮下组织或肌肉组织中。32. 如权利要求29-31中任一项所述的方法，还包括： 预先设定期望被递送到所述组织的电流；并且 用能量脉冲以等于所述预设电流的恒定电流将所述组织的细胞电穿孔。33. 如权利要求29-32中任一项所述的方法，其中所述电穿孔步骤还包括： 测量所述电穿孔细胞中的阻抗； 相对于所述测量的阻抗调整所述能量脉冲的能量水平以在所述被电穿孔的细胞中保 持恒定电流； 其中所述测量和调整步骤发生在所述能量脉冲的使用期内。34. 如权利要求29-33中任一项所述的方法，其中所述电穿孔步骤包括： 根据以分散模式递送所述能量脉冲的脉冲序列模式将所述能量脉冲递送至多个电极。
【专利摘要】本发明的一个方面涉及能够表达如共有登革prME的多肽的核酸构建体和使用它们的方法，所述多肽引发哺乳动物的针对多于一种登革病毒亚型的免疫反应。另外，存在能够在哺乳动物中产生针对多种登革病毒亚型的免疫反应的DNA质粒疫苗和使用它们的方法，所述DNA质粒疫苗包含DNA质粒和药学上可接受的赋形剂。所述DNA质粒能够在所述哺乳动物的细胞中以有效引发所述哺乳动物的免疫反应的量表达共有登革抗原，所述免疫反应针对所有4种登革亚型是交叉反应性的。
【IPC分类】A61K31/711
【公开号】CN105246491
【申请号】CN201480013820
【发明人】大卫·韦纳, 严健, 尼兰詹·萨尔德赛
【申请人】宾夕法尼亚大学理事会, 艾诺奥医药品有限公司
【公开日】2016年1月13日
【申请日】2014年3月14日
【公告号】EP2968394A1, EP2968394A4