诱导对甲型流感病毒的异源亚型免疫反应的重组病毒载体和方法
【专利摘要】本发明涉及重组病毒载体和使用所述重组病毒载体诱导对甲型流感病毒的免疫反应的方法。本发明提供例如基于非复制改良型痘苗病毒安卡拉株的重组病毒载体。当根据本发明的方法施用时，所述重组病毒载体被设计为交叉保护的并诱导对甲型流感病毒的异源亚型免疫。
【专利说明】诱导对甲型流感病毒的异源亚型免疫反应的重组病毒载体
和方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及重组病毒载体和使用该重组病毒载体诱导对甲型流感病毒的免疫反应的方法。本发明提供例如基于非复制改良型痘苗病毒安卡拉株的重组病毒载体。当根据本发明的方法施用时，该重组病毒载体被设计为交叉保护的并诱导对甲型流感病毒的异源亚型免疫。
[0002]发明背景
[0003]人类流感或称为“流行性感冒”是一种由甲型和乙型流感病毒导致的呼吸疾病。每年流感在全球范围内的流行导致大量疾病和死亡，而疫苗是预防感染和疾病的最直接对策。传统的流感疫苗使受体暴露于流感病毒蛋白，从而导致受体启动对该蛋白的免疫反应。疫苗中所用蛋白(或多肽)通常称为“抗原”。常用的季节性流感疫苗基于病毒的主要抗原:血凝素(HA)。存在大量具有不同HA抗原的甲型流感亚型。甲型流感亚型的区分和分类基于由病毒表达的HA和神经氨酸苷酶(NA)蛋白。甲型流感亚型的命名基于HA亚型(本领域已知的十六种不同的HA基因的亚型)和NA亚型(本领域已知的九种不同的NA基因的亚型)。示例性亚型包括但不限于H5N1、HlNl和H3N2。还存在称为“病毒株”的甲型流感亚型变种。例如，病毒A/Vie tNam/1203/2004是甲型流感病毒亚型H5N1，其病毒株名为A/VietNam/1203/2004。
[0004]基于HA的季节性疫苗提供的预防具有病毒株特异性，并且新的病毒株不断产生，因此必须每年对传统的流感疫苗进行重新配制，以匹配当前流行的病毒株。参见Lambert和Fauci2010。因此，非常期望新一代疫苗为交叉保护的并诱导异源亚型免疫，即针对一种亚型的疫苗可预防或部分预防不同亚型的甲型流感的挑战感染。
[0005]目前在开发中的“通用疫苗”(即，设计为引起异源亚型免疫的疫苗)主要基于更保守的内部流感病毒基因，它包括流感基质蛋白(Ml和M2 ) (Schotsaert等人，2009 )、核蛋白(NP)以及HA的保守部分(Bommakanti等人,2010 ;Steel等人,2010)。聚合酶蛋白PA、PBl和PB2还诱导实质性的T细胞应答，并且也可以是相关的标靶(Assarsson等人，2008 ；Greenbaum 等人，2009 ；Lee 等人，2008)。
[0006]目前在开发中的新一代流感疫苗包括重组蛋白、合成肽、病毒样颗粒(VLP)、基于DNA的疫苗和病毒载体疫苗(Lambert和Fauci，同上)。使用活病毒载体的优点是它们已知可诱导高水平细胞免疫(特别是CD8T细胞)的特性。其中最有希望的病毒载体是基于痘苗病毒的活疫苗(Rimmelzwaan和Sutter2009)和基于腺病毒的载体(Hoelscher等人，2006 ；Hoelscher等人，2007 ；Price等人，2010 ；Zhou等人，2010)。使用表达NP和M2的腺病毒构建体进行的单剂量粘膜免疫例如提供了对强毒性H5N1、H3N2和HlNl病毒的预防(Price等人，同上)。在另一项研究(Price等人，2009)中，用核蛋白(NP)和基质2 (M2)质粒进行DNA疫苗接种随后用抗原匹配的重组腺病毒(rAd)加强在小鼠和雪貂中提供了对强毒性HlNl和H5N1挑战的稳健预防。
[0007]基于改良型痘苗病毒安卡拉株(MVA)的重组疫苗已用于许多非临床和临床研究中。已证实，MVA非常安全。在根治天花的情况下，对超过120，OOO名人类患者施用MVArS有出现显著的副作用。由于病毒粒子形态发生中的阻断，高度减毒的痘苗病毒株无法在人类和大多数其他哺乳动物细胞中大量复制。然而，在早期和晚期表达病毒和外源基因的能力得以保留。这些特性使得MVA成为最有希望的诱导体液和细胞免疫反应并显示出较高的安全特性的活疫苗载体。
[0008]美国专利N0.6，998，252,7, 015，024,7, 045，136 和 7，045，313 涉及重组痘病毒，例
如牛疫。
[0009]基于MVA的疫苗已例如针对HIV、肺结核、疟疾和癌症用于临床研究。在所有这些研究中，使用至少两个剂量。临床试验中施用的基于MVA的疫苗的人类剂量为5X107至5 X IO8PFU (Brookes 等人，2008 ；Cebere 等人，2006 ;Tykodi 和 Thompson2008 ；)。
[0010]MVA 最近已用作大流行 H5N1 (Kreijtz 等人，2008 ； Kreijtz 等人，PLoS 0ne2009 ；Kreijtz 等人，Vaccine2009 ；Krei jtz 等人，J.1nfect.Dis.2009 ；Krei jtz 等人,2007 ；Mayrhofer 等人,2009 ；Poon 等人，2009)和 HlNl (Hessel 等人,2010 ；Kreijtz 等人，J.1nfect.Dis.2009)流感研究中的载体。表达NP和Ml的基于MVA的疫苗目前正在进行中的临床试验中接受测试(Berthoud等人,2011)。
[0011]因此，本领域仍然需要更广谱的保护性流感疫苗。
【具体实施方式】
[0012]本发明提供可用于对甲型流感病毒产生异源亚型免疫反应的重组病毒(本文也称为重组病毒载体)。该重组病毒为重组痘苗病毒,诸如重组MVA或本领域已知的其他非复制型或复制型痘苗病毒。非复制型痘`苗病毒包括但不限于缺陷型痘苗李斯特株(dVV)、MVA-575 (ECACCV00120707)、MVA_BN(ECACC V00083008)、MVA_F6 和 MVA-M4 (Antoine 等人，1998)。在一些实施例中，重组病毒编码融合蛋白(hlHA/M2e)，其包含具有至少一个甲型流感M2外部结构域(M2e)插入的甲型流感血凝素缺失突变体“无头HA” (hlHA) ;hlHA/M2e融合蛋白和甲型流感核蛋白(NP) ^hlHA和NP。本发明的重组病毒还可以编码甲型流感基质蛋白I(Ml)和/或甲型流感聚合酶PB1。当根据本发明的方法施用时，重组病毒为交叉保护的并且诱导异源亚型体液和细胞免疫反应(包括⑶8和⑶4T细胞应答)。因此，预期重组病毒可在人类中用作通用甲型流感疫苗。
[0013]在一些实施例中，由本发明的重组病毒中的开放阅读框编码的hlHA氨基酸序列可以是例如 SEQ ID NO: 15 (基于为 SEQ ID NO:3 的 A/VietNam/1203/2004H5NlHA NCBIGenbank AAW80717)所示的hlHA氨基酸序列。SEQ ID NO: 15的hlHA包含信号序列、SEQID NO: 3的HAl残基17-58、四个甘氨酸的连接肽、SEQ ID NO: 3的HAl残基290-343以及SEQ ID NO:3 的 HA2 茎区残基 344-568。
[0014]在一些实施例中，由本发明的重组病毒中的开放阅读框编码的hlHA/M2e融合蛋白氨基酸序列可以是例如SEQ ID N0:2中所示的hlHA/M2e融合蛋白氨基酸序列。SEQ IDN0:2的融合蛋白包含信号序列、SEQ ID NO:3的HAl残基17-58、三个甘氨酸的连接肽(SEQID N0:4)、H5N1 的 M2e(基于 A/VietNam/1203/2004H5NlNCBI Genbank ABP35634 的 SEQ IDNO: 5)、六个氨基酸的连接基GSAGSA(SEQ ID N0:9)、H1N1的M2e (等同于H2N2和H3N2)(基于 A/New York/3315/2009H1N1NCBI Genbank ACZ05592 的 SEQ ID NO:6)、六个氨基酸的连接基 GSAGSA(SEQ ID NO:9)、H9N2 的 M2e (基于 A/chicken/Korea/SH0913/2009H9N2NCBIGenbank ADQ43641 的 SEQ ID NO: 7)、六个氨基酸的连接基 GSAGSA(SEQ ID NO:9), H7N2 的M2e (基于 A/New York/107/2003H7N2NCBI Genbank ACC55276 的 SEQ ID N0:8)、三个甘氨酸的连接肽(SEQ ID NO:4)、SEQ ID NO: 3 的 HAl 残基 290-343 以及 SEQ ID NO:3 的 HA2 区域残基344-568。
[0015]在一些实施例中，hlHA/M2e融合蛋白可以包含SEQ ID NO:5、6、7和8的M2e多肽中的一、二、三或四个。除SEQ ID N0:5、6、7和8的M2e多肽之外，hlHA/M2e融合蛋白可以包含甲型流感M2e多肽。
[0016]在一些实施例中，由本发明的重组病毒中的开放阅读框编码的NP氨基酸序列可以是例如 SEQ ID NO: 13 (基于 A/VietNam/1203/2004H5Nl NP NCBI Genbank AAW80720)中所示的NP氨基酸序列。在一些实施例中，由本发明的重组病毒中的开放阅读框编码的Ml 氨基酸序列可以是例如 SEQ ID NO: 11 (基于 A/VietNam/1203/2004 H5N1 MlGenbankAAW80726)中所示的Ml氨基酸序列。在一些实施例中，由本发明的重组病毒中的开放阅读框编码的PBl氨基酸序列可以是例如SEQ ID NO: 17 (基于A/VietNam/1203/2004 H5N1PB1Genbank AAW80711)中所不的PBl氨基酸序列。
[0017]本发明预期，如果对个体施用重组病毒时多肽保持诱导保护性免疫反应的能力，则由重组病毒中的开放阅读框编码的多肽的序列变化可以是SEQ ID N0:2、5、6、7、8、ll、13、15和/或17。在这些实施例中，多肽与SEQ ID NO: 2、5、6、7、8、11、13、15和/或17的同一性可为约80%、约85%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约97%、约98%或约99%。
[0018]在其他实施例中，由本发明的重组病毒编码的hlHA/M2e融合蛋白、hlHA多肽和NP多肽可以基于相同或不同的甲型流感亚型，包括但不限于Hl至H16和NI至N9的任何组合(包括 HlNl、H2N1、H3N1、H4N1`、H5N1、H6N1、H7N1、H8N1、H9N1、HlONl、Hl INl、H12N1、H13N1、H14N1、H15N1、H16N1 ;H1N2、H2N2、H3N2、H4N2、H5N2、H6N2、H7N2、H8N2、H9N2、H10N2、H11N2、Hl2N2、Hl3N2、H14N2、Hl5N2、Hl6N2 ;H1N3、H2N3、H3N3、H4N3、H5N3、H6N3、H7N3、H8N3、H9N3、H10N3、H11N3、H12N3、H13N3、H14N3、H15N3、H16N3 ;H1N4、H2N4、H3N4、H4N4、H5N4、H6N4、H7N4、H8N4、H9N4、H10N4、H11N4、H12N4、H13N4、H14N4、H15N4、H16N4 ;H1N5、H2N5、H3N5、H4N5、H5N5、H6N5、H7N5、H8N5、H9N5、H10N5、H11N5、H12N5、H13N5、H14N5、H15N5、H16N5 ;H1N6、H2N6、H3N6、H4N6、H5N6、H6N6、H7N6、H8N6、H9N6、H10N6、Hl1N6、Hl2N6、Hl3N6、H14N6、Hl5N6、H16N6 ;H1N7、H2N7、H3N7、H4N7、H5N7、H6N7、H7N7、H8N7、H9N7、H10N7、Hl 1N7、Hl2N7、Hl3N7、H14N7、Hl5N7、H16N7 ;H1N8、H2N8、H3N8、H4N8、H5N8、H6N8、H7N8、H8N8、H9N8、H10N8、Hl 1N8、Hl2N8、Hl3N8、H14N8、Hl5N8、H16N8 ;H1N9、H2N9、H3N9、H4N9、H5N9、H6N9、H7N9、H8N9、H9N9、H10N9、H11N9、H12N9、H13N9、H14N9、H15N9和H16N9)。在一些实施例中，甲型流感亚型为大流行甲型流感。示例性的大流行流感亚型包括但不限于H1N1、H2N2、H3N2和H5N1。
[0019]包括甲型流感HlNl病毒株的已鉴定的甲型流感病毒株列表可得自世界卫生组织(WHO)和美国疾病控制中心(CDC)甲型流感亚型数据库。由美国国家医学图书馆维护的美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库还维持了描述甲型流感病毒的HA、M2、NP、M1和PBl基因的长度和序列的更新数据库。预期这些机构所列的病毒株以及其他商业和学术数据库所描述的或文献出版物中和本领域已知的病毒株可用于本发明。还预期，将来鉴定和分离的其他甲型流感病毒株也可作为甲型流感蛋白序列源用于本发明。因此，本说明书中具体示例的任何病毒株以及本领域已知或之后发现的那些适用于本发明的重组痘苗病毒、药物组合物以及方法。示例性病毒株包括但不限于下表I中的病毒株。该表还列举了那些病毒株的示例性基因和相关数据库登录号。
[0020]表I
【权利要求】
1.一种重组痘苗病毒，包含编码融合蛋白的基因盒，所述融合蛋白包含至少一个插入甲型流感无头血凝素(hlHA)多肽的甲型流感M2细胞外结构域(M2e)多肽。
2.根据权利要求1所述的重组痘苗病毒，其中所述融合蛋白包含SEQID NO:2中所示的hlHA/M2e融合蛋白氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的重组痘苗病毒，其中所述融合蛋白包含SEQID NO:3中所示的VN/1203HA氨基酸序列的氨基酸。
4.根据权利要求3所述的重组痘苗病毒，其中所述融合蛋白包含SEQID N0:3的HAl 氨基酸17-58、连接肽、至少一个M2e多肽、SEQID NO: 3的HAl氨基酸290-343以及SEQ ID NO:3 的 HA2 氨基酸 344-568。
5.根据权利要求4所述的重组痘苗病毒，其中连接所述HA氨基酸和M2e氨基酸的所述连接肽包含SEQ ID N0:4中所示的氨基酸GGG。
6.根据权利要求1所述的重组痘苗病毒,其中所述M2e多肽包含SEQID NO: 5中所示的H5NlM2e氨基酸序列。
7.根据权利要求1所述的重组痘苗病毒,其中所述M2e多肽包含SEQID NO:6中所示的HlNlM2e氨基酸序列。
8.根据权利要求1所述的重组痘苗病毒,其中所述M2e多肽包含SEQID NO:7中所示的H9N2M2e氨基酸序列。
9.根据权利要求1所述的重组痘苗病毒,其中所述M2e多肽包含SEQID NO:8中所示的H7N2M2e氨基酸序列。
10.根据权利要求1、3、4、5、6、7、8或9所述的重组痘苗病毒，其中所述融合蛋白包含不止一个M2e多肽，并且所述M2e多肽通过连接肽连接。
11.根据权利要求10所述的重组痘苗病毒，其中连接所述M2e多肽的所述连接肽包含 SEQ ID NO:9中所示的氨基酸GSAGSA。
12.根据权利要求1-11中任 一项所述的重组痘苗病毒，其中通过所述基因盒的所述 hlHA/M2e融合蛋白的表达受控于mH5启动子。
13.根据权利要求1-11中任一项所述的重组痘苗病毒，其中通过所述基因盒的所述 hlHA/M2e融合蛋白的表达受控于selP启动子。
14.一种重组痘苗病毒，包含SEQ ID NO:1中所示的基因盒。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的重组痘苗病毒，还包含编码甲型流感基质蛋白 I(Ml)的基因盒以及编码甲型流感核蛋白(NP)的基因盒。
16.根据权利要求15所述的重组痘苗病毒，其中所述Ml蛋白包含SEQID NO:ll中所示的氨基酸序列。
17.根据权利要求16所述的重组痘苗病毒，其中所述Ml蛋白由SEQID N0:10中所示的核苷酸序列编码。
18.根据权利要求15所述的重组痘苗病毒，其中所述NP包含SEQIDNO: 13中所示的氨基酸序列。
19.根据权利要求18所述的重组痘苗病毒，其中所述NP由SEQID NO: 12中所示的核苷酸序列编码。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的重组痘苗病毒，其中所述痘苗病毒为改良型痘苗病毒安卡拉株(MVA)、缺陷型痘苗李斯特株(dVV)、MVA-575、MVA-BN、MVA-F6或MVA-M4。
21.根据权利要求1-19中任一项所述的重组痘苗病毒，其中所述痘苗病毒为MVA。
22.根据权利要求21所述的重组MVA，其中所述hlHA/M2e融合蛋白基因盒插入所述缺失I区、所述缺失II区、所述缺失III区、所述缺失IV区、所述胸苷激酶基因座、所述D4/5 基因间区或所述HA基因座中的所述MVA。
23.根据权利要求21或22所述的重组MVA，其中所述hlHA/M2e融合蛋白基因盒插入所述D4/5基因间区中的所述MVA。
24.—种药物组合物，包含权利要求1-23中任一项所述的重组MVA。
25.—种包含重组MVA的药物组合物，所述重组MVA包含编码SEQ ID NO: 2中所示的 hlHA/M2e融合蛋白氨基酸序列的基因盒。
26.—种包含重组MVA的药物组合物，所述重组MVA包含SEQID NO:1中所示的基因盒。
27.一种诱导个体对甲型流感病毒的异源亚型免疫反应的方法，所述方法包括对所述个体施用药物组合物，所述药物组合物包含权利要求20-23中任一项所述的重组MVA。
28.一种用于诱导个体对甲型流感病毒的异源亚型免疫反应的药物组合物，所述方法包括对所述个体施用药物组合物的步骤，所述药物组合物包含权利要求20-23中任一项所述的重组MVA。
29.一种制备表达SEQ ID NO:l中所示的hlHA/M2e融合蛋白基因盒的重组MVA的方法，所述方法包括以下步骤:a)用MVA感染原代鸡胚细胞或永久细胞系，b)用质粒转染所述已感染细胞，所述质粒包含SEQID勵:1中所示的111撤/26融合蛋白基因盒，并且包含位于所述基因盒侧翼的DNA，所述基因盒与所述MVA基因组的非必需区同源，c)使所 述细胞生长，以允许所述质粒在所述已感染细胞中所述MVA的复制过程中与所述MVA基因组重组，从而将所述hlHA/M2e融合蛋白基因盒插入所述非必需区中的所述MVA 基因组，以及d)获得所述制得的重组MVA。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述非必需MVA区为所述缺失I区、所述缺失 II区、所述缺失III区、缺失IV区、所述胸苷激酶基因座、所述D4/5基因间区或所述HA基因座。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述非必需MVA区为所述D4/5基因间区。
32.—种重组痘苗病毒，包含编码融合蛋白的第一基因盒和编码甲型流感核蛋白(NP) 的第二基因盒，所述融合蛋白包含至少一个插入甲型流感无头血凝素(hlHA)多肽的甲型流感M2细胞外结构域(M2e)多肽。
33.根据权利要求32所述的重组痘苗病毒，其中所述融合蛋白包含SEQID NO:2中所示的hlHA/M2e融合蛋白氨基酸序列。
34.根据权利要求32所述的重组痘苗病毒，其中所述融合蛋白包含SEQID NO:3中所示的VN/1203HA氨基酸序列的氨基酸。
35.根据权利要求34所述的重组痘苗病毒，其中所述融合蛋白包含SEQID NO:3的HAl 氨基酸17-58、连接肽、至少一个M2e多肽、SEQ ID NO: 3的HAl氨基酸290-343以及SEQ IDNO:3 的 HA2 氨基酸 344-568。
36.根据权利要求35所述的重组痘苗病毒，其中连接所述HA氨基酸和M2e氨基酸的所述连接肽包含SEQ ID NO:4中所示的氨基酸GGG。
37.根据权利要求32所述的重组痘苗病毒，其中所述M2e多肽包含SEQID NO: 5中所示的H5N1 M2e氨基酸序列。
38.根据权利要求32所述的重组痘苗病毒，其中所述M2e多肽包含SEQID N0:6中所示的HlNl M2e氨基酸序列。
39.根据权利要求32所述的重组痘苗病毒，其中所述M2e多肽包含SEQID N0:7中所示的H9N2 M2e氨基酸序列。
40.根据权利要求32所述的重组痘苗病毒，其中所述M2e多肽包含SEQID NO:8中所示的H7N2 M2e氨基酸序列。
41.根据权利要求32、34、35、36、37、38、39或40所述的重组痘苗病毒，其中所述融合蛋白包含不止一个M2e多肽，并且所述M2e多肽通过连接肽连接。
42.根据权利要求41所述的重组痘苗病毒，其中连接所述M2e多肽的所述连接肽包含 SEQ ID NO:9中所示的氨基酸GSAGSA。
43.根据权利要求32所述的重组痘苗病毒，其中所述NP包含SEQID NO: 13中所示的氨基酸序列。
44.根据权利要求32-43中任一项所述的重组痘苗病毒，其中通过所述第一基因盒的所述hlHA/M2e融合蛋白的表达受控于mH5启动子或selP启动子。
45.根据权利要求44所述的重组痘苗病毒，其中通过所述第一基因盒的所述hlHA/M2e 融合蛋白的表达受控于mH5启动子
46.根据权利要求44所述的重组痘苗病毒，其中通过所述第一基因盒的所述hlHA/M2e 融合蛋白的表达受控于selP启动子。
47.根据权利要求32-43中任一项所述的重组痘苗病毒，其中通过所述第二基因盒的 NP的表达受控于mH5启动子或selP启动子。
48.根据权利要求47所述的重组痘苗病毒，其中通过所述第二基因盒的NP的表达受控于mH5启动子
49.根据权利要求47所述的重组痘苗病毒，其中通过所述第二基因盒的NP的表达受控于selP启动子。
50.根据权利要求32-43中任一项所述的重组痘苗病毒，其中通过所述第一基因盒的所述hlHA/M2e融合蛋白的表达和通过所述第二基因盒的NP的表达受控于mH5启动子。
51.一种重组痘苗病毒，包含SEQ ID NO:1中所示的第一基因盒和SEQ ID NO:12中所示的第二基因盒。
52.根据权利要求32-51中任一项所述的重组痘苗病毒，其中所述痘苗病毒为改良型痘苗病毒安卡拉株(MVA)、缺陷型痘苗李斯特株(dVV)、MVA-575、MVA-BN、MVA-F6或MVA-M4。
53.根据权利要求32-51中任一项所述的重组痘苗病毒，其中所述痘苗病毒为MVA。
54.根据权利要求53所述的重组MVA，其中所述第一基因盒插入所述缺失I区、所述缺失II区、所述缺失III区、所述缺失IV区、所述胸苷激酶基因座、所述D4/5基因间区或所述HA基因座中的所述MVA。
55.根据权利要求53所述的重组MVA，其中所述第二基因盒插入所述缺失I区、所述缺失II区、所述缺失III区、所述缺失IV区、所述胸苷激酶基因座、所述D4/5基因间区或所述HA基因座中的所述MVA。
56.根据权利要求52或53中任一项所述的重组MVA，其中所述第一基因盒插入所述D4/5基因间区中的所述MVA。
57.根据权利要求52或53中任一项所述的重组MVA，其中所述第二基因盒插入所述缺失III区中的所述MVA。
58.权利要求58缺失。
59.根据权利要求52或53中任一项所述的重组MVA，其中所述第一基因盒插入所述D4/5基因间区中的所述MVA，并且所述第二基因盒插入所述缺失III区中的所述MVA。
60.一种药物组合物，包含权利要求52-59中任一项所述的重组MVA。
61.一种包含重组MVA的药物组合物，所述重组MVA包含编码SEQ ID NO: 2中所示的hlHA/M2e融合蛋白氨基酸序列的第一基因盒以及编码SEQ ID NO: 13中所示的甲型流感核蛋白(NP)的第二基因盒。
62.一种包含重组MVA的药物组合物，所述重组MVA包含SEQ ID NO:1中所示的hlHA/M2e融合蛋白第一基因盒和SEQ ID NO: 12中所示的NP第二基因盒。
63.一种诱导个体对甲型流感病毒的异源亚型免疫反应的方法，所述方法包括对所述个体施用药物组合物，所述药物组合物包含权利要求52-59中任一项所述的重组MVA。
64.一种用于诱导个体对甲型流感病毒的异源亚型免疫反应的药物组合物，所述方法包括对所述个体施用药物组合物的步骤，所述药物组合物包含权利要求52-59中任一项所述的重组MVA。
65.一种制备表达SEQ ID ΝΟ:1中所示的hlHA/M2e融合蛋白第一基因盒和SEQ IDNO: 12中所示的NP第二基因盒的重组MVA的方法，所述方法包括以下步骤: .a)用MVA感染原代鸡胚细胞或永久细胞系， .b)用质粒转染所述已感染细胞，所述质粒包含SEQID勵:1中所示的h1HA/M2e融合蛋白基因盒，并且包含位于所述基因盒侧翼的DNA，所述基因盒与所述MVA基因组的第一非必需区同源， . c)使所述细胞生长，以允许所述质粒在所述已感染细胞中所述MVA的复制过程中与所述MVA基因组重组，从而将所述hlHA/M2e融合蛋白基因盒插入所述第一非必需区中的所述MVA基因组， . d)获得所述制得的重组MVA； .e)用步骤d)的所述MVA感染原代鸡胚细胞或永久禽细胞系， .f)用质粒转染步骤e)的所述已感染细胞，所述质粒包含SEQID NO:12中所示的NP基因盒，并包含所述基因盒侧翼的DNA，所述基因盒与所述MVA基因组的第二非必需区同源，其中所述第二非必需区与所述第一非必需区不是相同区域， .g)使所述细胞生长，以允许所述质粒在所述已感染细胞中所述MVA的复制过程中与所述MVA基因组重组，从而将所述NP基因盒插入所述第二非必需区中的所述MVA基因组，以及 . h)获得所述制得的重组MVA。
66.根据权利要求65所述的方法，其中所述非必需MVA区为所述缺失I区、所述缺失II区、所述缺失III区、所述缺失IV区、所述胸苷激酶基因座、所述D4/5基因间区或所述HA基因座。
67.根据权利要求65所述的方法，其中所述第一非必需MVA区为所述D4/5基因间区。
68.根据权利要求65所述的方法，其中所述第二非必需MVA区为所述缺失III区。
69.根据权利要求65所述的方法，其中所述第一非必需MVA区为所述D4/5基因间区，并且所述第二非必需MVA区为所述缺失III区。
70.一种重组痘苗病毒，包含编码甲型流感无头血凝素(hlHA)多肽的第一基因盒和编码甲型流感核蛋白(NP)的第二基因盒。
71.根据权利要求70所述的重组痘苗病毒，其中所述hlHA多肽包含SEQID NO:15中所示的氨基酸序列。
72.根据权利要求70所述的重组痘苗病毒，其中所述NP包含SEQID NO: 13中所示的 氨基酸序列。
73.根据权利要求70-72中任一项所述的重组痘苗病毒，其中通过所述第一基因盒的所述hlHA多肽的表达受控于mH5启动子或selP启动子。
74.根据权利要求73所述的重组痘苗病毒，其中通过所述第一基因盒的所述hlHA多肽的表达受控于mH5启动子。
75.根据权利要求73所述的重组痘苗病毒，其中通过所述第一基因盒的所述hlHA多肽的表达受控于selP启动子。
76.根据权利要求70-72中任一项所述的重组痘苗病毒，其中通过所述第二基因盒的NP的表达受控于mH5启动子或selP启动子。
77.根据权利要求76所述的重组痘苗病毒，其中通过所述第二基因盒的NP的表达受控于mH5启动子。
78.根据权利要求76所述的重组痘苗病毒，其中通过所述第二基因盒的NP的表达受控于selP启动子。
79.根据权利要求70-72中任一项所述的重组痘苗病毒，其中通过所述第一基因盒的所述hlHA多肽的表达和通过所述第二基因盒的NP的表达受控于mH5启动子。
80.一种重组痘苗病毒，包含SEQ ID NO: 14中所示的hlHA第一基因盒和SEQ ID NO: 12中所示的NP第二基因盒。
81.根据权利要求70-80中任一项所述的重组痘苗病毒，还包含编码甲型流感Ml的第二基因盒。
82.根据权利要求81所述的重组痘苗病毒，其中所述Ml蛋白包含SEQID ΝΟ:11中所示的氨基酸序列。
83.根据权利要求82所述的重组痘苗病毒，其中所述Ml蛋白由SEQID NO: 10中所示的核苷酸序列编码。
84.根据权利要求70-83中任一项所述的重组痘苗病毒，其中所述痘苗病毒为改良型痘苗病毒安卡拉株(MVA)、缺陷型痘苗李斯特株(dVV)、MVA-575、MVA-BN、MVA-F6或MVA-M4。
85.根据权利要求70-83中任一项所述的重组痘苗病毒，其中所述痘苗病毒为MVA。
86.根据权利要求85所述的重组MVA，其中所述第一基因盒插入所述缺失I区、所述缺失II区、所述缺失III区、所述缺失IV区、所述胸苷激酶基因座、所述D4/5基因间区或所述HA基因座中的所述MVA。
87.根据权利要求85或86所述的重组MVA，其中所述第二基因盒插入所述缺失I区、所述缺失II区、所述缺失III区、所述缺失IV区、所述胸苷激酶基因座、所述D4/5基因间区或所述HA基因座中的所述MVA。
88.根据权利要求85所述的重组MVA，其中所述第一基因盒插入所述D4/5基因间区中的所述MVA。
89.根据权利要求85所述的重组MVA，其中所述第二基因盒插入所述缺失III区中的所述MVA。
90.根据权利要求85所述的重组MVA，其中所述第一和第三基因盒插入所述D4/5基因间区中的所述MVA，并且所述第二基因盒插入所述缺失III区中的所述MVA。
91.一种药物组合物，包含权利要求70-90中任一项所述的重组MVA。
92.一种包含重组MVA的药物组合物，所述重组MVA包含编码SEQ ID NO: 15中所示的无头HA(hlHA)氨基酸序列的第一基因盒以及编码SEQ ID NO: 13中所示的甲型流感核蛋白(NP)的第二基因盒。
93.一种包含重组MVA的药物组合物，所述重组MVA包含SEQ ID NO: 14中所示的hlHA第一基因盒和SEQ ID NO: 12中所示的NP第二基因盒。
94.一种包含重组MVA的药物组合物，所述重组MVA包含SEQ ID NO: 14中所示的hlHA第一基因盒、SEQ ID NO: 10中所示的Ml第二基因盒以及SEQ ID NO: 12中所示的NP第三基因盒。
95.一种诱导个体对甲型流感病毒的异源亚型免疫反应的方法，所述方法包括对所述个体施用药物组合物，所述药物组合物包含权利要求70-90中任一项所述的重组MVA。
96.一种用于诱导个体对甲型流感病毒的异源亚型免疫反应的药物组合物，所述方法包括对所述个体施用药物组合物的步骤，所述药物组合物包含权利要求70-90中任一项所述的重组MVA。
97.一种制备表达SEQ ID NO: 14中所示的hlHA第一基因盒和SEQ ID NO: 12中所示的NP第二基因盒的重组MVA的方法，所述方法包括以下步骤: a)用MVA感染原代鸡胚细胞或永久禽细胞系， b)用质粒转染所述已感染细胞,所述质粒包含SEQID NO: 14中所示的无头HA/M2e融合蛋白基因盒，并且包含位于所述基因盒侧翼的DNA，所述基因盒与所述MVA基因组的第一非必需区同源， c)使所述细胞生长，以允许所述质粒在所述已感染细胞中所述MVA的复制过程中与所述MVA基因组重组，从而将所述无头HA/M2e融合蛋白基因盒插入所述第一非必需区中的所述MVA基因组， d)获得所述制得的重组MVA； e)用步骤d)的所述MVA感染原代鸡胚细胞或永久禽细胞系， f)用质粒转染步骤e)的所述已感染细胞，所述质粒包含SEQID NO:12中所示的NP基因盒，并包含所述基因盒侧翼的DNA，所述基因盒与所述MVA的第二非必需区同源，其中所述第二非必需区与所述第一非必需区不是相同区域， g)使所述细胞生长，以允许所述质粒在所述已感染细胞中所述MVA的复制过程中与所述MVA基因组重组，从而将所述NP基因盒插入所述第二非必需区中的所述MVA基因组，以及 h)获得所述制得的重组MVA。
98.根据权利要求97所述的方法，其中所述非必需MVA区为所述缺失I区、所述缺失II区、所述缺失III区、所述缺失IV区、所述胸苷激酶基因座、所述D4/5基因间区或所述HA基因座。
99.根据权利要求97所述的方法，其中所述第一非必需MVA区为所述D4/5基因间区。
100.根据权利要求97所述的方法，其中所述第二非必需MVA区为所述缺失III区。
101.根据权利要求97所述的方法，其中所述第一非必需MVA区为所述D4/5基因间区，并且所述第二非必需M VA区为所述缺失III区。
【文档编号】A61K39/145GK103458922SQ201280015880
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2012年1月30日 优先权日:2011年1月31日
【发明者】法尔科-京特·福科内尔, 比尔吉特·沙弗尔, 阿内特·何塞尔, P·诺尔·巴尔莱特, 托马斯·R·克莱尔, 哈特穆特·厄尔里西 申请人:巴克斯特国际公司, 巴克斯特医疗保健股份有限公司