有功能的。组 成型启动子的实例包括来自巨细胞病毒（CMV)或SV40的启动子。诱导型启动子的实例包 括小鼠乳腺白血病病毒或金属硫蛋白的启动子。本领域普通技术人员可从容易获得的起始 材料中容易地生产用于用编码本发明的蛋白质的DNA转染细胞的遗传构建体。将包括编码 蛋白质的DNA的表达载体用来转化相容的宿主，然后将所述宿主在其中发生外源DNA表达 的条件下培养并保持。
[0089] 通过溶解细胞或者从适当的和本领域技术人员已知的培养基中将产生的蛋白质 从培养物中回收。本领域普通技术人员可使用公知技术来分离使用此类表达系统生产的蛋 白质。使用与以上所述的特定蛋白特异性结合的抗体从自然来源中纯化蛋白质的方法可同 样地应用于通过重组DNA方法产生的纯化蛋白质。
[0090] 除了通过重组技术生产蛋白质之外，还可以采用自动化肽合成仪来生产分离的、 基本上纯的蛋白。此类技术对于本领域普通技术人员是公知的，并且如果具有替代的衍生 物没有在DNA编码的蛋白质的生产中提供的话，此类技术是有用的。
[0091] 可使用几种公知技术中的任一种递送核酸分子，所述技术包括：有和没有体内电 穿孔的DNA注射（也称为DNA接种），脂质体介导，纳米颗粒促进，重组载体例如重组腺病 毒、重组腺病毒相关病毒和重组牛痘苗。优选地，本文所述的核酸分子例如DNA质粒是通过 DNA注射连同体内电穿孔递送。
[0092] 施用途径包括但不限于：肌内、鼻内、腹膜内、皮内、皮下、静脉内、动脉内、眼内 和口服以及局部地、经皮、通过吸入或栓剂或者至粘膜组织例如通过灌洗至阴道、直肠、 尿道、颊或舌下的组织。优选的施用途径包括肌内、腹膜内、皮内和皮下注射。遗传构建 体可以通过如下手段施用，包括但不限于：常规注射器、无针注射装置、"微弹轰击基因枪 (microprojectile bombardment gone gun)"或其他物理方法例如电穿孔（"EP"）、"流体 动力学方法"或超声。
[0093] 用于促进本发明的DNA疫苗的递送的优选的电穿孔装置和电穿孔方法的实例包 括在Draghia-Akli等人的美国专利第7, 245, 963号、Smith等人递交的美国专利申请公布 第2005/0052630号中描述的实例，两篇文献的内容通过引用将它们的全部内容并入本文。 还优选下述文献中提供的用于促进DNA疫苗的递送的电穿孔装置和电穿孔方法：2007年10 月17号提交的共同待审和共有拥有的美国专利申请系列号11/874072,它依据美国法典第 35条119款（e)要求享有2006年10月17日提交的美国临时申请系列号60/852, 149和 2007年10月提交的美国临时申请系列号60/978, 982的权益，所有这些文献均将其全部内 容并入本文。
[0094] Draghia-Akli等人的美国专利第7, 245, 963号描述了标准电极系统和它们用于 促进将生物分子导入身体或植物内选定组织的细胞中的用途。标准电极系统包括多个针状 电极；皮下针；提供从程序化恒定电流脉冲控制器到所述多个针状电极的传导连接的电连 接器；以及电源。操作者可以抓住装在支撑结构上的多个针状电极并将它们牢固地插入到 身体或植物内的选定组织中。然后将生物分子通过皮下针递送到选定组织中。程序化恒定 电流脉冲控制器被激活，并且恒定电流的电脉冲被应用到多个针状电极。应用的恒定电流 电脉冲促进生物分子导入到多个电极之间的细胞中。美国专利第7, 245, 963号的全部内容 通过引用并入本文。
[0095] Smith等人递交的美国专利申请公布第2005/0052630号描述了可被用来有效促 进生物分子导入到身体或植物内选定组织的细胞中的电穿孔装置。所述电穿孔装置包括由 软件或固件指定操作的电动装置（"EKD装置"）。EKD装置基于使用者的控制和脉冲参数 的输入在阵列中的电极之间产生一系列可程序化的恒定电流脉冲模式，并且允许电流波形 数据的存储和获取。电穿孔装置还包括具有针状电极阵列的可替代的电极盘、用于注射针 的中心注射通道以及可移去的引导盘。美国专利公开2005/0052630的全部内容通过引用 并入本文。
[0096] 美国专利第7, 245, 963号和美国专利申请公布第2005/0052630号中描述的电 极阵列和方法适合用于深深穿入例如肌肉的组织以及其他组织或器官。因为电极阵列的 配置，注射针（递送选择的生物分子）也被完全插入到靶器官中，并且注射被垂直施用至 由电极预先划定的区域中的靶组织。在美国专利第7, 245, 963号和美国专利申请公布 2005/005263中描述的电极优选地是20mm长以及21厚度（gauge)。
[0097] 以下是本发明的方法的一个实例，并且在以上讨论的专利参考文献中更详细地被 讨论：可以配置电穿孔装置来将产生的恒定电流的能量脉冲递送至哺乳动物的期望组织， 所述恒定电流类似于使用者的预设电流输入。电穿孔装置包括电穿孔部件和电极组件或手 柄组件。电穿孔部件可包括并掺入电穿孔装置的各种元件中的一个或多个，包括：控制器、 电流波形发生器、阻抗测验器、波形记录器、输入元件、状态报告元件、通信端口、记忆部件、 电源和电源开关。电穿孔部件能够作为电穿孔装置的一个元件起作用，并且其他元件是与 电穿孔部件保持联系的分开的元件（或部件）。在一些实施方案中，电穿孔部件能够作为多 于一个电穿孔装置的元件起作用，它还能够与电穿孔装置的其他元件保持联系，所述其他 元件与电穿孔部件是分开的。本发明不受作为机电装置或机械装置的零件存在的电穿孔装 置的元件限制，因为所述元件能够作为一个装置或者作为彼此保持联系的分开的元件起作 用。电穿孔部件能够递送在期望组织中产生恒定电流的能量脉冲，并且包括反馈机制。电极 组件包括在空间排布中具有多个电极的电极阵列，其中所述电极组件接收来自电穿孔部件 的能量脉冲并且将此能量脉冲通过电极递送到期望组织。多个电极中的至少一个在递送能 量脉冲的过程中是中性的，并且测量期望组织中的阻抗，并且将该阻抗传递到电穿孔部件。 反馈机制能够接收测量的阻抗并且能调整由电穿孔部件递送的能量脉冲以保持恒定电流。
[0098] 在一些实施方案中，所述多个电极能够以分散模式递送能量脉冲。在一些实施方 案中，所述多个电极能够通过在程序序列下控制电极以分散模式递送能量脉冲，并且所述 程序序列是由使用者输入到电穿孔部件中。在一些实施方案中，程序序列包括按顺序递送 的多个脉冲，其中多个脉冲中的每个脉冲是通过至少两个活性电极和测量阻抗的一个中性 电极递送，并且其中多个脉冲中的随后脉冲是通过至少两个活性电极中不同的一个和测量 阻抗的一个中性电极递送。
[0099] 在一些实施方案中，反馈机制是通过硬件或软件执行的。优选地，反馈机制是通过 模拟闭合环路执行的。优选地，这种反馈每50 μ s、20 μ s、10 μ s或1 μ s发生，但优选地是 实时反馈或是瞬时反馈（即如通过用于确定反应时间的可用技术所确定的基本上瞬时的 反馈）。在一些实施方案中，中性电极测量期望组织中的阻抗并且将该阻抗传递至反馈机 制，该反馈机制响应该阻抗，并调整能量脉冲以将恒定电流保持在与预设电流类似的值。在 一些实施方案中，反馈机制在递送能量脉冲的过程中连续地并瞬时地保持恒定电流。
[0100] 药学上可接受的赋形剂可包括例如运载体、佐剂、载体或稀释剂这类公共已知并 且可容易获得的功能分子。优选地，药学上可接受的赋形剂是佐剂或转染促进剂。在一些 实施方案中，将核酸分子或DNA质粒递送至细胞，并且施用多核苷酸功能增强剂或遗传疫 苗促进剂（或转染促进剂）。多核苷酸功能增强剂描述于美国专利第5, 593, 972号、美国专 利第5,962,428号和1994年1月26日提交的国际专利申请系列号？〇71^94/00899中，这 些文献各自通过引用并入本文。遗传疫苗促进剂描述于1994年4月1日提交的美国系列第 021，579号中，其通过引用并入本文。转染促进剂能够与核酸分子一起作为与核酸分子的混 合物施用，或者在核酸分子施用的同时、之前或之后分开施用。转染促进剂的实例包括表面 活性剂，例如免疫刺激复合物（ISC0MS);弗氏不完全佐剂；LPS类似物，包括单磷酰脂质A ; 胞壁酰肽；醌类似物以及小泡例如角鲨烯和角鲨烯；并且也可以使用透明质酸与遗传构建 体联合施用。在一些实施方案中，DNA质粒疫苗还可以包括转染促进剂，例如脂质；脂质体， 包括卵磷脂脂质体或本领域其他已知脂质体，为DNA脂质体混合物（参见例如W09324640); 钙离子；病毒蛋白；聚阴离子；聚阳离子或纳米颗粒；或者其他已知的转染促进剂。优选地， 转染促进剂是聚阴离子、聚阳离子，包括聚L谷氨酸（LGS)或脂质。
[0101] 在一些优选的实施方案中，将DNA质粒与佐剂一起递送，所述佐剂是进一步增强 针对此类靶蛋白的免疫反应的蛋白质的基因。此类基因的实例是那些编码其他细胞因子和 淋巴因子的基因，所述细胞因子和淋巴因子例如α-干扰素、γ-干扰素、血小板衍生的生 长因子（?〇6卩）、丁陬〇、丁陬0、61-〇5卩、表皮生长因子伍6卩）、11^-1、11^-2、11^-4、几-5、11^-6、 IL-10、IL-12、IL-18、MHC、CD80、CD86和IL-15,包括被删除信号序列的IL-15并任选地包 括来自IgE的信号肽。可能有用的其他基因包括编码以下的基因：MCP-l、MIP-la、MIP-lp、 IL-8、RANTES、L-选择素、P-选择素、E-选择素、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、 Mac-l、pl50. 95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-4、IL-18 的 突变体形式、⑶40、⑶40L、血管生长因子、成纤维细胞生长因子、IL-7、神经生长因子、血管 内皮生长因子、Fas、TNF 受体、Fit、Ap〇-l、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、 DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、胱天蛋白酶 ICE、Fos、c-jun、Sp-1、Ap-1、Ap-2、 p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、无活性 NIK、SAP K、SAP-1、JNK、干扰素反应基因、 NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK 配体、0x40、 0x40 配体、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAPI、TAP2 以及它们的 功能片段。
[0102] 根据本发明的DNA质粒疫苗包含的DNA量为从约1纳克到10毫克；约1微克到约 10毫克；或者优选地约〇. 1微克到约10毫克；或者更优选地约100微克到约1毫克。在一 些优选的实施方案中，根据本发明的DNA质粒疫苗包含约5纳克到约1000微克的DNA。在 一些优选的实施方案中，DNA质粒疫苗含有约10纳克到约800微克的DNA。在一些优选的 实施方案中，DNA质粒疫苗含有约0. 1微克到约500微克的DNA。在一些优选的实施方案 中，DNA质粒疫苗含有约1微克到约350微克的DNA。在一些优选的实施方案中，