鉴定或辅助鉴定h3亚型和h4亚型禽流感病毒的成套试剂的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域中鉴定或辅助鉴定H3亚型和H4亚型禽流感病毒的成套 试剂。
【背景技术】
[0002] 禽流感病毒（Avian influenza virus, AIV)是单股负链、分节段的RNA病毒，属于 正黏病毒科流感病毒属。根据AIV表面糖蛋白血凝素（hemagglutinin, HA)和神经氨酸酶 (neuraminidase, NA)的抗原性差异，AIV可进一步分为不同的亚型，目前已鉴别出17种HA 亚型（H1~H17)和10种NA亚型（N1~N10)。H3和H4亚型AIV属于低致病性AIV，在家 禽中混合感染较常见。同时，研宄表明当同一宿主细胞同时感染多种亚型AIV，不同毒株的 8个基因片段会发生基因重排形成新的毒株，对人类公共卫生安全存在潜在威胁，因此，应 加强对H3和H4亚型AIV混合感染的监测。
[0003] 目前，针对AIV的诊断主要通过病原分离、传统血清学方法鉴定及普通RT-PCR的 检测，该方法耗时费力、敏感性较低且对混合感染的AIV具有局限。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是如何鉴定H3亚型和/或H4亚型禽流感病毒。
[0005] 为解决上述技术问题，本发明首先提供了鉴定或辅助鉴定H3亚型和/或H4亚型 禽流感病毒的成套试剂。
[0006] 本发明所提供的鉴定或辅助鉴定H3亚型和/或H4亚型禽流感病毒的成套试剂， 由名称为H3-T的成套DNA和名称为H4-T的成套DNA组成；
[0007] 所述H3-T由名称为H3的PCR引物对和名称为H3-P的探针组成；所述H3由序列 表中SEQ ID No. 1所示的单链DNA(H3-F)和SEQ ID No. 2所示的单链DNA(H3-R)组成；所 述H3-P为序列表中SEQ ID No. 3所示的单链DNA;
[0008] 所述H4-T由名称为H4的PCR引物对和名称为H4-P的探针组成；所述H4由序列 表中SEQ ID No. 4所示的单链DNA(H4-F)和SEQ ID No. 5所示的单链DNA(H4-R)组成；所 述H4-P为序列表中SEQ ID No. 6所示的单链DNA。
[0009] 为解决上述技术问题，本发明还提供了鉴定或辅助鉴定H4亚型禽流感病毒的成 套 DNA。
[0010] 本发明所提供的鉴定或辅助鉴定H4亚型禽流感病毒的成套DNA为所述H4-T。
[0011] 为解决上述技术问题，本发明还提供了鉴定或辅助鉴定H3亚型和/或H4亚型禽 流感病毒的成套引物。
[0012] 本发明所提供的鉴定或辅助鉴定H3亚型和/或H4亚型禽流感病毒的成套引物， 由所述H3和所述H4组成。
[0013] 为解决上述技术问题，本发明还提供了PCR引物对。
[0014] 本发明所提供的PCR引物对，为鉴定或辅助鉴定H4亚型禽流感病毒的引物对；所 述鉴定或辅助鉴定H4亚型禽流感病毒的引物对为所述H4。
[0015] 为解决上述技术问题，本发明还提供了鉴定或辅助鉴定H3亚型和/或H4亚型禽 流感病毒的系统。
[0016] 本发明所提供的鉴定或辅助鉴定H3亚型和/或H4亚型禽流感病毒的系统（产品 和/或设备），为下述H-K中的任一种：
[0017]H、含有所述成套试剂的系统；
[0018]I、含有所述H4-T的系统；
[0019]J、含有所述成套引物的系统；
[0020] K、含有所述PCR引物对H4的系统。
[0021] 上述系统中，所述探针可标记有荧光染料。所述标记有荧光染料具体可为FAM和 / 或Eclipse和 / 或 R0X。
[0022] 在本发明的一个实施例中，所述H3-P的5'端标记有报告荧光染料FAM，3'端标记 有淬灭荧光染料Eclipse;所述H4-P的5'端标记有报告荧光染料R0X，3'端标记有淬灭荧 光染料Eclipse。
[0023] 上述系统可包括荧光PCR所需的试剂和仪器。具体来说，所述系统可包括所述成 套试剂、所述H3-T、所述H4-T、所述成套引物、所述PCR引物对H3或所述PCR引物对H4以 及荧光PCR所需要的其它试剂和仪器。所述荧光PCR所需要的其它试剂可为DNA聚合酶。
[0024] 上述系统还可仅包括所述成套试剂、所述成套DNA H3-T、所述成套DNA H4-T、所述 成套引物、所述PCR引物对H3或所述PCR引物对H4。
[0025] 所述成套试剂、所述成套DNA H3-T、所述成套DNA H4-T、所述成套引物、所述PCR 引物对H3或所述PCR引物对H4以及荧光PCR所需要的其它试剂均可独立包装。所述成套 试剂、所述H3-T、所述H4-T、所述成套引物、所述PCR引物对H3和所述PCR引物对H4中的 各引物对和/或各引物对的两条单链DNA和/或探针均可独立包装。
[0026] 荧光PCR所需要的其它试剂可包括Premix Ex Taq。荧光PCR所需要的其它仪器 可包括PCR仪。
[0027] 上述系统中，所述H还包括记载有下述内容的载体：在同一个PCR反应体系中，以 待测生物样品的核酸（DNA或RNA或cDNA)为模板，用所述成套试剂进行荧光PCR ;FAM通道 的结果呈阴性（即扩增曲线为直线）、R0X通道的结果呈阳性（即扩增曲线为S型曲线）， 所述待测样品含有H4亚型禽流感病毒；FAM通道的结果呈阳性（即扩增曲线为S型曲线）、 R0X通道的结果呈阴性（即扩增曲线为直线），所述待测样品含有H3亚型禽流感病毒；FAM 通道和R0X通道的结果均呈阴性（即扩增曲线为直线），所述待测样品不含H3或H4亚型禽 流感病毒。
[0028] 上述系统中，每20yL PCR反应体系可含有：所述PCR引物对H3(H3的每条引物 在反应体系中的浓度均为0. 6 y M)，所述探针H3-P (H3-P在反应体系中的浓度为0. 6 y M)， 所述PCR引物对H4 (H4的每条引物在反应体系中的浓度均为0. 4 y M)，所述探针H4-P (H4-P 在反应体系中的浓度为0.4 yM)，Premix Ex Taq 10 yL，待测病毒核酸，无菌蒸馏水补足 20 y L〇
[0029] 上述系统中，所述I还包括记载有下述内容的载体：在同一个PCR反应体系中，以 待测生物样品的核酸〇)NA或RNA或cDNA)为模板，用所述H4-T进行荧光PCR ;R0X通道的 结果呈阳性（即扩增曲线为S型曲线），所述待测样品含有H4亚型禽流感病毒；ROX通道的 结果呈阴性（即扩增曲线为直线），所述待测样品不含有H4亚型禽流感病毒。
[0030] 上述系统中，每20yL PCR反应体系可含有：所述PCR引物对H4(H4的每条引物 在反应体系中的浓度均为0. 4 y M)，所述探针H4-P (H4-P在反应体系中的浓度为0. 4 y M)， Premix Ex Taq 10 yL，待测病毒核酸，无菌蒸馏水补足20 yL。
[0031] 上述系统中，所述FAM通道可为在530nm激发光下的FAM通道；所述R0X通道可为 在610nm激发光下的R0X通道。
[0032] 为解决上述技术问题，本发明还提供了下述任一方法：
[0033] 1)所述成套试剂的制备方法，包括将各引物对的所述两条单链DNA和/或各引物 对和/或各探针分别单独包装得到所述成套试剂的步骤；
[0034] 2)所述H4-T的制备方法，包括将所述H4的所述两条单链DNA和/或所述H4-P分 别单独包装得到所述成套DNA的步骤；
[0035] 3)所述成套引物的制备方法，包括将各引物对的所述两条单链DNA和/或各引物 对分别单独包装得到所述成套引物的步骤；
[0036] 4)所述H4的制备方法，包括将所述H4的所述两条单链DNA分别单独包装得到所 述PCR引物对的步骤。
[0037] 为解决上述技术问题，本发明还提供了下述任一应用：
[0038] 1)所述成套试剂在制备鉴定或辅助鉴定H3亚型和/或H4亚型禽流感病毒的系统 中的应用；
[0039] 2)所述H4-T在制备鉴定或辅助鉴定H4亚型禽流感病毒的系统中的应用；
[0040] 3)所述成套引物在制备鉴定或辅助鉴定H3亚型和/或H4亚型禽流感病毒的系统 中的应用；
[0041] 4)所述H4在制备鉴定或辅助鉴定H4亚型禽流感病毒的系统中的应用。
[0042] 本发明中，所述成套试剂的所述成套DNA H3-T和所述成套DNA H4-T -起使用 时，所述H3-F、所述H3-R、所述H3-P、所述H4-F、所述H4-R和所述H4-P的摩尔数可为 3:3 :3:2:2:2。所述成套DNA H3-T单独使用时，所述成套DNA H3-T的所述H3-F、所述H3-R 和所述H3-P的摩尔数可为1:1:1。所述成套DNA H4-T单独使用时，所述成套DNA H4-T的 所述H4-F、所述H4-R和所述H4-P的摩尔数可为1:1:1。所述PCR引物对H3的所述H3-F 和所述H3-R的摩尔数可为1:1。所