用于全ras突变检测的引物、探针及检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种生物技术领域，尤其涉及一种用于全RAS突变检测的引物、探针 及检测试剂盒。
[0002]
【背景技术】
[0003] RAS基因家族是原癌基因，包括KRAS、NRAS和HRAS三个基因。KRAS基因定位于 人12号染色体，在人类肿瘤发生发展过程中起重要的作用。KRAS就像一种分子开关：正常 时能控制调控细胞生长的路径；发生异常如KRAS基因突变时，该基因永久活化，使细胞内 信号传导紊乱，导致细胞持续生长，并阻止细胞凋亡从而发生癌变。KRAS基因突变发生在 肿瘤的早期，并且原发灶和转移灶的KRAS基因高度保持一致。一般认为，KRAS基因状态不 会因治疗而发生变化。KRAS基因在多种肿瘤中发生了突变，其发生率在结直肠癌约为40%， 胰腺癌为90%以上，肺癌约为15%。KRAS基因突变主要集中发生在第2外显子的12和13 密码子（彡90%)，这些突变破坏了 KRAS蛋白内在的GTPase活性，从而使得KRAS蛋白处于 持续活性状态（Fedorenko I V et al. Oncogene. 2012)。研宄表明检测KRAS基因突变，具 有重大的临床意义：KRAS基因突变患者对EGFR抑制剂如西妥昔单抗（Cetuximab)和帕尼 单抗（panitumumab)显示无效，只有KRAS野生型患者才被建议接受EGFR抑制剂的治疗（De Roock ff et al. Lancet Oncol. 2010;11:753-762. )〇
[0004] NRAS基因定位于人染色体lpl3. 2,基因全长12438bp，包含7个外显子，为原癌基 因。NRAS基因激活构成癌基因，其表达产物NRAS蛋白发生构型及功能的改变，活化状态的 Ras蛋白持续地激活PLC产生第二信使，造成细胞不可控制地增殖，恶变（D. Lambrechts et al. Journal of Clinical Oncology 2009: 4020)〇
[0005] NRAS基因改变主要为点突变，多发生在以第61密码子为代表的2、3、4外显 子。这些密码子编码的氨基酸是Ras蛋白和GTP酶活化蛋白（GAP)的作用位点。突变导致 RAS-GTP处于持续激活状态，引起细胞恶性增殖和转移。研宄表明：KRAS、NRAS、BRAF基因 同为野生型的患者cetuximab治疗效果较好，而NRAS基因突变患者无法从cetuximab治疗 中获益（Cecily P. Vaughn et al.GenesChromosomes and Cancer 2011:307-312，M. Di Bartolomeoet al. Targeted Oncology 2014:155-162. )〇
[0006] 2015年NCCN指南明确指明患有侵润性结直肠癌的患者，在利用西妥昔和帕尼 单抗等EGFR单抗类药物时要进行全RAS检测（NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology for Colon Cancer. 2015)。目前临床上有的RAS检测产品只包括KRAS基因的 第12, 13密码子位点检测，检测位点比较少，已远远不能满足临床检测的需要。
[0007]
【发明内容】
[0008] 本发明的目的：提供一种用于全RAS突变检测的引物、探针及检测试剂盒，能检测 位点全，与现有技术的KRAS临床检测7种突变类型相比，检测KRAS 27种突变类型、NRAS 23种突变类型，很好的满足了临床的需求；利用了MGB Blocker封闭探针，提高了检测的灵 敏度，降低了非专一性结合，使得临床检测结果更好判读。
[0009] 为了实现上述目的，本发明的技术方案是： 一种用于全RAS突变检测的引物、探针，包括全RAS的特异引物与探针，所述的全RAS 的特异引物与探针包括KRAS 2、3、4外显子的27种突变类型及NRAS 2、3、4外显子的23种 突变类型。
[0010] 所述的KRAS外显子2的12，13外显子位点点突变引物，FAM-MGB Taqman探针以 及Blocker封闭的MGB探针具体为： K35-1B 5-ACTTGTGGTAGTTGGAGCTGA-3 SEQ ID N0.0 1 K35-3B 5-ACTTGTGGTAGTTGGAGCTGT-3 SEQ ID N0.0 2 K35-2B 5-CTTGTGGTAGTTGGAGCTGC-3 SEQ ID N0.0 3 K34-2B 5-AACTTGTGGTAGTTGGAGCTC-3 SEQ ID N0.0 4 K34-1B 5-AAACTTGTGGTAGTTGGAGCTA-3 SEQ ID N0.0 5 K34-3B 5-AACTTGTGGTAGTTGGAGCTT-3 SEQ ID N0.0 6 K38-1B-1 5-TGGTGGTTGGAGCAGGTGA-3 SEQ ID N0.0 7 K38-2B-1 5-GGTGGTTGGAGCAGGTGC-3 SEQ ID N0.0 8 K38-3B-1 5-TGGTGGTTGGAGCAGGTGT-3 SEQ ID N0.0 9 K37-1B 5-TGTGGTAGTTGGAGCTGGTA-3 SEQ ID NO. 10 K37-2B 5-TGTGGTAGTTGGAGCTGGTC-3 SEQ ID NO. 11 K37-3B 5-TGTGGTAGTTGGAGCTGGTT-3 SEQ ID NO. 12 KWT34MGB 5-GGAGCTGGTGGCGTAG-3-MGB SEQ ID NO. 13 KR-R 5-AGAATGGTCCTGCACCAGTAATAT-3 SEQ ID NO. 14 KR-Taqman FAM-5- CAAGAGTGCCTTGACGATAC-3-BHQ-MGB SEQ ID NO. 15 ; 所述的KRAS外显子3的61编码子位点点突变引物，FAM-MGB Taqman探针以及Blocker封闭的MGB探针具体为： K181-1B 5-GATATTCTCGACACAGCAGGTA-3 SEQ ID NO. 16 K181-2B 5-ATATTCTCGACACAGCAGGTG-3 SEQ ID NO. 17 K182-1B 5-TCTCGACACAGCAGGTCC-3 SEQ ID NO. 18 K182-2B 5-TCTCGACACAGCAGGTCG-3 SEQ ID NO. 19 K182-3B 5-ATTCTCGACACAGCAGGTCT-3 SEQ ID NO. 20 K183-1B 5-TCTCGACACAGCAGGTCAC-3 SEQ ID NO. 21 K183-2B 5-TCTCGACACAGCAGGTCAT-3 SEQ ID NO. 22 K181R 5-AATACACAAAGAAAGCCCTCCC-3 SEQ ID NO. 23 K181WTMGB 5-GACACAGCAGGTCAAGAGG-3-MGB SEQ ID NO. 24 K181taqman FAM-5-AATGAGGGACCAGTACATG-3-BHQ-MGB SEQ ID NO. 25 ； 所述的KRAS外显子4的117编码子位点点突变引物，FAM-MGB Taqman探针以及Blocker封闭的MGB探针具体为： K349-1B-1 5-ACCTATGGTCCTAGTAGGAAATG-3 SEQ ID NO. 26 K350-1B-1 5-ACCCTATGGTCCTAGTAGGAAATAG-3 SEQ ID NO. 27 K351-1B-1 5-CCTATGGTCCTAGTAGGAAATAAC-3 SEQ ID NO. 28 K351-2B-1 5-CCTATGGTCCTAGTAGGAAATAAT-3 SEQ ID NO. 29 K349R 5-ACTTCTTGCTAAGTCCTGAGCCT-3 SEQ ID NO. 30 KWT349MGB1 5-GTCCTAGTAGGAAATAAATGTGA-3-MGB SEQ ID NO. 31 K349Taqman FAM-5-ATTTGCCTTCTAGAACAGTAG-3-BHQ-MGB SEQ ID NO. 32 ; 所述的KRAS外显子4的146编码子位点点突变引物，FAM-MGB Taqman探针以及 Blocker封闭的MGB探针具体为： K436-1B 5-GTTACTTACCTGTCTTGTCTTTGT-3 SEQ ID NO. 33 K436-2B 5-TACTTACCTGTCTTGTCTTTGG-3 SEQ ID NO. 34 K437-1B 5-TGTTACTTACCTGTCTTGTCTTTC-3 SEQ ID NO. 35 K437-2B 5-TGTTACTTACCTGTCTTGTCTTTA-3 SEQ ID NO. 36 K436R 5-TGATTTGCCTTCTAGAACAGTAGAC-3 SEQ ID NO. 37 KWT436MGB 5-CTGTCTTGTCTTTGCTGATG-3-MGB SEQ ID NO. 38 K436Taqman FAM-5- ACTTCTTGCTAAGTCCTGAGC-3-BHQ-MGB SEQ ID NO. 39 ; 所述的NRAS外显子2的12,13编码子位点点突变引物，FAM-MGB Taqman探针以及 Blocker封闭的MGB探针具体为： N34-1B 5-TGGTGGTGGTTGGAGCAA-3 SEQ ID NO. 40 N34-2B 5-TGGTGGTGGTTGGAGCAC-3 SEQ ID NO. 41 N34-3B 5-TGGTGGTGGTTGGAGCAT-3 SEQ ID NO. 42 N35-1B 5-GGTGGTGGTTGGAGCAGA-3 SEQ ID NO. 43 N35-2B 5-GGTGGTGGTTGGAGCAGC-3 SEQ ID NO. 44 N35-3B 5-GGTGGTGGTTGGAGCAGT-3 SEQ ID NO. 45 N37-1B 5-GTGGTGGTTGGAGCAGGTA-3 SEQ ID NO. 46 N37-2B 5-GGTGGTTGGAGCAGGTC-3 SEQ ID NO. 47 N37-3B 5-GTGGTGGTTGGAGCAGGTT-3 SEQ ID NO. 48 N38-1B 5-GGTGGTTGGAGCAGGTGA-3 SEQ ID NO. 49 N38-2B 5-GTGGTTGGAGCAGGTGC-3 SEQ ID NO. 50 N38-3B 5-GGTGGTTGGAGCAGGTGT-3 SEQ ID NO. 51 N34R 5-CTCACCTCTATGGTGGGATCATAT-3 SEQ ID NO. 52 N34taqman FAM-5- AAGCGCACTGACAATCC-3-BHQ-MGB SEQ ID NO. 53 NWT34MGB 5-GTTGGAGCAGGTGGTGTTG-3-MGB SEQ ID NO. 54 ； 所述的NRAS外显子3的61编码子位点点突变引物，FAM-MGB Taqman探针以及 Blocker封闭的MGB探针具体为： N181R 5-ATGGCAAATACACAGAGGAAGC-3 SEQ ID NO. 55 N181-1B 5-GACATACTGGATACAGCTGGAA-3 SEQ ID NO. 56 N181-2B 5-GACATACTGGATACAGCTGGAG-3 SEQ ID NO. 57 N181-3B 5-GACATACTGGATACAGCTGGAT-3 SEQ ID NO. 58 N182-1B 5-CATACTGGATACAGCTGGACC-3 SEQ ID NO. 59 N182-2B 5-ATACTGGATACAGCTGGACG-3 SEQ ID NO. 60 N182-3B 5-ACATACTGGATACAGCTGGACT-3 SEQ ID NO. 61 N183-1B 5-CATACTGGATACAGCTGGACAC-3 SEQ ID NO. 62 N183-2B 5-CATACTGGATACAGCTGGACAT-3 SEQ ID NO. 63 N181Taqman FAM-5- AATACATGAGGACAGGCG-3-BHQ-MGB SEQ ID NO. 64 NWT181MGB 5-GATACAGCTGGACAAGAAGAG-3-MGB SEQ ID NO. 65 ； 所述的NRAS外显子4的146编码子位点点突变引物，FAM-MGB Taqman探针以及 Blocker封闭的MGB探针具体为： N436-1B 5-ATTCCATTCATTGAAACCTCAA-3 SEQ ID NO. 66 N437-1B 5-ATTCCATTCATTGAAACCTCAGT-3 SEQ ID NO. 67 NWT436MGB 5-ATTGAAACCTCAGCCAAGAC-3-MGB SEQ ID NO. 68 N436R 5-GAATATGGATCACATCTCTACCAG-3 SEQ ID NO. 60 N436Taqman FAM-5-ACAGCTTTCAGCATTTGTG-3-BHQ-MGB SEQIDN0.70。
[0011] 上述的用于全RAS突变检测的引物、探针，其中，还包括人类基因组野生型位点引 物，FAM-MGB Taqman探针，参考加样孔具体为： RefF CCAAGGCAC