检测egfr基因突变的试剂盒及其检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及检测EGFR基因突变的试剂盒，该涉及利用该 试剂盒在非疾病诊断中检测EGFR基因突变的方法。
【背景技术】
[0002] 表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR)是原癌基因 C-erbB-l(HER-l)的表达产物，定位于细胞膜上，一种跨膜受体酪氨酸激酶。EGFR主要通过 两条途径将信号传递至细胞核，一条是Ras - Raf - MAPK途径；另一条是PI3K - PKC - IKK 途径。当信号传导至细胞核后，引起核内基因转录水平的增加，使细胞增殖、转化。EGFR信 号传导的异常是导致多种肿瘤发生的原因。
[0003] 目前革E1向治疗已经成为非小细胞肺癌（Non-Small Cell Lung Cancer，NSCLC) 临床治疗的重要手段。易瑞沙（Iressa/吉非替尼/Gefitinib，阿斯利康）和特罗凯 (Tarceva/厄罗替尼/Erlotinib，罗氏制药）作为表皮生长因子受体（Epidermal Growth Factor Rec印tor，EGFR)酪氨酸激酶抑制剂（TKI)，是美国FDA批准用于NSCLC靶向治疗的 主要药物。但是，临床试验表明易瑞沙和特罗凯仅对10-30%的NSCLC病人有显著疗效。进 一步的研宄发现EGFR基因突变与NSCLC靶向治疗疗效相关，多数携带EGFR基因突变的患 者疗效显著。
[0004] 临床研宄证实，18-21外显子突变可作为TKI治疗的有效预测指标。各种来源的 肺癌组织是检测突变的最佳样本，但部分中晚期患者难以得到较佳的病理组织，检测血液 中来自肿瘤的DNA是否有突变是一种趋势。肿瘤患者的血液循环DNA，亦称非细胞游离 DNA (cell-free DNA，cfDNA)中包含肿瘤起源的DNA。肿瘤cfDNA包括来源于正常细胞的野 生型DNA和肿瘤细胞DNA，多项研宄表明肿瘤患者血液中可以检测到与自身肿瘤相一致的 DNA突变。
[0005] 因此，检测组织或血液EGFR基因突变对于指导NSCLC病人临床用药，具有重要的 参考价值。
[0006]目前检测基因突变的方法主要有以下几种：
[0007] (1)直接测序法。直接测序法的原理是：首先针对突变位点设计引物（每个基因设 计一对引物，引物所对应的产物尽可能的包含突变位点所在的位置），然后通过简单PCR扩 增获得目的基因产物，最后对PCR产物进行测序并且对测序结果进行初步分析。初步分析 完成后，对一些可能的突变样品的PCR产物，需要对目的条带进行切胶回收；回收后的PCR 产物连接克隆载体；挑选阳性克隆测序并对测序结果进行分析。此过程比较繁琐、耗时长， 而且由于测序方法本身的限制导致其灵敏度不高，只能对含量大于20%的基因突变进行检 测。因此，此法不适合在临床中的应用与大量的临床样本分析。
[0008]⑵变性高效液相色谱法（denaturing high-performance liquid chromatograph，DHPLC)。该方法的原理是基于发生错配的杂合双链DNA与完全匹配的纯合 双链DNA解链特征的差异将他们分离开。由于杂合双链在突变位点处出现错配，更易于形 成"Y"形结构，与固定相的结合能力降低，因此杂合DNA链要比纯合DNA链优先洗脱出来， 通过洗脱峰的不同判断有无突变存在。DHPLC可检测出含有单个检测的突变、插入或者缺失 的异源双链片段。该法对已知和未知的突变位点均可以检测，敏感性在5%左右，但检测过 程中需要打开反应管，容易造成污染，而且阳性结果不能确认其具体未知，最终还需测序确 认。
[0009] (3)高分辨率溶解曲线（high resolution melting，HRM)。高分辨率溶解曲线是 基于核酸的物理性质，通过饱和染料结合于PCR扩增产物，监控产物熔解曲线的变化分析 基因突变。检测敏感性在5%左右，对于阳性结果并不能确定其具体位置，最终还需要通过 测序加以确认。
[0010] (4)探针扩增阻滞突变法（amplification refractory mutation system，ARMS)。 利用PCR引物的3'端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增的原理，设计针对突变 位点的特异性PCR扩增引物，在严格的条件下，只有在引物3'碱基与模板配对时PCR扩增 反应才能正常进行，从而检测出突变。通过设计两个5'端引物，一个与正常DNA互补，一个 与突变DNA互补，对于纯和性突变，分别加入两种引物及3'端引物进行两个平行的PCR，结 合有与突变DNA完全互补的引物才可以延伸并得到PCR扩增产物，该检测方法的灵敏度在 1%左右。
[0011] (5)等位基因特异的Taqman聚合酶链式反应（competitive allele-specific TaqMan polymerase chain reaction，CAST-PCR)。CAST-PCR 法米用优化 TaqMan 探针，通 过一段特异设计的MGB探针来阻止引物与野生型DNA结合，选择性的优先扩增突变型DNA， 该检测方法的灵敏度在1-0. 1 %左右。
[0012] 因此，急需一种提高检测EGFR基因的灵敏度的方法和相应的检测试剂盒，为肺癌 个体化用药提供指导。
【发明内容】
[0013] 有鉴于此，本发明的目的之一在于提供检测EGFR基因突变的试剂盒，该试剂盒特 异性强且灵敏度高；本发明的目的之二在于提供检测EGFR基因突变，该方法检测周期短。
[0014] 为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
[0015] 1、检测EGFR基因突变的试剂盒，所述试剂盒含有针对EGFR基因突变位点的LNA 锁核酸修饰的Block序列。
[0016] 优选的，所述LNA锁核酸修饰的Block序列如下：
[0017] G719X：CC+GGAG+C+CCAGCACTTTG-P04；
[0018] 19-del：TA+TCAAGGAATTA+A+GA+GAAGCAACATCTC-P04；
[0019] 20-Insertions ：GGACAAC+CC+CCAC+G+TGTGC-P04；
[0020] T790M ：AT+CA+C+G+C+AGCTCATGCC-P0 4；
[0021] S7681 ：GG+C+CA+GCG+TGGACAACCC-P0 4 ；
[0022] L858R ：GG+GC+T+GG+CC+AAACTGCTG-P0 4 ；
[0023] L861Q ：AC+T+G+CTG+GG+TGCGGAAGAGAAAG-P04；
[0024] 其中" + "后的T，A，C或G表示锁核酸修饰碱基。
[0025] 优选的，所述试剂盒中还包含检测EGFR基因突变的引物，所述引物的核苷酸序列 如所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1与SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 1与SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.1 与 SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.5 与 SEQ ID N0.24、SEQ ID N0.6 与 SEQ ID N0.24、SEQ ID NO. 7 与 SEQ ID NO. 24、SEQ ID NO. 8 与 SEQ ID NO. 24、SEQ ID NO. 9 与 SEQ ID NO. 24、 SEQ ID NO. 10 与 SEQ ID NO. 24、SEQ ID NO. 11 与 SEQ ID NO. 24、SEQ ID NO. 12 与 SEQ ID NO. 24、SEQ ID NO. 13 与 SEQ ID NO. 24、SEQ ID NO. 14 与 SEQ ID NO. 24、SEQ ID NO. 15 与 SEQ ID NO. 24、SEQ ID NO. 16 与 SEQ ID NO. 24、SEQ ID NO. 17 与 SEQ ID NO. 24、SEQ ID NO. 18 与 SEQ ID NO. 24、SEQ ID NO. 19 与 SEQ ID NO. 24、SEQ ID NO. 20 与 SEQ ID NO. 24、 SEQ ID NO. 21 与 SEQ ID NO. 24、SEQ ID NO. 22 与 SEQ ID NO. 24、SEQ ID NO. 23 与 SEQ ID NO. 24、SEQ ID NO. 25 与 SEQ ID NO. 28、SEQ ID NO. 26 与 SEQ ID NO. 28、SEQ ID NO. 27 与 SEQ ID NO. 28、SEQ ID NO. 29 与 SEQ ID NO. 30、SEQ ID NO. 31 与 SEQ ID NO. 32 或 SEQ ID NO. 33 与 SEQ ID NO. 34 所示。
[0026] 更优选的，所述试剂盒中还包括PCR缓冲液、dNTPs、Eva Green和二氯化镁。
[0027] 更优选的，所述试剂盒中各组分的终浓度如下：1XPCR buffer、2. 5mM MgCl2、dNTP 250 y M、引物 250nM、探针 500nM、1 X EVE GREEN、DNA 聚合酶 1U 和 DNA 模板 2-20ng。
[0028] 2、所述检测EGFR基因突变的试剂盒在非疾病诊断中检测EGFR基因突变的方法， 包括如下步骤：
[0029] a.设计检测EGFR基因突变的引物和针对EGFR基因突变位点的LNA锁核酸修饰的 Block ；
[0030] b.从待测样品中提取模板DNA，然后利用步骤a得到的引物和Block进行荧光定 量PCR扩增反应；
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