一种单细胞基因组扩增后扩增产物质量鉴定的方法和试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子细胞生物学领域，具体涉及一种单细胞基因组扩增产物质量鉴定 的方法和试剂盒。
【背景技术】
[0002] 在单细胞水平下对DNA进行研宄能够有效地避免多细胞水平研宄的诸多局限，尤 其在胚胎领域。由于对早期胚胎进行染色体检测，必须进行单细胞水平的DNA分析。因此， 开发应用于单个细胞研宄的技术方法，以便揭示细胞异质性的规律，对于更好地进行细胞 生物学研宄具有重大的意义。单细胞分析中，包括对单细胞基因组、表达谱和代谢组的研 宄。目前，微量DNA和单细胞基因组研宄已被广泛应用于考古学、微生物生态学、医学检测、 法医学检测、临床诊断等领域。在生殖医学中，单细胞研宄对产前诊断、胚胎植入前遗传诊 断、精子和卵子的遗传病诊断等意义尤为重大。
[0003] 目前，主要通过对单细胞基因组进行测序来进行单细胞基因组分析。因为，常用 的DNA分析方法例如聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR)、限制性片段长 度多态性分析（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)、单链构象多态性分 析（SSCP)、指纹技术和焚光原位杂交技术（Fluorescence in Situ Hybridization，FISH) 等，只能对单细胞基因组的部分区域或已知位点进行研宄，且缺乏对全新物种的基因组 研宄的有效策略，而对单细胞基因组进行测序可以有效避免这些不足。单细胞基因组的 DNA量为皮克级水平，而目前的测序技术要求起始DNA量为微克级水平，因此，必须将单细 胞基因组进行全基因组扩增（WGA)使之达到足够量。然而已知的全基因组扩增方法包括 PEP-PCR，D0P-PCR (简并寡核苷酸引物的聚合酶链反应）等基于PCR的方法，以及多重链置 换扩增（MDA, Multiple Displacement Amplification)，均容易受到较多因素干扰，无法 保证扩增达到100%的成功率。而对于扩增效率和扩增产物的质量评估，目前只能依据扩增 后条带的均匀性及片段长度来判断，但这种方法存在很大的局限性。因此，亟需设计一种新 的单细胞基因组扩增产物质量鉴定的方法和试剂盒以解决现有技术存在的上述不足。
[0004]
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种单细胞基因组扩增产物质量鉴定的方法和试剂盒，以克 服目前现有技术存在的上述不足。
[0006] 本发明的目的是通过以下技术方案来实现： 一种单细胞基因组扩增产物质量鉴定的方法，包括以下步骤： 对单细胞进行分离并裂解，得到该单细胞的全基因组DNA ; 对全基因组DNA进行单细胞全基因组扩增，得到全基因组扩增产物； 采用5对基因组上保守区段的特异性引物，将其放在一个扩增体系中，以全基因组扩 增产物为模板进行PCR扩增，对5个扩增产物进行电泳检测，根据检测结果判断全基因组扩 增产物的质量，结果显示为在电泳图上均匀分布条带的3-5个扩增产物为符合测序要求的 扩增产物样品； 对符合测序要求的扩增产物构建DNA测序文库； 对所述DNA测序文库进行高通量测序。
[0007] 优选的，单细胞全基因组的扩增技术为多重置换扩增MDA全基因组扩增技术。
[0008] 优选的，所述单细胞为人单细胞，基因组上保守区段选自DCTN6、RPL37A、URI1、 SNTA1、人13号染色体上位置82722059、SEMA3A、人16号染色体上位置86386387、RAD9A、 DIRC3、EIF2B1中的5种或多于5种。
[0009] 优选的，所述基因组上保守区段的特异性引物序列为： URI1 引物 1 :TTCTGTTGAAGGAAAGAAGGTAGG， URI1 引物 2 :GTCTGATATTTTGGTGCACCCATTAC ; chrl3_82722059 引物 1 :ACAGAAGTCTGGGATGTGGAGGA， chrl3_82722059 引物 2 :GGGCAGCCCAAAAAGACAGACAGA ; SEMA3A 引物 1 :CCATGTTGGTCAG， SEMA3A 引物 2 :GATTCCACATTTA ; chrl6_86386387 引物 1 :TTTGTGTGTGCATCTGTAAGCATG， chrl6_86386387 引物 2 :GGGGGTCTAAGAGCTTGTAAAAAG ; DIRC3 引物 1 : TGTGGAGTGGAGGTGCCTAAAG DIRC3 引物 2 :GTCCTACCAGAATGCCAGTCC ; DCTN6 引物 1 : CTGGGATCTCTCCCTTGGGCGTAAA， DCTN6 引物 2 :TTCAGGACAGTGATGCCCCAGGAA ; RPL37A 引物 1 : GCCTGAGGCTTGGTGGTGTGTATCC， RPL37A 引物 2 :AGTGCTGGTGAAGGGTCACAGCCA ; SNTA1 引物 1 :TGGCCCAGAGTGGGAGGTCATTGT， SNTA1 引物 2 :TGTTGCCCTATCCCATGCTGGAGA ; RAD9A 引物 1 :TGATTTGGGGTGGGGTGAATGTGA， RAD9A 引物 2 :AGTGGCTCAGCATGTCAAGGCCAG ; EIF2B1 引物 1 :GGGAAGCCCAAGGGCCTGATTCTA， EIF2B1 引物 2 :TCATCCCGCAGCTCCAGTCTTCATC。
[0010] 一种单细胞基因组扩增产物质量鉴定的试剂盒，包括所述基因组上保守区段的特 异性引物，以对全基因组扩增产物进行基因组上保守区段检测。
[0011] 优选的，所述单细胞为人单细胞，基因组上保守区段选自DCTN6、RPL37A、URI1、 SNTA1、人13号染色体上位置82722059、SEMA3A、人16号染色体上位置86386387、RAD9A、 DIRC3、EIF2B1中的5种或多于5种。
[0012] 优选的，所述基因组上保守区段的特异性引物序列为： URI1 引物 1 :TTCTGTTGAAGGAAAGAAGGTAGG， URI1 引物 2 :GTCTGATATTTTGGTGCACCCATTAC ; chrl3_82722059 引物 1 :ACAGAAGTCTGGGATGTGGAGGA， chrl3_82722059 引物 2 :GGGCAGCCCAAAAAGACAGACAGA ; SEMA3A 引物 1 :CCATGTTGGTCAG， SEMA3A 引物 2 :GATTCCACATTTA ; chrl6_86386387 引物 1 :TTTGTGTGTGCATCTGTAAGCATG， chrl6_86386387 引物 2 :GGGGGTCTAAGAGCTTGTAAAAAG ; DIRC3 引物 1 :TGTGGAGTGGAGGTGCCTAAAG DIRC3 引物 2 :GTCCTACCAGAATGCCAGTCC ; DCTN6 引物 1 :CTGGGATCTCTCCCTTGGGCGTAAA， DCTN6 引物 2 :TTCAGGACAGTGATGCCCCAGGAA ; RPL37A 引物 1 :GCCTGAGGCTTGGTGGTGTGTATCC， RPL37A 引物 2 :AGTGCTGGTGAAGGGTCACAGCCA; SNTA1 引物 1 :TGGCCCAGAGTGGGAGGTCATTGT， SNTA1 引物 2 :TGTTGCCCTATCCCATGCTGGAGA; RAD9A 引物 1 :TGATTTGGGGTGGGGTGAATGTGA， RAD9A 引物 2 :AGTGGCTCAGCATGTCAAGGCCAG; EIF2B1 引物 1 :GGGAAGCCCAAGGGCCTGATTCTA， EIF2B1 引物 2 :TCATCCCGCAGCTCCAGTCTTCATC。
[0013] 优选的，所述试剂盒还含有用于对单细胞进行全基因组扩增的试剂成分，所述单 细胞全基因组扩增采用多重置换扩增MDA或DOP-PCR。
[0014] 本发明的有益效果为：设计合理，能够在单细胞基因组的全基因组扩增产物测序 前，对全基因组扩增产物进行检测和筛选，以去除未扩增成功的样本，保证后续单细胞基因 组测序的成功率，避免扩增产物质量不合格导致人力、物力浪费。
[0015]
【附图说明】
[0016] 下面为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例 中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些 实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附 图获得其他的附图。
[0017] 图1是本发明实施例所述的单细胞基因组扩增产物