专利名称：一种建立小鼠全基因组突变es细胞库的方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，更具体地涉及一种建立小鼠全基因组突变胚胎干细胞库的方法。
背景技术：
人类基因组和其它一些重要动植物基因组全序列测定已经或将在近期得到完成，同时更多的物种基因组测序计划正在开展。然而这些工作只是理解生物体基因组功能的第一步，由于大部分的基因功能尚未知晓，随着海量的序列数据的快速积累，人们面临着如何鉴定这些序列数据所代表的生物学功能的巨大挑战，生物信息学的发展为分析基因组序列推测基因的功能提供了前所未有的便利。
然而，实验研究，特别是在体内的基因功能研究仍然是获得基因功能信息的最重要和不可或缺的手段，体内外的基因及基因组功能的实验研究和生物信息学一起构成了功能基因组学研究腾飞的两个翅膀。对人类基因组功能的研究是当前最迫切需要开展的项目，通过分析疾病家系从而定位相关的基因为了解人类基因的功能提供了重要的途径，但是这方面的资源毕竟是有限的，大量人类基因功能的研究只能通过相对间接的途径，特别是基本上无法利用人类自身进行体内的研究(除了一些用于疾病治疗的目的)，而利用模式生物开展基因功能的体内研究是目前最为可取的手段。
小鼠是目前被采用的最接近人类生物学功能的模式动物，在小鼠基因组内进行基因剔除的研究是揭示小鼠基因功能的重要手段，同时这类研究对于理解人类的同源基因提供了非常直接的线索。
人们早就发现导入细胞核内的外源性报告基因可在任何一条染色体上的任何一个位点发生单拷贝随机整合，在内源性或外源性基因的调控序列作用下，表达出报告基因产物或内源性基因和报告基因的融合基因产物，并有可能导致内源性基因的结构破坏和功能丧失。根据这一原理，通过报告载体随机整合到基因组、标签插入位点并产生插入失活突变来发现新基因并揭示其功能的基因“捕获”(gene trapping)技术应运而生，成为建立胚胎干细胞水平的高通量、大规模基因突变并产生遗传修饰小鼠动物模型的一种便利的技术手段。
目前国内外主要是利用基因捕获技术(gene trapping)或化学诱变剂(如ENU等)对小鼠胚胎干细胞(胚胎干细胞)进行随机突变，然后通过筛选和基因定位来确定相应的基因突变部位，由于胚胎干细胞具有分化全能性，可以利用这些细胞建立具有不同基因突变的小鼠个体，从而可以在个体水平上研究基因的功能。然而，目前这一研究所获得的突变胚胎干细胞克隆进度缓慢，还不能真正支持功能基因组学研究的需要，造成这一现象的主要原因是大家普遍采用的对突变细胞克隆逐个鉴定的方法仍然是一个耗时和耗力的策略。
目前采用的产生突变胚胎干细胞库的技术，例如增强子捕获(enhancertrap)、促进子捕获(promoter trap)、基因捕获(gene trap)技术等，在应用过程中有一定的局限性。首先，报告基因或选择基因的表达依赖于在胚胎干细胞内表达的内源性基因的调控序列，因而不能“捕获”到在胚胎干细胞不表达的内源性调控序列或基因；其次，随机插入的报告基因在转录剪切后有可能发生读码框移码而不能被识别，致使某些功能基因成“漏网之鱼”。
因此，本领域迫切需要建立一种在全基因组范围内的大规模、高通量获取基因突变小鼠的方法及相关技术。尤其需要开发新型的捕获载体和策略以提高捕获效率。唯有如此才能在真正意义上让功能基因组研究走上快速发展的道路，拉动后继研究的投入和大量基因新功能的发现。
发明内容
本发明的目的就是提供一种大规模、高通量获取基因突变小鼠的相关技术，即一种建立小鼠全基因组突变胚胎干细胞库及突变胚胎干细胞突变位点的鉴定方法。本发明方法可在短时期内获得覆盖90％以上基因的小鼠突变胚胎干细胞库和相应的筛选平台，利用这一系统可以满足人们对大多数特定基因进行小鼠体内研究的需要。
在本发明第一方面，提供了一种建立大规模突变胚胎干细胞库的方法，包括步骤(a)将基因捕获载体导入胚胎干细胞，所述的基因捕获载体从5′至3′的结构是SA-ST-DS-S1-P1-P2-S2-pA-P3-S3-SD-Ap-TS-AS式中SA是RNA剪接的受体序列；ST是正向串联终止密码子；DS是反向RNA剪接的供体序列；S1是反向的第一筛选基因，选自下组潮霉素B抗性基因Hygro、新霉素抗性基因Neo、嘌呤霉素抗性基因Puro、绿色荧光蛋白的编码序列GFP、增强的绿色荧光蛋白的编码序列EGFP、或lacZ基因；P1是反向的第一启动子，P2是正向的第二启动子；S2是正向的第二筛选基因，选自下组潮霉素B抗性基因Hygro、新霉素抗性基因Neo、或嘌呤霉素抗性基因Puro；pA是正向RNA加尾信号序列；P3是正向的第三启动子；S3是正向的第三筛选基因，选自下组潮霉素B抗性基因Hygro、新霉素抗性基因Neo、嘌呤霉素抗性基因Puro、绿色荧光蛋白的编码序列GFP、增强的绿色荧光蛋白的编码序列EGFP、或lacZ基因；SD是RNA剪接的供体序列；Ap是反向RNA加尾信号序列；TS是反向三联终止密码子；AS是反向RNA剪接的受体序列；P1、P2和P3是分别选自下组的启动子CMV、PGK、LTP、或hsv-TK；条件是S1，S2和S3各不相同、且S1和S3中一个筛选基因是绿色荧光蛋白的编码序列GFP、增强的绿色荧光蛋白的编码序列EGFP、或lacZ基因；(b)筛选带有筛选基因标记的胚胎干细胞；(c)合并带有筛选基因标记的胚胎干细胞，获得突变胚胎干细胞库。
在另一优选例中，在所述基因捕获载体中，S1是Hygro，S2是neo，S3是EGFP。
在另一优选例中，所述载体的结构是SA-ST-DS-Hygro-KTp-PGK-Neo-pA-PGK-EGFP-SD-Ap-TS-AS
其中，Hygro为反向的潮霉素B抗性基因KTp是反向的hsv-TK启动子；PGK是启动子PGK。
在另一优选例中，所述的胚胎干细胞是小鼠、大鼠、兔、蛙、或人的胚胎干细胞。
在另一优选例中，在步骤(b)和(c)之间还包括步骤(b’)对步骤(b)获得的每种胚胎干细胞抽提其DNA样本和RNA样本，进行保存。
在另一优选例中，在步骤(b’)中还包括对于抽提的DNA样本和RNA样本，测定载体插入位点两侧的基因组DNA序列和cDNA序列，根据序列信息明确每一个突变胚胎干细胞克隆基因突变位点及内源基因功能失活情况，并判断突变基因是否新基因，进而建立突变ES细胞的信息数据库。
在本发明的第二方面，提供了一种突变胚胎干细胞库，所述胚胎干细胞库含有的胚胎干细胞是基因突变的细胞，且所述的细胞库是用以下方法制备的(a)将基因捕获载体导入胚胎干细胞，所述的基因捕获载体从5′至3′的结构是SA-ST-DS-S1-P1-P2-S2-pA-P3-S3-SD-Ap-TS-AS各符号定义如上所述；(b)筛选带有筛选基因标记的胚胎干细胞；(c)合并带有筛选基因标记的胚胎干细胞，获得突变胚胎干细胞库。
在另一优选例中，所述细胞库含有5-30万个突变胚胎干细胞克隆。
在另一优选例中，所述细胞库被分成500-1000个亚库，每个亚库含有100-300个突变胚胎干细胞克隆。
在另一优选例中，所述的胚胎干细胞是小鼠、大鼠、兔、蛙、或人的胚胎干细胞。
在本发明的第三方面，提供了一种建立本发明的突变胚胎干细胞基因突变位点信息数据库的方法，包括步骤(a)对本发明中获得的每种突变胚胎干细胞抽提其DNA样本和RNA样本；(b)用PCR和RACE的方法载体插入位点两侧的基因组DNA序列和cDNA序列；(c)根据序列信息明确每一个突变胚胎干细胞克隆基因突变位点及内源基因功能失活情况，并判断突变基因是否新基因；(d)分类汇总(c)所得突变克隆信息，建立与本发明中突变胚胎干细胞库相对应的基因突变位点信息数据库。
在本发明的第四方面，提供了本发明的突变胚胎干细胞库的用途，它被用于产生特定基因突变的遗传修饰小鼠模型、用于制备突变胚胎干细胞库的基因组DNA和cDNA。或者，所述的突变胚胎干细胞库被分成500-1000个亚库，每个亚库含有100-300个突变胚胎干细胞克隆，并且每个细胞亚库都用于制备亚库cDNA。或者，所述的突变胚胎干细胞库被用于筛选特定基因突变的胚胎干细胞克隆。
具体实施例方式
本发明人经过深入而广泛的研究，对基因捕获载体系统进行了优化，构建了双向基因捕获载体系统。该双向基因捕获载体系统使报告基因或选择基因的表达摆脱对内源性调控序列的依赖性，能够双向捕获在胚胎干细胞表达或不表达的功能基因3.端及多聚腺苷酸加尾信号，从而可以在小鼠胚胎干细胞水平获得大量的插入突变克隆。
在本发明中，利用了大部分基因具有polyA信号及基因不对称转录的特点，在胚胎干细胞上进行双向基因PolyA的基因捕获。
如果基因捕获载体插入到某一个基因中，则该载体提供的筛选基因和插入基因提供的PolyA信号位点将赋予该胚胎干细胞具有筛选基因表达产物所具有的特性；如果基因捕获载体没有插入在基因区域中，筛选基因由于自身没有携带PolyA的信号，因此转录的RNA不能稳定地存在以及翻译，这导致胚胎干细胞不具备筛选标记的特性。因此，经过筛选而获得的胚胎干细胞克隆，都发生了某个基因被插入基因捕获载体的事件。由于外源片段的插入会破坏原来基因的功能，因此利用这一方法可在短期内建立具有数量庞大的细胞克隆组成的突变胚胎干细胞库。例如15万个细胞克隆组成的突变胚胎干细胞库，平均每个基因被突变5次。这些突变胚胎干细胞库所具有的突变类型在理论上将覆盖90％以上的小鼠基因组基因。
具体地，本发明方法采用polyA捕获的原理，所用的基因捕获载体从5′至3′的结构如下(a)将基因捕获载体导入胚胎干细胞，所述的基因捕获载体从5′至3′的结构是SA-ST-DS-S1-P1-P2-S2-pA-P3-S3-SD-Ap-TS-AS式中SA是RNA剪接的受体序列；ST是正向串联终止密码子；DS是反向RNA剪接的供体序列；S1是反向的第一筛选基因，选自下组潮霉素B抗性基因Hygro、新霉素抗性基因Neo、嘌呤霉素抗性基因Puro、绿色荧光蛋白的编码序列GFP、增强的绿色荧光蛋白的编码序列EGFP、或lacZ基因；P1是反向的第一启动子，P2是正向的第二启动子；S2是正向的第二筛选基因，选自下组潮霉素B抗性基因Hygro、新霉素抗性基因Neo、或嘌呤霉素抗性基因Puro；pA是正向RNA加尾信号序列；P3是正向的第三启动子；S3是正向的第三筛选基因，选自下组潮霉素B抗性基因Hygro、新霉素抗性基因Neo、嘌呤霉素抗性基因Puro、绿色荧光蛋白的编码序列GFP、增强的绿色荧光蛋白的编码序列EGFP、或lacZ基因；SD是RNA剪接的供体序列；Ap是反向RNA加尾信号序列；TS是反向三联终止密码子；AS是反向RNA剪接的受体序列；P1、P2和P3是分别选自下组的启动子CMV、PGK、LTP、或hsv-TK；条件是S1，S2和S3各不相同，且S1和S3中有一个筛选基因是非致死性的筛选基因，如绿色荧光蛋白的编码序列GFP、增强的绿色荧光蛋白的编码序列EGFP、或lacZ基因。S1和S3中另一个筛选基因和S2宜为致死性的筛选基因，如潮霉素B抗性基因Hygro、新霉素抗性基因Neo、或嘌呤霉素抗性基因Puro。
本发明的质粒构建可用常规方法进行。通常，母本质粒为逆转录病毒载体或其它常用克隆载体，例如pBluescript、UC18/19等常用克隆载体筛选基因可以是抗药基因如Neo、Puro、Hygro、Pac，或者是报告基因如GFP等。用于本发明的第一和第三筛选基因需要去除基因终止密码子后的polyA信号区域。
各筛选基因可以用在胚胎干细胞中具有基因启动活性的启动子进行转录，如CMV、PGK、hsv-TK、LTP等启动子。
载体5′端连接有正向RNA剪接的受体序列(SA)和反向RNA剪接的供体序列(DS)，载体的3′端连接有正向RNA剪接的供体序列(SD)和反向RNA剪接的受体序列(AS)。适用于本发明的SA、SD、AS和DS元件没有特别限制，可以选用本领域已知的各种SA、SD、AS和DS元件。
基因捕获载体导入到胚胎干细胞中可以利用常规方法进行，如假病毒感染法或者电转移法。
导入胚胎干细胞后，本发明的双向基因捕获载体插入到基因染色体中有4种情况，分别为1)插入到基因的5’调控区，造成基因调控区破坏而不能正常转录下游基因；2)插入在基因外显子区域中，如果该外显子是蛋白编码区域，则造成蛋白编码区被打断；3)插入到基因内含子中，在RNA剪接过程中，GFP或Hygro基因将和该内含子的上下游外显子融合成一个mRNA分子，如果该内含子下游的外显子是蛋白编码序列，则造成蛋白编码区被打断；4)插入到基因不编码蛋白的外显子中，如果是插入在基因5’端的非编码区外显子，则产生的RNA将只翻译GFP或Hygro基因的读框，被插入的基因不能翻译，如果是插入在基因3’端的非编码区，则对基因的功能可能没有影响。
不论是哪种情况，如果基因捕获载体插入到某一个基因中，则该载体提供的筛选基因和插入基因提供的polyA信号位点将赋予该胚胎干细胞具有筛选基因表达产物所具有的特性(绿色荧光或潮霉素抗性等)；如果基因捕获载体没有插入在基因区域中，筛选基因由于自身没有携带polyA的信号，因此转录的RNA不能稳定地存在以及翻译。因此经过筛选而存活的胚胎干细胞克隆，都发生了某个基因被插入基因捕获载体的事件，因此都是突变的胚胎干细胞。
将基因捕获载体导入到胚胎干细胞后，可用常规方法筛选和培养插入了基因捕获载体的胚胎干细胞。其过程、步骤和操作条件都是本领域中已知的。
在本发明中，术语“合并”指将各存活的胚胎干细胞放置在一起，构成突变胚胎干细胞库。这种放置可以是(1)将多个存活的胚胎干细胞混合在一起，构成亚库；(2)将各存活的胚胎干细胞的基因组DNA和/或cDNA数据一起放置在信息数据库，而各存活的胚胎干细胞仍然是单独存放；(3)上述放置方法的组合。
对于筛选出的各突变的胚胎干细胞，将其合并后就获得了本发明的突变的胚胎干细胞库。用本发明方法可以在短时间内获得含有5-30万个，较佳地10-20万个，更佳地约15万个突变胚胎干细胞克隆的细胞库。
在另一优选例中，本发明的细胞库将进一步分成500-1000个亚库，每个亚库具有150-300种胚胎干细胞克隆。针对每一个亚库，将制备相应的胚胎干细胞的混合cDNA，利用这些cDNA，可以采用PCR或其它方法方便地确定所需要的突变胚胎干细胞克隆所在的亚库，然后到相应的亚库中对每个胚胎干细胞克隆进行筛选，获得相应的突变胚胎干细胞克隆。
一种优选的获得特定基因突变的胚胎干细胞克隆的方法是，根据特定基因的序列，用PCR来筛选亚库的cDNA样本，将候选的含有特定基因插入突变的胚胎干细胞克隆限定在某(几)个亚库中。然后，对于亚库中的每个胚胎干细胞克隆，用相同的PCR方法筛选出相应的含有特定基因插入突变的胚胎干细胞克隆。
另一方面，可利用每一胚胎干细胞克隆对应的DNA和cDNA，采用PCR和RACE的方法确定载体插入基因组的位点及每个胚胎干细胞克隆对应的突变基因，建立与胚胎干细胞突变细胞库相对应的基因突变位点信息数据库。根据研究需要，选择其中具有重要生物学功能的突变克隆进行显微注射即可获得该基因插入突变的小鼠品系。采用这种策略将极大地提高基因识别和基因剔除小鼠模型的研究效率，降低研究成本，易形成“工业化”研究格局。
本发明方法的主要优点在于(1)与传统的用同源重组方式进行基因剔除的方法相比，本发明方法具有高效、经济的特点，特别是免除了需要针对每个基因构建基因打靶载体的繁琐过程，从而为大规模、高通量获取基因突变小鼠奠定了基础。
(2)本发明的捕获载体插入基因组后，可以双向捕获由基因组正负两链转录的基因，因此显著提高了捕获效率。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1基因捕获载体的构建母本质粒为pBluescript，筛选基因如下第一筛选基因是去除基因终止密码子后的PolyA信号区域的筛选基因，即没有PolyA信号的潮霉素抗性基因B(Hygro)；第二筛选基因是具有polyA信号的完整新霉素抗性基因Neo；第三筛选基因是去除基因终止密码子后的PolyA信号区域的筛选基因，即没有PolyA信号的EGFP基因。
第一和第三筛选基因分别由在ES细胞中具强基因启动活性的启动子PGK、hsv-TK驱动转录，二者方向相反。
第一和第三筛选基因3’端分别连接有RNA剪接的供体序列(SD)，5’端连接有RNA剪接的受体序列(SA)及串联终止密码。
质粒构建方法按常规进行，从而获得结构如下的基因捕获载体SA-ST-DS-Hygro-KTp-PGK-Neo-pA-PGK-EGFP-SD-Ap-TS-AS整个基因捕获载体的序列如下ccgcggttta aggagaccaa tagaaactgg gcttgtcgag acagagaaga ctcttgcgtt 60tctgataggc acctattggt cttactgaca tccactttgc ctttctctcc acaggatagc 120taactgagat ccccctccta cttacctcag tcagtcagtt agcctccccc atctcccgat 180ccggacgagt gctggggcgt cggtttccac tatcggcgag tacttctaca cagccatcgg 240tccagacggc cgcgcttctg cgggcgattt gtgtacgccc gacagtcccg gctccggatc 300ggacgattgc gtcgcatcga ccctgcgccc aagctgcatc atcgaaattg ccgtcaacca 360agctctgata gagttggtca agaccaatgc ggagcatata cgcccggagc cgcggcgatc 420ctgcaagctc cggatgcctc cgctcgaagt agcgcgtctg ctgctccata caagccaacc 480acggcctcca gaagaagatg ttggcgacct cgtattggga atccccgaac atcgcctcgc 540tccagtcaat gaccgctgtt atgcggccat tgtccgtcag gacattgttg gagccgaaat 600ccgcgtgcac gaggtgccgg acttcggggc agtcctcggc ccaaagcatc agctcatcga 660gagcctgcgc gacggacgca ctgacggtgt cgtccatcac agtttgccag tgatacacat 720ggggatcagc aatcgcgcat atgaaatcac gccatgtagt gtattgaccg attccttgcg 780gtccgaatgg gccgaacccg ctcgtctggc taagatcggc cgcagcgatc gcatccatgg 840cctccgcgac cggctgcaga acagcgggca gttcggtttc aggcaggtct tgcaacgtga 900
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实施例2突变胚胎干细胞库的建立在本实施例中，基因捕获载体导入到ES细胞中可以采用电转移的方法。
本实施例中采用Bio-Rad电转化仪500μF/240V，1.2×107细胞转染30-40ug线性化基因捕获载体质粒。24-36小时后，用含G418(0.3mg/ml)的培养基对上述转染细胞进行培养和单克隆筛选。6-7天后从抵抗克隆中挑选出绿色荧光细胞克隆，扩大培养后冻存、裂解制备DNA、RNA。其余抵抗克隆用含潮霉素B(0.15mg/ml)的培养基继续筛选7-10天后，将存活抵抗克隆挑出，扩大培养后冻存、裂解制备DNA、RNA。
ES细胞培养按标准方法进行。滋养层细胞为用丝裂霉素处理过的原代培养的转有Hygro-Neo基因的小鼠胚胎成纤维细胞。从液氮罐中取出一支冻存的ES细胞，迅速投入37℃水浴；用无菌的巴斯德管吸出细胞放入带10ml ES培养液的15ml Falcon离心管中，室温下1000rpm离心5分钟；弃上清，细胞用10ml 1xPBS洗涤一次，同上离心去除上清；用适量培养液重新悬浮细胞，将细胞接种到铺有丝裂霉素处理的滋养层细胞的100mm培养皿中。细胞置于37℃，5％CO2的细胞培养箱中，保持足够的湿度，每天换新鲜的培养液，直至ES细胞长到合适的密度，这一过程通常需要2-3天。处于对数生长期的ES细胞在收获前约4h更换培养液，用PBS漂洗两遍，加2ml 0.05％胰蛋白酶/EDTA溶液，室温下消化3-5min，加10ml ES细胞培养液终止消化，用吸管吹打成单细胞悬液，移入15ml离心管中，1000rpm离心5min收集细胞，用10ml PBS重悬细胞并计数。经离心后收集细胞，去上清，加适量的PBS使细胞密度达到约1.2×107/ml。取0.8ml上述ES细胞悬液中加入0.1ml含Ca2+和Mg2+的PBS(含约40μg经线性化的基因捕获质粒)，混匀后加到无菌电穿孔杯中。常温的条件下，以240V，500μF的电参数进行单脉冲击发后，重新悬浮在3.0ml ES培养基中接种到2个100mm的平皿中培养。24-36h后进行G418(0.3-0.6mg/ml)药物筛选，每天更换培养液。5天后，隔天换液，ES细胞阳性克隆生长6-7天后ES细胞克隆长成肉眼可见的细胞集落，即可挑取绿色荧光克隆。方法如下吸去培养液，用10ml PBS漂洗一遍，再加入5ml PBS；在显微镜下，用0.2ml的Tip吸取阳性克隆，放入含有20μl 0.1％胰蛋白酶/0.04％EDTA的96孔板(凹底)中消化约5min，轻轻吹打，使细胞分散。转移至已胶原化并已加ES细胞培养基的96孔板中，置培养箱中培养。第二天换液，待细胞长满60％-80％后，传至48孔板培养，待细胞长满60％-80％后，取其中3/4的细胞冻存，余下1/4接种至两仅胶原化的48孔板(无滋养层)中，细胞100％长满后用于抽提基因组DNA和RNA。100mm培养皿中剩余ES细胞阳性克隆含潮霉素B(0.05-0.20mg/ml)的培养基继续培养筛选，每天更换培养液。5天后，隔天换液，7-10天后，挑取存活抵抗克隆，扩大培养后一份冻存，另一份用于制备基因组DNA、RNA。
重复上述程序，共建立突变胚胎干细胞亚库500-1000份，每个亚库含100-300个细胞克隆。
实施例3突变ES细胞克隆基因组DNA和cDNA的制备对于实施例2中的每个突变ES细胞克隆，从长满有ES细胞的48孔板中吸去培养液，用PBS洗涤一次，每孔加入500μl细胞裂解液(1mg/ml蛋白酶K)，56℃过夜消化，加入1ml无水乙醇，离心10min，弃上清，70％乙醇，洗涤2次，溶于100μl ddH2O中备用。相应制备一份RNA，每孔长满有ES细胞的48孔板中加500μl Trizol，反复吹打几次后收集制备RNA，方法按照Trizol(Invitrogen公司)的说明书进行。采用polydT和随机引物作为反转录的引物获得cDNA。
对于实施例2建立的每个突变胚胎干细胞亚库，相应建立一份基因组DNA和cDNA(亚库中所有突变ES细胞克隆基因组DNA混合/cDNA混合)，共相应制备500-1000份；有关细胞RNA和基因组DNA的制备方法按标准方法进行.采用polydT和随机引物作为反转录的引物获得亚库cDNA。
实施例4特定基因突变ES细胞克隆筛选对于筛选含指定基因突变的ES细胞克隆，采用常规的PCR的方法进行，对于对于绿色荧光克隆亚库，5′端引物的设计选择基因捕获载体3′端序列CTA CCAGCA GAA CAC CCC CAT(SEQ ID NO2)，3′端引物选择待研究基因终止编码子后附近的外显子序列，必要时可以设计成巢式PCR引物，对于潮霉素B抵抗克隆亚库，5′端引物的设计选择基因捕获载体5′端序列的互补序列cgt aca caa atcgcc cgc aga(SEQ ID NO3)，3′端引物选择待研究基因终止编码子后附近的外显子序列，必要时可以设计成巢式PCR引物，用上述引物对实施例3中获得的所有突变ES细胞亚库的cDNA进行PCR筛选，对获得有阳性产物进行DNA序列分析和验证，对验证的获得阳性的cDNA库，取其对应的突变ES细胞亚库中所有突变克隆的cDNA(每个克隆单独留存的cDNA)，按10-30个为一组混合进行PCR筛选，进一步缩小范围进行PCR筛选直到确定单个突变ES细胞克隆为阳性克隆.复苏相应亚库中单独存放的突变的ES细胞克隆，扩大培养后提取RNA，反转录获得cDNA后重复上述PCR，验证阳性后即可确定此克隆为所需克隆.
实施例4突变ES细胞克隆基因捕获位点的鉴定对于实施例3中的突变ES细胞克隆基因组DNA，可采用反向PCR或接头法PCR获得载体插入位点两侧的基因组序列，确定载体插入基因组中的位置。
本实施例中采用Sau3AI或MspI消化ES细胞克隆基因组DNA后，DNA连接酶连接后，利用两对根据载体两端序列设计的引物进行反向PCR获得载体两端序列以外的内源基因组序列。对于实施例3中的突变ES细胞克隆RNA，可用3’-RACE和5’-RACE的方法获得载体插入位点两侧的cDNA序列。本实施例中对于绿色荧光克隆所得RNA根据EGFP3′端序列设计引物CTA CCA GCA GAA CAC CCCCAT(SEQ ID NO4)进行3′-RACE，根据潮霉素基因3′端序列(载体5′端SA下游)设计引物ATC AGA GCT TGG TTG ACG GCA(SEQ ID NO5)进行5′-RACE；对于潮霉素B抵抗克隆所得RNA根据潮霉素基因3′端序列设计引物CGTACA CAA ATC GCC CGC AGA(SEQ ID NO6)进行3′-RACE，根据基因捕获载体3′端序列(载体另一端SA下游)设计引物ATC TCC CCC TGA ACC TGAAAC(SEQ ID NO7)进行5′-RACE。3′-RACE和5′-RACE均参照Clontech试剂盒的说明书进行。
鉴定并获得所需要的突变胚胎干细胞克隆后，可以将相应的冻存的胚胎干细胞复苏，培养扩增后用于建立基因剔除小鼠或可以进行其它研究。
实施例5突变ES细胞克隆信息数据库的建立对于实施例4中获得的突变ES细胞克隆基因捕获载体两侧基因组DNA和cDNA序列，进行生物信息学分析，确定被捕获基因，分析预测其基因功能是否受影响，发现其中新基因，将以上信息分类汇总，建立数据库，并与突变ES细胞库分类编号对应。
进一步可选择其中感兴趣的突变克隆进行显微注射即可获得该基因插入突变的小鼠品系，研究该基因的功能。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表<110>上海南方模式生物科技发展有限公司上海第二医科大学附属瑞金医院中科院上海生命科学研究院上海第二医科大学健康科学中心上海第二医科大学<120>一种建立小鼠全基因组突变胚胎干细胞库的方法<130>033914<160>7<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>4990<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(4990)<223>基因捕获载体<400>1ccgcggttta aggagaccaa tagaaactgg gcttgtcgag acagagaaga ctcttgcgtt 60tctgataggc acctattggt cttactgaca tccactttgc ctttctctcc acaggatagc 120taactgagat ccccctccta cttacctcag tcagtcagtt agcctccccc atctcccgat 180ccggacgagt gctggggcgt cggtttccac tatcggcgag tacttctaca cagccatcgg 240tccagacggc cgcgcttctg cgggcgattt gtgtacgccc gacagtcccg gctccggatc 300ggacgattgc gtcgcatcga ccctgcgccc aagctgcatc atcgaaattg ccgtcaacca 360agctctgata gagttggtca agaccaatgc ggagcatata cgcccggagc cgcggcgatc 420ctgcaagctc cggatgcctc cgctcgaagt agcgcgtctg ctgctccata caagccaacc 480acggcctcca gaagaagatg ttggcgacct cgtattggga atccccgaac atcgcctcgc 540tccagtcaat gaccgctgtt atgcggccat tgtccgtcag gacattgttg gagccgaaat 600ccgcgtgcac gaggtgccgg acttcggggc agtcctcggc ccaaagcatc agctcatcga 660gagcctgcgc gacggacgca ctgacggtgt cgtccatcac agtttgccag tgatacacat 720ggggatcagc aatcgcgcat atgaaatcac gccatgtagt gtattgaccg attccttgcg 780gtccgaatgg gccgaacccg ctcgtctggc taagatcggc cgcagcgatc gcatccatgg 840cctccgcgac cggctgcaga acagcgggca gttcggtttc aggcaggtct tgcaacgtga 900
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<221>misc_feature<223>引物<400>7atctccccct gaacctgaaa c 2权利要求
1.一种建立大规模突变胚胎干细胞库的方法，其特征在于，包括步骤(a)将基因捕获载体导入胚胎干细胞，所述的基因捕获载体从5′至3′的结构是SA-ST-DS-S1-P1-P2-S2-pA-P3-S3-SD-Ap-TS-AS式中SA是RNA剪接的受体序列；ST是正向串联终止密码子；DS是反向RNA剪接的供体序列；S1是反向的第一筛选基因，选自下组潮霉素B抗性基因Hygro、新霉素抗性基因Neo、嘌呤霉素抗性基因Puro、绿色荧光蛋白的编码序列GFP、增强的绿色荧光蛋白的编码序列EGFP、或lacZ基因；P1是反向的第一启动子，P2是正向的第二启动子；S2是正向的第二筛选基因，选自下组潮霉素B抗性基因Hygro、新霉素抗性基因Neo、或嘌呤霉素抗性基因Puro；pA是正向RNA加尾信号序列；P3是正向的第三启动子；S3是正向的第三筛选基因，选自下组潮霉素B抗性基因Hygro、新霉素抗性基因Neo、嘌呤霉素抗性基因Puro、绿色荧光蛋白的编码序列GFP、增强的绿色荧光蛋白的编码序列EGFP、或lacZ基因；SD是RNA剪接的供体序列；Ap是反向RNA加尾信号序列；TS是反向三联终止密码子；AS是反向RNA剪接的受体序列；P1、P2和P3是分别选自下组的启动子CMV、PGK、LTP、或hsv-TK；条件是S1，S2和S3各不相同、且S1和S3中一个筛选基因是绿色荧光蛋白的编码序列GFP、增强的绿色荧光蛋白的编码序列EGFP、或lacZ基因；(b)筛选带有筛选基因标记的胚胎干细胞；(c)合并带有筛选基因标记的胚胎干细胞，获得突变胚胎干细胞库。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基因捕获载体中，S1是Hygro，S2是neo，S3是EGFP。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(b)和(c)之间还包括步骤(b’)对步骤(b)获得的每种胚胎干细胞抽提其DNA样本和RNA样本，进行保存。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤(b’)中还包括对于抽提的DNA样本和RNA样本，测定载体插入位点两侧的基因组DNA序列和cDNA序列，根据序列信息明确每一个突变胚胎干细胞克隆基因突变位点及内源基因功能失活情况，并判断突变基因是否新基因，进而建立突变ES细胞的信息数据库。
5.一种突变胚胎干细胞库，其特征在于，所述胚胎干细胞库含有的胚胎干细胞是基因突变的细胞，且所述的细胞库是用以下方法制备的(a)将基因捕获载体导入胚胎干细胞，所述的基因捕获载体从5′至3′的结构是SA-ST-DS-S1-P1-P2-S2-pA-P3-S3-SD-Ap-TS-AS式中SA是RNA剪接的受体序列；ST是正向串联终止密码子；DS是反向RNA剪接的供体序列；S1是反向的第一筛选基因，选自下组潮霉素B抗性基因Hygro、新霉素抗性基因Neo、嘌呤霉素抗性基因Puro、绿色荧光蛋白的编码序列GFP、增强的绿色荧光蛋白的编码序列EGFP、或lacZ基因；P1是反向的第一启动子，P2是正向的第二启动子；S2是正向的第二筛选基因，选自下组潮霉素B抗性基因Hygro、新霉素抗性基因Neo、或嘌呤霉素抗性基因Puro；pA是正向RNA加尾信号序列；P3是正向的第三启动子；S3是正向的第三筛选基因，选自下组潮霉素B抗性基因Hygro、新霉素抗性基因Neo、嘌呤霉素抗性基因Puro、绿色荧光蛋白的编码序列GFP、增强的绿色荧光蛋白的编码序列EGFP、或lacZ基因；SD是RNA剪接的供体序列；Ap是反向RNA加尾信号序列；TS是反向三联终止密码子；AS是反向RNA剪接的受体序列；P1、P2和P3是分别选自下组的启动子CMV、PGK、LTP、或hsv-TK；条件是S1，S2和S3各不相同、且S1和S3中一个筛选基因是绿色荧光蛋白的编码序列GFP、增强的绿色荧光蛋白的编码序列EGFP、或lacZ基因；(b)筛选带有筛选基因标记的胚胎干细胞；(c)合并带有筛选基因标记的胚胎干细胞，获得突变胚胎干细胞库。
6.如权利要求5所述的细胞库，其特征在于，所述细胞库含有5-30万个突变胚胎干细胞克隆。
7.如权利要求5所述的突变胚胎干细胞库的用途，其特征在于，所述的胚胎干细胞库中的干细胞克隆被用于产生特定基因突变的遗传修饰小鼠模型。
8.如权利要求5所述的突变胚胎干细胞库的用途，其特征在于，用于制备突变胚胎干细胞库的基因组DNA和cDNA。
9.如权利要求5所述的突变胚胎干细胞库的用途，其特征在于，所述的突变胚胎干细胞库被分成500-1000个亚库，每个亚库含有100-300个突变胚胎干细胞克隆，并且每个细胞亚库都用于制备亚库cDNA。
10.如权利要求5所述的突变胚胎干细胞库的用途，其特征在于，被用于筛选特定基因突变的胚胎干细胞克隆。
全文摘要
本发明提供了一种利用双向双选择基因捕获技术建立大规模的突变小鼠胚胎干细胞库的建立方法。它包括步骤(a)将基因捕获载体导入胚胎干细胞，所述基因捕获载体从5′至3′的结构是SA－ST－DS－S1－P1－P2－S2－pA－P3－S3－SD－Ap－TS－AS；(b)筛选带有筛选基因标记的胚胎干细胞；和(c)合并带有筛选基因标记的胚胎干细胞，获得突变胚胎干细胞库。本发明还提供了突变基因位点的鉴定方法。本发明方法为大规模、高通量获取基因突变小鼠奠定了基础。
文档编号C07H21/00GK1580250SQ0314207
公开日2005年2月16日 申请日期2003年8月6日 优先权日2003年8月6日
发明者王铸钢, 党素英, 费俭 申请人:上海南方模式生物科技发展有限公司, 上海第二医科大学附属瑞金医院, 中国科学院上海生命科学研究院上海第二医科大学健康科学中心, 上海第二医科大学