一种可刺激t细胞扩增的组合物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种可刺激Τ细胞扩增的组合物，及使用该组合物对CD8巧细胞进行扩 增的培养方法。
【背景技术】
[0002] 艾滋病是目前威胁人类生命安全的重要疾病，而人类免疫缺陷病毒是艾滋病主要 致病因素。现阶段对艾滋病的重要治疗手段是通过鸡尾酒疗法，患者长期服用药物达到控 制病毒和病程的目的。但是鸡尾酒疗法无法完全清除病毒，由于HIV-1的潜伏感染，一旦停 止服药，病毒会迅速反弹。另一方面HIV-1通过高频突变，会逐渐产生耐药性。并且长期服 药，对患者自身也是沉重负担。
[0003] 研究显示，HIV抗原特异性的CD8+T细胞对病毒储存库的控制与清除，发挥了非常 重要作用;并且经过多年探索，现已发现若干针对HIV-1抗原的CD8+T细胞克隆，杀伤病毒感 染细胞的能力尤其突出。所W将艾滋病患者体内HIV-1抗原特异性的CD8+T细胞分离，经过 体外扩增后，再回输患者体内进行过继性免疫治疗可作为功能性治愈艾滋病的候选方案之 一，但是现行方案还有诸多问题有待解决，需要进一步优化完善。
[0004] -方面，所有的病毒和细菌都感染都会携带关键蛋白质抗原表位，免疫系统会将 完整的运些表位为"外源物质"，由此触动免疫攻击。最近研究显示，如果艾滋病患者启动抗 病毒治疗较晚，感染后不久HIV可快速改变运些"标记"区域，所W患者体内携带着的病毒储 藏库几乎完全是由携带逃逸突变的HIV-1所构成，此时病毒蛋白的一些关键部分发生的氨 基酸转变使得它们变得难W被免疫系统识别。
[000引 2015年，来自Robed F. Si 1 iciano团队的邓凯博±通过深度测序，发现若干CD8+T 细胞识别的抗原表位，其对应HIV-1感染细胞未发生逃逸突变。并且首次从患者处分离出了 杀伤性T细胞，将它发生们与未突变HIV-1抗原多肤混合培养，发现用非突变HIV-1多肤混合 物预处理的CD8+T细胞启动了对患者HIV-1感染细胞的强烈反应，具有高达68 %的杀伤率。
[0006] 另一方面，CD8+效应T细胞化ffectTcell，Teff)的寿命较短，无法在体内维持长 时间的免疫应答。因此，寿命较长的CD8+记忆T细胞(Memory T cell)正在成为过继性免疫 治疗中的主要细胞，得到越来越多的重视与应用。近年来，干细胞样记忆T淋己细胞(T stem cell memory cells，TscM)陆续在小鼠、雜猴等模式生物及人体中被发现。运群细胞处于记 忆细胞的分化上游，经诱导能分化成记忆细胞，同时具有较强的自我更新及抗肿瘤能力。因 此，TscM被认为是过继性免疫治疗的重要细胞来源。目前，体外扩增CD8+记忆T细胞的方法主 要包括：用Anti-CD3抗体和Anti-CD28抗体体外非特异扩增CD8+T细胞；用抗原提呈细胞体 外激活抗原特异性CD8+T细胞。用IL-2、IL-7和IL-15扩增CD8+记忆T细胞。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供可刺激T细胞扩增的组合物，及使用该组合物对CD8巧细胞 进行扩增的培养方法。
[0008] 本发明所采取的技术方案是： 一种可刺激CD8巧细胞体外扩增的组合物，其活性因子由Anti-CD3抗体、Anti-CD28抗 体、比-2、化-7和化-21共5种细胞因子组成。优选的，各因子的使用终浓度分别为:Anti-CD3 抗体终浓度0.8~1.化g/mL、Anti-CD28抗体终浓度0.8~1.化g/mL、化-2终浓度8~12ng/ mL、比-7终浓度8~12ng/mL、比-21终浓度18~22ng/mL。更佳的，各因子的使用终浓度分别 为:Anti-CD3抗体终浓度化g/mL、Anti-CD28抗体终浓度化g/mL、比-2终浓度lOng/mL、比-7 终浓度lOng/mL、比-21终浓度20ng/mL。
[0009] 特别的，该组合物为CD8+T细胞培养基，或者是培养基添加剂。
[0010] 一种体外扩增CD8巧细胞的方法，包括如下步骤： 收集HIV-1感染患者的外周血单个核细胞PBMC经刺激产生的CD8巧细胞； 将收集的CD8巧细胞悬浮培养于培养基中，待细胞广泛激活后加入活性因子Anti-CD3 抗体、Anti-CD28抗体和IL-2，继续培养至少2地后，继续加入IL-2、比-7和IL-21中的至少一 种细胞因子，继续培养，扩增CD8+T细胞。
[0011] 作为上述方法的进一步改进，使用IL-2和HIV-1抗原多肤组合来刺激PBMC产生CD8 可细胞。
[0012] 更进一步的，上述方法中使用的HIV-1抗原多肤组合为已突变或未突变HIV-1抗原 多肤组合，其中，已突变HIV-1抗原多肤组合为：SL9 : SLYNTVATL、IL9 : ILKEPVHGV、RY9 : R化RDQQ化、TW10:TSTLQEQIGW和LY9:LYNTVATLY;未突变HIV-1 抗原多肤组合为：WF9: WAS服LERF、TV9 : TLNAWVKVV、TL9 : TP孤LNTML、EW10 : ETI肥EAAEW、GL9: GPG册AR化和KF11: KAremaPMF。
[0013] 更进一步的，将收集的CD8+T细胞悬浮培养于培养基中7d后，活性因子Anti-CD3抗 体、Anti-CD28 抗体和 IL-2。
[0014] 更进一步的，加入活性因子Anti-CD3抗体、Anti-CD28抗体和IL-2后继续培养48h 后，加入IL-2、比-7和IL-21继续培养，扩增CD8+T细胞。
[0015] 更进一步的，Anti-CD3抗体添加的终浓度为化g/mL、Anti-CD28抗体添加的终浓度 为化g/mL、化-2添加的终浓度为lOng/mL、化-7添加的终浓度为lOng/mL、比-21添加的终浓 度为 20ng/mL。
[0016] 本发明的有益效果是： 本发明方法可W有效提高抗原特异性CD8+记忆T细胞的数量和比例，化-化比-7+比-21 细胞因子组合不仅提高了 CD8+T细胞的扩增倍数，而且同时提高了扩增后CD8+记忆性T细胞， 尤其是CDS+Tscm的比例。可W延长过继免疫治疗回输细胞的半衰期，从而延长了其发挥免疫 监控的时效，更具有长期控制HIV-1潜伏感染的潜力。
[0017]本发明通过两轮刺激，兼顾了抗原特异性CD8+T细胞的扩增和化区性CD8+T细胞。
[0018] 本发明使用的HIV-1抗原多肤组合，无论是急性期感染患者还是慢性期感染患者 都未发生逃逸突变，所W相比已突变的多肤，运些多肤组合刺激的CD8+T更具有杀伤病毒感 染细胞的潜力。
[0019] 本发明使用的是多种HIV-1抗原多肤组合，相比单一多肤刺激，会有多种CD8+T细 胞克隆被激活，可W更广泛地发挥杀伤病毒感染细胞的作用。
[0020] 本发明使用多种HIV-1抗原多肤组合，更具有广谱性，可W有效防止HIV-1通过高 频突变逃逸免疫识别，从而对HIV-1更有效地进行免疫监控。
[0021 ] 本发明使用的化-2+比-7+比-21细胞因子组合，相比单独施加化-2和比-2+化-7组 合的传统扩增方法，可W进一步提高HIV-1感染患者CD8+T细胞扩增倍数。
【附图说明】
[0022] 图1:扩增HIV-1抗原特异性的CD8+记忆T细胞扩增流程。
[0023] 图感染患者的PBMC经过抗原肤组合刺激后，HIV-1抗原特异性CD8+T细胞 比例增加。
[0024] 图3:HIV-1感的染患者PBMC经过抗原肤组合刺激后，HIV-1抗原特异性CD8+T细胞 干扰素丫分泌增加。
[002引图4:经过磁珠富集，细胞因子组合可W大量扩增HIV-1感染患者CD8+T细胞 图5:经过细胞因子组合刺激扩增后，HIV-1感染患者CDS+Tscm细胞的比例增加。
[0026] 图6:经过细胞因子组合刺激扩增后，HIV-1感染患者CD8+T?细胞的比例增加。
[0027] 图7:经过细胞因子组合刺激扩增后，HIV-1感染患者抗原特异性CD8+T细胞比例得 W维持。
【具体实施方式】
[0028] 下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明。HIV-1感染患者的外周血由 广州市第八人民医院提供。除非特别说明，本发明采用的试剂、设备和方法为本技术领域常 规市购的试剂、设备和常规使用的方法。
[0029] 对HIV-1感染患者抗原特异性CD8+T细胞特异性激活和扩增 在过去的几十年中，HIV-1感染患者抗原特异性CD8+T细胞结构和功能已经有很详细的 研究。本发明的扩增HIV-1抗原特异性的CD8+记忆T细胞扩增流程如图1所示。
[0030] 从HIV-1感染患者外周血中分离外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)(用PBS将lOmL患者外周血稀释到25mL，混匀，逐滴小屯、地加入 25血人淋己细胞分离液之上；于20°C，W1500巧m/min离屯、30min;小屯、吸出PBMC，加入3-5倍 体积的PBS溶液;于20°C，W300g离屯、15min;弃上清液，再向离屯、管中加入15mL PBS溶液，重 悬混匀；于20°C，W300g离屯、5min;弃上清液，用1640培养液定容至ΙιΛ;用细胞计数器进行 细胞计数。
[0031] 将分选出来的外周血单个核细胞悬浮于含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中，均 匀铺于12孔板中，每孔细胞数为2 X 106。
[0032] 利用HIV-1抗原