用于扩增t调节细胞的方法和组合物的制作方法

专利名称：：用于扩增t调节细胞的方法和组合物的制作方法
技术领域：
：本发明总地涉及免疫治疗的领域。特别地，本发明提供了用于扩增T调节细胞的方法和组合物。该方法和组合物可用于例如预防和治疗基于免疫的疾病，包括糖尿病，和预防外源移植排斥。
背景技术：
：T调节(Treg)细胞构成人和啮齿动物中5-10%的CD4+T细胞，并组成型地表达CD25、CD28、CTLA-4、GITR、CD62L和4-1BB,以及转录因子FoxP3，其涉及它们的产生和功能。IL-2似乎在Treg细胞产生和体内平衡中起着重要作用，因为缺乏IL-2或其受体成分的动物产生T细胞过度增殖和自体免疫疾病，这些疾病通过来自天然动物的Treg细胞的获得性转移可以得到医治。相似地，缺乏通过CD28/CD80相互作用的信号与降低的Treg细胞的数量和功能性相关，表明该受体/配体系统在Treg细胞的产生和功能中起着重要作用。天然出现的CD4+CD25+FoxP3+Treg细胞是细胞的树突细胞群体，这些细胞是在胸腺中的高亲和性配体上阳性选择的并已经显示出在自我抗原的免疫耐受性的建立和维持中起着重要作用。这些细胞的产生和/或功能的缺乏与人和各种先天性或诱导的自体免疫性的动物模型中的剧烈自体免疫性相关。Treg细胞通过细胞与细胞间的接触直接地或通过可溶性因子间接地呈现它们的耐受性作用。尽管这些细胞的抑制机制尚未得到充分地阐明，但效应T细胞(丁eff)中的IL-2表达的阻断、Teff细胞的物理消除、通过CTLA-4/B7轴的耐受性树突细胞(DC)的诱导以及通过TGF-(3和IL-10的Teff细胞的抑制是迄今为止已经涉及的一些机制。还已经表明了通过CTLA-4/CD80将信号逆向传递至Teff细胞在通过Treg细胞的抑制中起着重要作用。相似地，Treg细胞上的CTLA-4和DC上的CD80之间的相互作用可以导致逆向信号并上调巧I味胺加双氧酶，该酶涉及通过调节色氨酸机制的耐受性。除了在建立和维持自我抗原耐受性的天然作用，还已经显示出Treg细胞在由各种免疫调节方法诱导的外源抗原的外周耐受性中起着作用。例如，显示出Treg细胞是涉及移植抗原外周耐受性的机制的共同点，与用来获得耐受性的免疫调节方法无关。Treg细胞还涉及肿瘤和各种病原体的免疫逃避机制。Treg细胞在建立和维持自我抗原的耐受性和诱导的外源抗原的耐受性中的重要性已经对为治疗目的而离体(exvivo)扩增Treg细胞的方法产生了浓厚的兴趣。参见，例如，Tang等，2004，A/e《199:1455-65;Battaglia等，2005,S/ood105:4743-48;Earle等，2005，C//"./mww"o/.115:3-9;Godgrey等，2004，S/oocn04:453-61;Hoffmann等，2004,j5/ooc/104:895-903。因为Treg细胞产生借由通过T细胞受体(TCR)、CD28和IL-2的信号来发生，因此扩增Treg细胞的方法聚焦于提供这三种信号。参见，例如，Tang等，上文；Godfrey等，上文；Hoffimann等，上文。例如，Tang等，上文，报道了可以从nonobese糖尿病(NOD)动物扩增Treg细胞，通过在高剂量IL-2(2000IU/ml)的存在下用缀合抗CD3和CD28抗体的珠子刺激。扩增的自体抗原特异性的TCR转基因Treg细胞的获得性转移防止了获得性转移模型中的糖尿病并逆转了新的糖尿病NOD小鼠中的糖尿病。最近产生了基于该实验方案的有限数量的其他扩增实验方案，在扩增啮齿动物和人的Treg细胞中取得了一些成功。参见，例如，Earle等，上文；Godfrey等，上文。例如，Godfrey等报道了使用作为珠子替换方案的FcyRII(CD32)表达细胞系来扩增人Treg细胞，该细胞系通过Fc受体将对抗CD3和CD28的抗体固定于细胞表面上。几乎所有报道的离体扩增实验方案是基于相似的方案，并且需要使用高剂量的IL-2,使其有效。尽管这些进展，仍然存在需要用于离体扩增Treg细胞的方法和组合物。对不需要使用固体支持物的方法存在着特别的需要。对不需要为了功效的高剂量的IL-2的方法也存在着特别的需要。对用于体内扩增Treg细胞的方法和组合物也存在着特别的需要。I型糖尿病仍然是全世界超过百分之一人群中长期发病率和死亡率的主要原因。尽管胰岛素治疗和胰岛移植是目前最有效的治疗方案，但这两种方法都存在着严重的缺陷。因此，仍然存在需要诱导胰岛特异性的自体、异源和外源耐受性的方法，用于I型糖尿病的有效和持久治疗。如上所迷，Treg细胞在自我反应性应答的控制以及外源抗原耐受性的建立和维持中起着重要作用。因此，Treg细胞呈现了重要的治疗目标，用于预防和治疗各种自体免疫疾病，包括1型糖尿病，实体器官、组织、千细胞、骨髓细胞、造血干细胞的排斥，和移植对宿主疾病(GVHD)。仍然存在需要Treg细胞的受控且有意的体内扩增方法，用于治疗这些病症。发明概述本发明总地提供了用于扩增T调节细胞的方法和组合物。根椐一个方面，本发明提供了一种组合，其包括(A)—个或多个选自以下的缀合物(a)第一缀合物，其包括(i)包括4-1BBL多肽的第一缀合物成员和(ii)包括结合对的第一个成员的第二缀合物成员；(b)第二缀合物，其包括(i)包括CD80多肽的第一缀合物成员和(ii)包括结合对的第一个成员的第二缀合物成员；和(c)笫三缀合物，其包括(i)包括TGF-卩多肽的笫一缀合物成员和(ii)包括所述结合对的第一个成员的第二缀合物成员；和(B)—个或多个选自以下的缀合物U，)第四缀合物，其包括(i)包括抗-CD3抗体的第一缀合物成员和(ii)包括第二个结合对成员的第二缀合物成员；(b，)第五缀合物，其包括(i)包括细胞因子的第一缀合物成员和(ii)包括第二个结合对成员的第二缀合物成员；(c，)第六缀合物，其包括(i)包括抗原的第一缀合物成员和(ii)包括第二个结合对成员的第二缀合物成员；和(d，)第七缀合物，其包括(i)包括抗-CD28抗体的第一缀合物成员和(ii)包括第二个结合对成员的第二缀合物成员。在一个特定的实施方案中，结合对的第一个成员包括抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白(如核心链霉抗生物素蛋白)，而结合对的第二个成员包括生物素。在另一个特定的实施方案中，第一、第二或第三缀合物中的至少一个包括融合多肽，该融合多肽包括第一个和第二缀合物成员。在进一步的实施方案中，第一、第二或第三缀合物中的至少一个通过第一个和第二个结合对成员之间的结合与第四、第五、第六或第七缀合物中的至少一个结合。在一个特定的实施方案中，细胞因子选自IL-2和IL-4。在另一个特定的实施方案中，抗原是自体抗原。在另一个特定的实施方案中，抗原选自胰岛素、胶原、髓磷脂碱性蛋白和MHC/抗原复合物。在进一步特定的实施方案中，抗原选自谷氨酸脱羧酶(GAD)、胰岛细胞自体抗原(ICA)和自体抗原NRP-A7。根据另一个方面，本发明提供了扩增Treg细胞的方法，包括将Treg细胞群体接触(A)—个或多个选自以下的缀合物(a)第一缀合物，其包括(i)包括4-lBBL多肽的第一缀合物成员和(ii)包括结合对的第一个成员的第二缀合物成员；(b)第二缀合物，其包括(i)包括CD80多肽的第一缀合物成员和(ii)包括结合对的第一个成员的第二缀合物成员；和(c)第三缀合物，其包括(i)包括TGF-卩多肽的第一缀合物成员和(ii)包括所述结合对的第一个成员的第二缀合物成员；和(B)一个或多个选自以下的缀合物(a，)第四缀合物，其包括(i)包括抗-CD3抗体的第一缀合物成员和(ii)包括第二个结合对成员的第二缀合物成员；(b，)第五缀合物，其包括(i)包括细胞因子的第一缀合物成员和(ii)包括第二个结合对成员的第二缀合物成员；(c，)第六缀合物，其包括(i)包括抗原的第一缀合物成员和(ii)包括第二个结合对成员的第二缀合物成员；和(d，)第七缀合物，其包括(i)包括抗-CD28抗体的第一缀合物成员和(ii)包括第二个结合对成员的第二缀合物成口贝。在一个特定的实施方案中，Treg细胞包括第一、第二或第三缀合物中至少一个的受体，并且第一、第二或第三缀合物中的至少一个通过第一缀合物成员和受体之间的结合与Treg细胞缀合，而第四、第五、第六和第七缀合物中的至少一个通过第一个和第二个结合对成员之间的结合与Treg细胞缀合。在进一步的实施方案中，Treg细胞群体包括选自CD4+细胞、CD25+细胞和FoxP3+细胞的Treg细胞。在进一步的实施方案中，Treg细胞群体包括CD4+CD25+FoxP3+细胞。在一个实施方案中，该方法进一步包括将Treg细胞接触游离的IL-2。在另一个实施方案中，该方法进一步包括将Treg细胞接触游离的抗CD抗体。在一个实施方案中，该接触离体实现。在进一步的实施方案中，该方法进一步包括将扩增的Treg细胞给予患者。在另一个实施方案中，通过将缀合物给予患者在体内实现接触。在进一步的实施方案中，患者患有自体免疫疾病或处于自体免疫疾病的风险中，自体免疫疾病如I型糖尿病。在另一个实施方案中，患者是外源移植患者。在一个实施方案中，该方法进一步包括将雷帕霉素给予患者。在另一个实施方案中，该方法包括将包括展示TGF-卩的外源细胞的组合物给予患者。在一个特定的实施方案中，外源细胞选自脾细胞、胰岛组织和骨髓细胞。在另一个特定的实施方案中，通过以下方法获得外源细胞，该方法包括(a)将外源细胞接触包括结合对的第一个成员和结合所述细胞表面的分子的双功能分子来形成修饰的外源细胞和(b)将修饰的外源细胞接触包括TGF-卩和第二个结合对成员的缀合物来形成展示TGF-卩的外源细胞。根椐另一个方面，本发明提供了获得脉沖的展示TGF-卩的树突细胞的方法，该方法包括(a)用抗原脉冲未成熟的树突细胞来获得脉沖的树突细胞；(b)将脉沖的树突细胞接触包括结合对的第一个成员和结合细胞表面的分子的双功能分子来形成修饰的脉沖树突细胞；和(c)将修饰的脉沖树突细胞接触包括TGF-p和第二个结合对成员的缀合物来形成脉冲的展示TGF-卩的树突细胞。在一个实施方案中，该方法进一步包括驱使脉沖的树突细胞成熟。在一个实施方案中，抗原是致糖尿病的自体抗原，如谷氨酸脱羧酶(GAD)、胰岛细胞自体抗原(ICA)或自体抗原NRP-A7。在另一个实施方案中，抗原是胶原。在另一个实施方案中，抗原是髓磷脂碱性蛋白。根据另一个方面，本发明提供了抗原脉沖的展示TGF-卩的树突细胞群体，如通过上述方法制得的那些。根据另一个方面，本发明提供了在患者中扩增Treg细胞的方法，包括给予包括抗原脉冲的展示TGF-(3的树突细胞群体的组合物，如通过上述方法制得的那些细胞群体。在一个实施方案中，该方法进一步包括将雷帕霉素给予患者。根据另一个方面，本发明提供了获得展示TGF-卩的造血干细胞或骨髓细胞的方法，包括将造血干细胞或骨髄细胞接触包括结合对的第一个成员和结合细胞表面的分子的双功能分子来形成修饰的细胞和(b)将修饰的细胞接触包括TGF-卩和第二个结合对成员的缀合物来形成展示TGF-p的细胞。根据另一个方面，本发明提供了在患者中扩增Treg细胞的方法，包括给予含有展示TGF-p的造血干细胞或TGF-p的骨髄细胞的组合物，如通过上述方法制得的那些细胞。在一个实施方案中，该方法进一步包括将雷帕霉素给予患者。在特定的实施方案中，患者需要对自体抗原、异源抗原或外源抗原的耐受性诱导；卩细胞再生；防止外源移植排斥；或遗传性造血疾病的治疗。根据另一个方面，本发明提供了展示TGF-J3的造血干细胞群体或骨髓细胞群体，如通过上述方法制得的那些。附困简述图IA和1B列出了包括核心链霉抗生物素蛋白和鼠LIGHT蛋白胞外结构域的融合蛋白的核酸序列(SEQIDNO:1)和氨基酸序列(SEQIDNO:2)。核心链霉抗生物素蛋白序列是下划线的。图2A和2B列出了包括人CD80胞外结构域和核心链霉抗生物素蛋白的融合蛋白的核酸序列(SEQIDNO:3)和编码的氨基酸序列(SEQIDNO:4)。核心链霉抗生物素蛋白序列是下划线的。图3A和3B列出了包括鼠4-1BBL胞外结构域和核心链霉抗生物素蛋白的融合蛋白的核酸序列(SEQIDNO:5)和编码的氨基酸序列(SEQIDNO:6)。核心链霉抗生物素蛋白序列是下划线的。图4列出了包括核心链霉抗生物素蛋白和人4-lBBL胞外结构域的融合蛋白的氨基酸序列(SEQIDNO:7)。核心链霉抗生物素蛋白序列是下划线的。图5A和5B列出了包括核心链霉抗生物素蛋白和人B7.2胞外结构域的融合蛋白的核酸序列(SEQIDNO:8)和编码的氨基酸序列(SEQIDNO:9)。图6A和6B列出了包括IL-2的活性片段和核心链霉抗生物素蛋白的融合蛋白的核酸序列(SEQIDNO:10)和编码的氨基酸序列(SEQIDNO:11)。在图6B中，IL-2的序列是斜体的，并且核心链霉抗生物素蛋白序列是下划线的。图7A和图7B列出了包括核心链霉抗生物素蛋白和成熟TGF-卩的融合蛋白的核酸序列(SEQIDNO:12)和编码的氨基酸序列(SEQIDNO:13)。在图7B中，TGF-卩序列是斜体的，并且核心链霉抗生物素蛋白序列是下划线的。图8A-D说明了嵌合CSA-4-1BBL融合蛋白的构建和表征。(A)将小鼠4-1BBL的胞外结构域在C端克隆至PMT/BiP/V5-HisA栽体中的核心链霉抗生物素蛋白(SA)。(B)纯化的嵌合4-lBBL蛋白(CSA-4-1BBL)在变性(泳道2)和天然(泳道3)条件下的蛋白质印迹分析。4-1BBL在变性条件下显示为37kDa的单体，在天然条件下显示为四聚物和〉150kDa的高阶结构。(C)嵌合4-1BBL(CSA-4-1BBL)与4-1BB受体的结合。用CSA-4-1BBL(200ng/lxl()6细胞)或等摩尔量的对照CSA蛋白(灰色填充的)孵育BALB/c静息或ConA激活的脾细胞，并通过流式细胞术使用抗4-1BBLAb来检测CD4+和CD8+T细胞上的4-1BBL结合(黑线)。用抗CD137孵育一些激活的细胞来阻断受体。(D)用CSA-4-1BBL刺激T细胞。在所示浓度(ng/ml)的可溶性CSA-4-1BBL或等摩尔量的CSA存在下，使用抗CD3Ab(0.5pg/ml)和照射过的脾细胞刺激分选的CD4+T细胞。将5pg/ml的抗CD3Ab用作阳性对照。相互比较并与对照CSA蛋白比较，*/7<0.05。C和D的数据(平均土SD)表示3个独立的具有相似结果的实验。图9.使用4-1BBL的Treg细胞的离体扩增。图9说明了根据本发明的Treg细胞的长期体外扩增，在APC、抗-CD3抗体和IL-2的存在下使用CSA-4-BBL。从天然BALB/c小鼠的脾脏和淋巴结分选CD4+CD25+Treg细胞，并在6-孔平板中在0.5pg/ml可溶性抗CD3Ab、"106个照射过的同源脾细胞和25U/mlIL-2的存在下培养，使用或不使用lpg/ml可溶性4-lBBL。每3-4天，用补充IL-2的新鲜培养基并以lxl(^细胞/ml的浓度涂布来分裂细胞。(A)分选前和用或没用4-1BBL扩增后，CD4+CD25+群的流式细胞术分析。(B)对于用(□)或没用(■)4-lBBL培养的细胞，天然Treg细胞离体的成倍扩增。描绘了来自最后3个独立扩增的结果。箭头表示用抗CD3、IL-2、4-1BBL和APC(第二和第三激活剂)细胞激活没用CSA-4-1BBL的作为具有最小扩增的对照。图10说明了根据本发明离体扩增的Treg细胞上4-1BB受体的表达。将维持于培养物中18-24天的Teff和Treg细胞用4-1BB的抗体染色并通过流式细胞术分析。黑色填充的群是同型对照。图11证明了根椐本发明通过evvivo扩增的Treg细胞防止异体移植排斥。在植入异源C57BL/6胰岛前一天，给通过单次注射链脲霉素引起糖尿病的天然BALB/c小鼠获得性转移5-8xl(^个扩增的Treg细胞(0)。对照动物没有接受Treg细胞，但植入了异源胰岛()。通过超过300mg/dL的两次连续血糖读数证实了排斥。使用Kaplan-Meier对数级测试(p<0.05)来比较存活。图12A-B。扩增的Treg细胞抑制离体Teff细胞的多克隆或抗原特异性增殖。(A)在lpg/ml4-lBBL的存在或不存在下，使用扩增的Treg细胞(Exp-DP)，按照图9中所迷的进行多克隆(抗CD3Ab)抑制测试。(B)同种抗原抑制测试。将来自天然BALB/c小鼠的脾脏和外周淋巴结细胞(应答剂)与来自天然C57BL/6小鼠的照射过的脾细胞(刺激剂)和扩增的Treg细胞(Exp-DP)以所示的比例共培养5天。相互比较并与对照相比较，*/<0.05。数据(平均士SD)对于A,是4个独立实验的表示，对于B,是2个独立实验的表示，具有相似的结果。图13A-C。TCR、4-1BB和IL-2R信号对Treg细胞扩增的协同作用。图13A&13B说明了根椐本发明刺激信号1、2和3通过TCR、4-1BB和IL-2R对Treg细胞扩增的协同作用。(A)在0.5ng/mlCD3Ab的存在下，将分选的天然DPTreg细胞与照射过的同源脾细胞共同培养3天。如所示的，给培养物补充25U/ml1L-2和/或lpg/ml4-lBBL。(B)培养分选的天然DPTreg细胞，使用或不使用照射过的脾细胞，使用或不使用可溶性CD3Ab、4-lBBL和IL-2,如所示的。相互比较并与对照相比较，*/<0.05。数据(平均士SD)表示2个独立的实验，具有相似的结果。(C)未处理或在IL-2和/或APC的存在下，将分选的DP和SP细胞培养2天。将一些细胞与APC和IL-2培养2天，洗涤来除去IL-2，并再培养2天，将一些细胞未处理培养2天，并加入IL-2，并再培养2天。与同型对照(灰色填充的)，使用流式细胞术分析4-lBB的表达(黑线)。图14显示了TGF-P-CSA融合蛋白在体外抑制了同种应答。用CFSE标记ACI脾细胞并与等量的照射过的WF细胞培养，使用(B)或不使用(A)TGF-(3。在第5天，收集细胞并通过流式细胞术分析，用于CFSE稀释测试。图15A-B。通过4-lBB受体的信号抑制了Treg细胞的抑制功能并驱动两种细胞群体的增殖。(A)从天然BALB/c小鼠的脾脏和外周淋巴结分选CD4+CD25-(SP)Teff细胞和CD4+CD25+(DP)Treg细胞，单独或以1:1比例培养3天。给培养物补充照射过的脾细胞、抗CD3Ab(0.5^g/ml)和所示浓度(pg/ml)的4-1BBL或等摩尔对照SA蛋白。(B)测定SP和DP细胞增殖的CFSE测试。用CFSE标记SP或DP细胞，并用于如上所迷的抑制测试中。每个直方图显示了分裂细胞的百分比。相互比较，*/<0.05。数据(平均士SD)表示3个独立的实验，具有相似的结果。图16A-C。扩增的Treg细胞的表型表征。(A)在用或没用4-1BBL扩增的细胞上分析对于Treg细胞功能重要的细胞表面标记的表达。插入任意的垂直线作为使用或没用4-lBBL样品之间的相对比较的参照。(B)RT-PCR，显示了通过扩增的Treg细胞的FoxP3的标记(M,标记；H-HPRT，F=FoxP3;SP=CD4+CD25、，DP-CD4+CD25+;Exp-DP=扩增的Treg细胞)(C)胞内染色，显示通过用(虚线)或没用(实线)4-1BBL扩增的Treg细胞的胞内FoxP3表达水平。用于FoxP3的同型对照用作对照(填充线)。数据表示3个独立的实验，具有相似的结果。发明详述本发明提供了通过刺激三种涉及Treg细胞产生的信号中的至少一种扩增Treg细胞的方法和组合物。信号1涉及TCR，并可以用抗体如抗-OD3抗体刺激，或用通过TCR发出信号的抗原来刺激。可以通过几个不同的分子来介导信号2，包括免疫共刺激分子，如CD80和4-lBBL。信号3通过细胞因子来转导，如IL-2或TGF-P。本发明提供了可以离体或在体内实现扩增Treg细胞的方法，还提供了用于进行该方法的组合物。在一个实施方案中，该方法和组合物刺激这些信号中的两种。在另一个实施方案中，该方法和组合物刺激这些信号中的三种。在另一个方面中，本发明提供了扩增Treg细胞的方法和组合物，使用用抗原脉沖并修饰来展示TGF-卩的DC，和使用修饰来展示TGF-卩的造血干细胞或骨髄细胞。人或其他动物中的许多自体免疫疾病与少量Treg细胞和/或缺乏调节功能相关。因此，患有自体免疫疾病(如1型糖尿病)患者中Treg细胞超过丁eff细胞的择优扩增保证了基本的治疗益处。因此，本发明的方法和组合物可用于例如预防和治疗基于免疫的疾病，包括1型糖尿病，并且可用于预防异体移植排斥。出于本申请的目的，以下的术语具有这些定义如在此所用的，"一个"或"一种"意思是一个或多个，除非特意指出只表示一个。如在此所用的"给予"包括所有给患者提供物质的合适方式。常用的途径包括口服、舌下、经粘膜、经皮、直肠、阴道、皮下、肌内、静脉内、动脉内、鞘内、通过导管、通过植入等。"结合对，，指的是通过任一种分子力相互作用的两个分子，分子力包括，例如，离子、共价、疏水、范德华和氢键，使得该结合对具有相互特异性结合的特性。特异性结合的意思是在没有结合另一个分子的条件下，结合对成员呈现出相互结合。结合对的实例是生物素-抗生物素蛋白、激素-受体、受体-配体、酶-底物、IgG-蛋白A、抗原-抗体等。如在此所用的"患者，，包括任何脊推动物，包括马、羊、公山羊、牛、猪、乌类、狗、猫和灵长类物种。在一个实施方案中，患者是人。本领域技术人员将认识到特定的免疫共刺激分子、信号分子、细胞标记、细胞类型、传染剂等，关于一个物种讨论时，在不同的物种中具有相应的类似物，并且本发明包括这样的类似物及其在相应和相关物种中的用途。根据一个方面，本发明提供了包括至少一个共刺激部分的缀合物，该共刺激部分刺激信号l、信号2或信号3中的至少一个。在一个特定的实施方案中，缀合物包括共刺激部分和结合对成员。任何刺激信号之一的部分可以根据本发明来使用，任何结合对成员同样如此。以下将更详细地讨论示例共刺激部分和结合对成员。除非在此指定为"全长"，在此关于共刺激部分包括全长部分(例如，全长多肽)及其呈现出共刺激功能的片断或部分，包括但不限于，以下特意指出的那些片断和部分。因此，例如，关于4-lBBL意味着包括全长4-1BBL呈现出共刺激功能的片断或部分的多肽，如4-1BBL的胞外结构域或全长4-1BBL蛋白。信号1用于刺激信号1的示例共刺激部分包括对抗CD3的抗体或CD3以及TCR复合物、抗原/MHC复合物和通过TCR发出信号的药剂，如ionomycin和佛波醇肉豆蔻酸盐醋酸盐(PMA)的任何成分的抗体。用于免疫治疗方法中的抗-CD3抗体是本领域已知的。参见，例如，Eeale等，2005,//wmmo/.115:3-9。示例的合适抗-CD3抗体包括人或鼠抗体、人源化抗体、重组产生的抗体、单链抗体和CD3-结合抗体片段。通过本领域已知的方法可获得这样的抗-CD3抗体。如上所述，还可以使用对抗TCR复合物的任何成分的抗体，如对抗TCRa或TCRp链的抗体，和对抗CD3成分的抗体。参见，例如，Niederberger等，2005，丄肠/.77:830-41;Hamano等，2000,丄/Amww"o/.164:6113-19。再者，可以使用任何类型的抗体(人、鼠、重组、单链等)。用作刺激信号1的共刺激部分的抗原包括与目标疾病或病症相关的抗原。例如，自体抗原和胰岛素(特别是适于治疗1型糖尿病)、胶原(特别适于治疗类风湿性关节炎)、髄磷脂碱性蛋白(特别适于治疗多发性硬化)和MHC(用于治疗和预防外源移植排斥)。可以作为包括结合对成员的缀合物的一部分来给药抗原。任选，作为MHC/抗原复合物的一部分来提供抗原。在该实施方案中，MHC和抗原可以单独地为外源或同源的。例如，可以使用供体MHC和异源或同源抗原。根据本发明的一个方面，抗原是自体抗原。例如，抗原是谷氨酸脱羧酶(GAD)、胰岛细胞自体抗原(ICA)或自体抗原NRP-A7(源自胰岛特异性葡萄糖-6-磷酸酶催化性亚基相关的自体抗原，并且最近表明在糖尿病中是重要的)。这些抗原表示了胰岛特异性自体抗原全部成员中的相当一部分，因此，在提供其他潜在的自体抗原的耐受性中可能是有效的，通过抗原决定部位分布或Treg占优势的免疫调节机制。在一个特定的实施方案中，自体抗原是GAD65、ICA512或NRP-A7。根据一个实施方案，本发明提供了包括如上所述作为共刺激部分的抗-CD3抗体或抗原/MHC复合物和作为结合对成员的生物素的缀合物。可以通过本领域已知的方法通过生物素化抗-CD3抗体或抗原/MHC复合物制得这样的缀合物，并在以下的实施例中举例说明。或者，可以将抗体或抗原链接结合对成员如核心链霉抗生物素蛋白或将抗体或抗原表达为含有结合对成员如核心链霉抗生物素蛋白的融合蛋白，以形成可根椐本发明使用的另外的缀合物。信号2用于刺激信号2的示例共刺激部分包括B7和TNF家族的成员，包括但不限于以下列出的那些。<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>材这些是B细胞相关的<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>UGHTMauriD.N.,EbnerR.，MontgomeryR.I.，KochelK.D.,CheungT.C.,YuG,L.，RubenS.，MurphyM.，EisenbergR.丄，CohenG.H.,SpearP.G.，WareC.F.LIGHT,anewmemberoftheTNFsuperfamily，andlymphotoxinalphaareligandsforherpesvirusentrymediator(LIGHT,TNF超家族的新成员，并且淋巴毒素a是疱渗病毒进入介质的配体)Immunity8:21-30(1998)。GITRLGurneyA.L.，MarstersS.A.，HuangR.M.，PittiR.M.,MarkD.T.,BaldwinD.T.,GrayA.M.,DowdA.D.，BrushA.D.,HeldensA.D.，SchowA.D.，GoddardA.D.，WoodW,I.,BakerK.P.，GodowskiP.J.,AshkenaziA.Identificationofanewmemberofthetumornecrosisfactorfamilyanditsreceptor,ahumanorthologofmouseGITR(肿瘤坏死因子家族及其受体的新成员的鉴定，鼠GITR的人ortholog)。Curr.Biol.9:215-218(1999)。BLySMooreP.A.,BelvedereO.，OrrA.，PieriK.，LaFleurD.W.，FengP.,SoppetD.,ChartersM.,GentzR.，ParmeleeD.,LiY.，GalperinaO.，Giri丄,RoschkeV.,NardelliB.，CarrellJ.，SosnovtsevaS,，GreenfieldW.，RubenS.M.,HilbertD.M.,Lys:memberofthetumornecrosisfactorfamilyandBlymphocytestimulator(Lys:肿瘤坏死因子家族的成员和B淋巴细胞刺激剂)。Science285:260-263(1999)。AP肌HahneM.，KataokaT.，SchroeterM.，HofmannK.,IrmlerM.,BodmerJ-L.,SchneiderP.,BomandT.,HollerN.，FrenchLE.,SordatB.，RimoldiD.,TschoppJ.，APRIL,anewligandofthetumornecrosisfactorfamily,stimulatestumorcellgrowth(APRIL,肿瘤坏死因子家族的新配体，刺激肿瘤细胞生长)。J.Exp.Med.188:U85-1190(1998)。合适的共刺激部分的特定实例包括4-lBBL、CD80、OX40L和CD86,以下将更详细地描述。然而，应当理解，上述任何共刺激部分可以根椐本发明来使用。或者，可以使用这些共刺激部分任一种受体的抗体。这样的抗体是本领域已知的，并可以商业获得并通过本领域已知的方法获得。在本发明的一个实施方案中，使用抗-CD28抗体。用于免疫治疗方法中的抗-CD28抗体是本领域已知的。参见，例如，Earle等，上文。示例的合适抗-CD28抗体包括人或鼠抗体，人源化抗体，重组产生的抗体，单链抗体和CD28结合抗体片段。可以通过本领域已知的方法获得这样的抗-CD28抗体。4-lBBL(也称为4画BB-L,4-BB配体，TNFSF9、1LA配体)是TNF受体家族的成员，并在激活后2-3天，在激活的抗原递呈细胞(APC),包括激活的B细胞、巨噬细胞和DC上表达。4-1BB(也称为CD137)，其是4-lBBL的受体，在激活的CD4+和CD8+T细胞表面上，在自然杀伤细胞、单核细胞和静息DC上得到表达。最近还已经证明了Treg细胞组成型表达4-lBB受体。参见，例如，Choi等，2004，Z^oc.75:785-91;McHugh等，2002，/www"/(y16:311-23。4-lBBL含有254个氨基酸(26624Da)。参见，Alde画等，EurJImmunol.1994年9月；24(9):2219-27。可以在Swiss-Prot数据库中依据登录号no.P41273找到人4-1BBL的全部氨基酸序列。4-1BBL是II型糖蛋白，由残基1-28形成潜在的细胞质结构域，残基29-49形成单个预测的跨膜结构域，残基50-254形成潜在的胞外结构域，而残基35-41表示聚-Leu链。可以在GenBank登录号no.NM_003811中找到编码人4-lBBL的核苷酸序列。可以结合其同源受体4-1BB的4-1BBL的残基50-254或其片段可以连接结合对成员或表达为含有结合对成员的融合蛋白，根椐本发明来使用。例如，图3A和3B列出了CSA-鼠4-1BBL的核苷酸和氨基酸序列(SEQIDNO:5和6)。图4显示了包括人4-1BBL胞外结构域和核心链霉抗生物素蛋白的嵌合蛋白的氨基酸序列(SEQIDNO:7)。或者，可以将4-1BBL生物素化来形成包括作为共刺激部分的4-1BBL和作为结合对成员的生物素的缀合物。CD80(也称为B7.1,CD28LG或LAB7)和CD86(也称为B7.2，CD28LG2，LAB72)是示例共刺激多肽，两者都结合由T细胞表达的CD28/CTLA4共受体。CD80含有288个氨基酸(33048Da)。参见Freeman等，J.Immunol.143(8)，2714-2722(1989)。可以在Swiss-Prot数据库中依据登录号no.P33681找到人CD80的全部氨基酸序列。B7.1是I型糖蛋白，由残基1-34形成分泌信号，残基35-242形成潜在的胞外结构域，残基243-263形成潜在的跨膜结构域，而残基264-288形成潜在的细胞质结构域。因此，没有分泌信号序列的成熟B7.1分子表示氨基酸35-288。可以在GenBank登录号no.NM—005191中找到编码人B7.1的核苷酸序列。可以结合其同源受体CD28的B7.1的残基35-242或其片段可以连接结合对成员或表达为含有结合对成员的融合蛋白，根椐本发明来使用。例如，图2A和2B列出了包括人B7.1(CD80)胞外结构域和核心链霉抗生物素蛋白的嵌合蛋白的核苷酸(SEQIDNO:3)和氨基酸序列(SEQIDNO:4)。或者，可以将CD80生物素化来形成包括作为共刺激部分的CD80和作为结合对成员的生物素的缀合物。B7.2含有329个氨基酸(37696Da)。参见Freeman等，Science262(5135)，909-911(1993)。可以在Swiss-Prot数据库中依椐登录号no.P42081找到人B7.2的全部氨基酸序列。B7.2是I型糖蛋白，由残基1-23形成分泌信号，残基24-247形成潜在的胞外结构域，残基248-268形成潜在的跨膜结构域，而残基269-329形成潜在的细胞质结构域。因此，没有分泌信号序列的成熟B7.2分子表示氨基酸24-329。可以在GenBank登录号no.NM—175862中找到编码人CD86的核苷酸序列。可以结合其同源受体CD28的B7.2的残基24-247或其片段可以连接结合对成员或表达为含有结合对成员的融合蛋白，根据本发明来使用。例如，图5A和5B列出了包括人B7.2(CD86)胞外结构域和核心链霉抗生物素蛋白的嵌合蛋白的核苷酸(SEQIDNO:8)和氨基酸序列(SEQIDNO:9)。或者，可以将CD86生物素化来形成包括作为共刺激部分的CD86和作为结合对成员的生物素的缀合物。B7.2通常不在静息B细胞上表达，而是在外周血单核细胞(PBC)和DC上以低水平表达；然而，在激活后，B细胞和其它APC如巨噬细胞和DC上的表达得到上调。相反，CD86在PBC和DC上得到组成型表达，并且在B细胞上得到更快速的上调。T细胞受体(TCR)与APC上的MHC/肽复合物的相互作用使T细胞上的CD80/86与CD28同时增强，这导致脂质激酶磷脂酰肌醇3-激酶的酪氨酸磷酸化，其随后抑制一系列导致IL-2基因表达的诱导、细胞增殖和分化成效应物功能的复杂胞内事件。信号2可以通过调节抗凋亡基因如Bal-xL来防止细胞死亡而进一步增大产生性免疫应答。OX40L是由树突细胞和其他APC表达的，并结合存在于激活的T细胞上的OC40。OX40L含有183个氨基酸(21950Da)。参见Miura等，Mol.Cell.Biol.il:1313-1325(1991)。可以在Swiss-Prot数据库中依据登录号no.P23510找到OX40L的全部氨基酸序列。OX40L是II型糖蛋白，残基1-23为细胞质结构域，残基24-50为跨膜结构域，而残基51-183为胞外结构域。OX40L的核苷酸序列为3510bp,编码序列为157-708(参见GenBank登录号no.NM—003326.2)。可以结合其同源受体OX40的OX40L的残基5卜183或其片段可以连接结合对成员或表达为含有结合对成员的C-端融合体，根据本发明来使用。LIGHT多肽(也称为TNFS14、HVEM-L、LTg、TR2)是与淋巴毒素同源的TNF超家族成员。参见Mauri等，Immunity8(1)，21-30(1998)。可以在Swiss-Prot数据库中依据登录号no.043557找到人LIGHT的全部氨基酸序列。LIGHT含有240个氨基酸(26351Da)并且是II型糖蛋白，由残基1-37形成潜在的细胞质结构域，残基38-58形成单个预测的跨膜结构域，而残基59-240形成潜在的胞外结构域。分裂位点涉及残基82-83。可以在GenBank登录号no.NMJ720M中找到编码人LIGHT的核苷酸序列。可以结合其同源受体HVEM、LT卩R或TR6的LIGHT的残基59-240或其片段可以连接结合对成员或表达为含有结合对成员的融合体，根据本发明来使用。例如，图1A和IB列出了包括核心链霉抗生素和鼠LIGHT胞外结构域的嵌合蛋白的核苷酸(SEQIDNO:1)和氨基酸序列(SEQIDNO:2)。或者，可以将LIGHT生物素化来形成包括作为共刺激部分的LIGHT和作为结合对成员的生物素的缀合物。LIGHT主要在激活的T细胞、NK细胞和未成熟的树突细胞上表达，并用来调节免疫应答的各个方面。作为膜结合蛋白来合成LIGHT,但是其细胞表面表达受到几个翻译后机制的调节。在表达的几分钟内通过基质金属蛋白酶从细胞表面分离LIGHT并作为可溶性分子累积(异形体l;大概表示残基83-240;Swiss-Prot043557-1)。细胞表面细胞质片段表示异形体2(Swiss-Prot043557-2)。此外，各种细胞类型在泡嚢中存储LIGHT并在激活时通过各种生物刺激分泌出来。尽管LIGHT的可溶性形式的作用没有得到充分的表征，可以作为负反馈环，通过与HVEM和LT(3R竟争来抑制膜结合形式的功能。LIGHT与三个不同的受体相互作用(1)T细胞上的疱渗病毒进入介质(HVEM),(2)LTpR，其主要在上皮细胞和基质细胞上表达，和(3)各种细胞上的可溶性诱骗受体3。这些相互作用赋予LIGHT不同的功能。与基质细胞上的LTJ3R的相互作用与各种细胞因子/趋化因子的产生、淋巴结(LN)器官发生和二级淋巴结构的恢复相关。另一方面，LIGHT与淋巴细胞上的HVEM受体的相互作用导致细胞因子的激活和产生，主要为IFN-y和GM-CSF。关于这点，LIGHT/HVEM轴似乎传送与Th型应答激活相关的共剌激信号，这在肿瘤消除中起着关键作用。信号3用于刺激信号3的示例共刺激部分包括刺激信号3的细胞因子和生长因子，如IL-2、IL-4和TGF-p(包括TGF-卩1、TGF-p2和TGF-卩3)。用于治疗方法中的IL-2和IL-4部分是本领域已知的。参见，例如，Eare等，2005,上文；Thorton等，2004,/w/wwwo/,172:6519-23;Thorton等，2004，￡w,/mww"o/.34:366-76。根据一个实施方案，使用细胞因子的成熟部分。例如，IL-2或IL-4,或其活性片段，可以链接结合对成员或表达为含有结合对成员的融合蛋白，根据本发明来使用。例如，共同未决u.S.专利申请10/312,245公开了包括IL-2或IL-4的成熟部分和核心链霉抗生物素蛋白的嵌合蛋白，根椐本发明是有用的。还可以参见图6A和6B,其列出了IL-2-CSA嵌合蛋白的核苷酸(SEQIDNO:10)和氨基酸(SEQIDNO:ll)序列。或者，可以通过本领域已知的方法，将IL-1或IL-4生物素化来提供包括作为共剌激部分的IL-2或IL-4和作为结合对成员的生物素的缀合物。参见，例如，Jordan等，2003，C/i",DZag.Z^f6.//wwwwo/.10:339-44;DeJong等，1995,/wwwwo/.A/"/oc^184:101-12。TGF-卩1(也称为TGF-卩，TGF1，CED，DPD1,HGNC:2997，进展性骨干性发育异常1，转化生长因子pi)是多功能肽，控制许多细胞类型中的增殖、分化和其他功能。许多细胞合成(并分泌)TGF-卩l,并且基本上全部具有该肽的特定受体。TGF-|31调节许多其他肽生长因子的作用，并测定这些作用的正向或负向。它在骨重塑中起着重要作用，并且是潜在的成骨性骨形成剌激剂，引起涉及的成骨细胞的趋化性、增殖和分化。TGF-J31分子包括390个氨基酸(44,341道尔顿)。这是分裂成成熟TGF-pi和潜伏相关肽(LAP)的前体物质。没有活性的形式由非共价结合LAP同型二聚物的TGF-pl同型二聚物构成。没有活性的复合物可以含有潜在的TGF-p结合蛋白。活性形式是具有单体形式的12个氨基酸的成熟卩的同型二聚物，这是二疏化物连接的。SwissProt数椐库中依据登录号P01137找到的氨基酸序列包括残基1-29处的29个氨基酸的信号肽，残基30-278处的249个氨基酸的潜在相关肽，残基279-390处的112个氨基酸的活性的TGF-pl基因的核酸序列，其中编码序列在碱基842-2017。核酸序列最初TGF陽卩l,残基244-246处的3个氨基酸的细胞连接位点。存在许多变体序列，本发明包括这些。在GenBank依据登录号no.NM-000660找到表示核苷酸1-2745公开于Dernyk等，1987,Nucl.Acids.Res。TGF-pl作为可溶性的膜结合生长因子存在，并主要涉及器官生成和胚胎的早期模式。TGF-卩在免疫系统中起着重要作用。例如，缺乏TGF-pi的小鼠寿命短并且由于关鍵器官中的炎性淋巴细胞和巨噬细胞的大规模渗透而死亡，涉及外周耐受性中的TGF-卩1。一系列最近的研究已经表明TGF-卩能够介导各种自体免疫和移植情况中对自体和同种抗体的耐受性。例如，在大鼠中，使用供体特异性输血的同种异体移植与移植物内的高水平TGF-(3相关，通过渗透淋巴细胞和阻断抗TGF-卩废除的耐受性。Josien等，1998，C//"./"窗,.102:1920-26。此外，心脏移植物中的TGF-卩异常表达使得它们在同种异体接受者中的长期存活。同前。此外，在NOD中，发现使用抗-CD3抗体建立的自我耐受性依赖性TGF-p。Belghith等，2003,M^/.9:12-02-08。还已经表明胰岛细胞中TGF-卩的瞬时表达通过Treg细胞能有效预防NOD中的自体免疫糖尿病。Peng等，2004，爿c"dSc/.WW4572-77。相似地，使用TGF-卩1的全身基因治疗导致明显糖尿病NOD中的耐受性，卩的细胞耐受性，和糖尿病的治疗。Luo等，2005，7Va"s//a"f""ow79:1091-96。TGF-卩还已经显示出在Treg细胞的产生、体内平衡和扩增中起着重要作用。例如，由于通过TGF-卩的FoxP3的调节，缺陷TGF-pl的小鼠在外周中具有降低数量的Treg细胞。Peng等，上文。Treg细胞从TGF-J3缺陷小鼠获得性转移至野生型动物导致它们持久的存在和功能，可能是由于TGF-j31的副分泌作用。还已经显示出TGF-卩在NOD中的体内平衡和Treg细胞的功能中起着重要作用。参见，例如，Pop等，丄201:1333-46。与抗病林相比较，NOD小鼠具有显著降低的绝对数量的Treg细胞。这种降低是由TGF-p细胞表面表达降低引起的，这随后导致降低的FoxP3表达和改变的Treg细胞的功能，这与疾病的发作相一致。参见，例如，Gregg等，2004,7./画歸/.173:7308-16;You等，2005，D,'a6e,w54:1415-22;Pop等，上文。TGF-卩还在通过诱导FoxP3表达将天然CD4+CD25T细胞转化成Treg细胞中起着重要作用。TGF-卩转化的Treg细胞可以抑制T细胞增殖并防止抗原激发后的T细胞的克隆扩增。尽管非常少的研究聚焦于TGF-卩诱导FoxP3表达的机制，这种作用似乎通过抑制Smad7的下调来介导，这种下调由FoxP3引起，因此使TGF-(3信号通过正调节剂Smad3和4。TGF-j3,或其活性片段，可以连接结合对成员或表达为含有结合对成员的融合蛋白，根据本发明来使用。例如，共同未决的U.S.专利申请10/312,245公开了包括人TGF-卩的活性结构域和核心链霉抗生物素蛋白的嵌合蛋白，根据本发明来使用。请参阅图7A和7B，其各自列出了该嵌合蛋白的核苷酸(SEQIDNO:12)和氨基酸(SEQIDNO:13)序列。或者，可以通过本领域公知的方法将TGF-卩或其活性片段生物素化，以提供包括作为共刺激部分的TGF-p和作为结合对成员的生物素的缀合物。还可以商业获得生物素化的IL-2(R&DSystems)。结合对成员示例结合对是生物素和链霉抗生物素蛋白(SA)或抗生物素蛋白。还可以使用保持对生物素的基本结合活性的SA或抗生物素蛋白片段，如各自至少50%或更多天然SA或抗生物素蛋白的结合活性。这样的片段包括"核心链霉抗生物素蛋白"("CSA"),全长链霉抗生物素蛋白多肽的截断形式，其包括链霉抗生物素蛋白残基13-138、14-138、13-139或14-139。参见，例如，Pahler等，丄仏o/.C/^.1987.262:13933-37。还可以使用保持强烈结合生物素的其它链霉抗生物素蛋白和抗生物素蛋白的截断形式。参见，例如，Sano等，J5/o/C/^w.1995年II月24日，270(47):28204-09(描迷了核心链霉抗生物素蛋白变体16-133和14-138)(U.S.专利no.6.022,951)。还可以使用保持基本生物素结合活性或提高的生物素结合活性的链霉抗生物素蛋白突变体和链霉抗生物素蛋白核心形式。参见，Chilcoti等，尸wc層Jca""1995Feb28;92(5):1754-8;Reznik等，iVw^/Wec/mo/.1996年8月；14(8):1007-11。例如，可以使用具有降低免疫原性的突变体，如通过定点诱变除去潜在的T细胞抗原决定部位或淋巴细胞抗原决定部位突变的突变体。参见Meyer等，/Vo&,'"Sc/.200110:491-503。同样，也可以使用保持基本生物素结合活性或提高的生物素结合活性的抗生物素蛋白的突变体和抗生物素蛋白的核心形式。参见，Hiller等，A'oc/iew.(1991)278:573-85;Livnah等，/Voc/4cadS"t/&490:5076-80(1993)。为了方便，在此刻的描迷中，如在此所用的术语"抗生物素蛋白，，和"链霉抗生物素蛋白"包括这些结合对成员的生物素结合片段、突变体和核心形式。抗生物素蛋白和链霉抗生物素蛋白可从商业供应商获得。此外，可以找到编码链霉抗生物素蛋白和抗生物素蛋白的核酸序列以及链霉抗生物素蛋白和抗生物素蛋白氨基酸序列，例如，在GenBank登录号No.X65082;X03591;NM—205320;X05343;Z21611和Z21554。如在此所用的"生物素"包括能够结合表面如细胞表面(包括胂瘤细胞表面)的含生物素部分，如NHS-生物素和EZ-LinkTM磺基-NHS-LC-生物素(Pierce)。这样的生物素的蛋白反应性形式是可购得的。在本发明的范围中，生物素及其结合伴侣抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白之间的相互作用赋予了几个优势。例如，生物素对于链霉抗生物素蛋白(1013M")和抗生物素蛋白(10"M")具有非常高的亲和性。此外，链霉抗生物素蛋白和抗生物素蛋白是各自结合四个生物素分子的四聚合多肽。因此，包括链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白的免疫共刺激部分具有形成四聚物和高级结构的趋势。因此，它们可以交联其对应的免疫细胞受体，用于更有效的信号转导，如通过受体的累积。本领域技术人员将认识到可以使用其它机理(例如，其它缀合方法，例如使用其它连接部分或化学或基因交联)来提供免疫共刺激分子的高阶结构，如包括免疫共刺激分子的二聚物、三聚物、四聚物和高阶多聚物的缀合物，其同样呈现出有利的特性。这样的缀合物包括在本发明的范围内。缀合物如上所述，本发明的一个方面涉及包括至少一个共刺激部分和结合对成员的缀合。可以通过本领域公知的方法制得这样的缀合物。例如，共刺激部分和结合对成员可以直接或通过连接物相互共价结合或相互缀合。根据本发明的一个实施方案，缀合物是包括共刺激多肽和结合对成员如CSA的融合蛋白。可以通过本领域已知的多种不同方法中的任一种来制得融合蛋白。例如，可以化学合成或可以使用公知的重组核酸技术来产生一个或多个融合蛋白的成分多肽。(如在此所用的，"核酸，，指的是RNA或DNA)。可以使用例如聚合酶链式反应(PCR)来获得本发明中有用的核酸序列。各种PCR方法描述于，例如，尸C尺尸n7ner,'爿La60mf07Ma簡a/,Dieffenbach7Dveksler编辑,ColdSpringHarborLaboratoeyPress,1995。根椐一个实施方案，共刺激多肽通过其C-端与结合对成员的N-端结合。例如，本发明包括CD80-CSA融合蛋白，TGF-P-CSA融合蛋白，IL-2-CSA融合蛋白和IL-4-CSA融合蛋白，其中CD80、TGF-卩、IL-2或1L-4部分通过其.C-端与CSA的N-端结合。根据另一个实施方案，共刺激多肽通过其N-端与结合对成员的C-端结合。例如，本发明包括CSA-4-1BBL融合蛋白，其中CSA部分通过其C-端与共刺激部分的N-端结合。共刺激多肽可以与结合对成员直接结合或可以通过一个或多个连接部分如一个或多个连接多肽来结合。包括共剌激多肽片段和/或结合对成员片段的核酸和多肽可用于本发明中，只要片段保持参照全长多肽的活性。因此，共刺激部分应当保持其共刺激活性(例如，保持其结合其受体或配体的能力)，并且结合对片段应当保持其结合其结合成员的能力。通过本领域的常规方法对于保留的活性来筛选片段，包括在以下实施例中举例说明的那些。以下列出了示例性的共刺激多肽片段。缀合物可以在结合对成员和共刺激部分之间包括连接物如肽连接物。可以选择连接物长度和组成来提高部分任一功能端的活性。连接物通常为约3至约15个氨基酸长，更优选约5至约10个氨基酸长，然而，可以使用更短或更长的连接物，或可以全部分配连接物。在这点上，可以使用已经用来连接单链抗体的重链和轻链的弹性连接物(例如，(Gly4Ser)3)。参见，Huston等(1988)尸赋淑.力caof.S"园，85:5879-5883;U.S.专利No.5,091,513，5,132,405，4,956,778;5,258,498和5,482,858。其它连接物是FENDAQAPKS或LQNDAQAPKS。免疫球蛋白Fc片段的一个或多个结构域(例如，CH1、CH2和/或CH3)也可以用作连接物。还可以使用化学连接物。修饰的、改变的或突变的核酸和多肽在本发明中也是有用的，只要它们保持参照核酸或多肽的活性。例如，适用于本发明的核酸和多肽序列与参照核酸或多肽，即，与编码已知免疫共刺激多肽或结合对成员的核酸序列，具有至少约80%的序列同一性(包括至少80%的序列同一性)。在一些实施方案中，核酸序列或多肽与参照核酸或多肽具有至少约85°/。、至少约90%、至少约95%或至少约99%的序列同一性。本发明包括碱基改变"沉默"的核酸，因为它们编码相同的氨基酸(即。简并核酸序列)。本发明还包括编码具有保守氨基酸置换的多肽的核酸，以及这样的多肽。保守氨基酸置换(例如，用不同的疏水性残基替代一个疏水性残基)是本领域公知的并可以例如通过点突变等来实现。可以使用本领域已知的受体结合和/或生物筛选方法来证实给定的修饰序列、变体或突变体的适用性，如以上关于片段所迷的那些方法。如在此所用的，通过测定比对的核酸或多肽序列中配对位置的数量，将配对位置的数量除以比对核苷酸或氨基酸各自的总数并乘以100来计算"％序列同一性"。配对的位置指的是在比对序列的相同位置出现相同核苷酸或氨基酸的位置。比对核苷酸或氨基酸的总数指的是比对第二个序列需要的核苷酸或氨基酸的最小数量，并不包括非同源序列的比对(例如，强迫的比对)，如可以在目标序列的N-端或C-端融合的那些序列(即，编码免疫共刺激多肽或结合对成员的序列)。比对核苷酸或氨基酸的总数可以对应于完整的编码序列，或可以对应于全长序列的片段，如在此所限定的。可以使用Altschul等(1997,NucleicAcidsRes.,25:3389-3402)描述的算法来比对序列，因为引入了BLAST(基本局部比对搜索工具)程序中，在环球网的ncbi.nlm.hih.gov可获得。可以进行BLAST搜索或比对来测定核酸分子("询问序列")和任何其它序列或其片段之间的百分比序列同一性，使用Altschul算法。可以使用BLASTN来比对和比较核酸序列之间的同一性，而使用BLASTP来比对和比较氨基酸序列之间的同一性。使用BLAST程序计算编码治疗性多肽的核酸序列与另一个序列之间的百分比同一性时，可以使用各自程序的缺省参数，包括缺口惩罚的缺省。可以通过如DNA或RNA印迹分析(即，杂交)、PCR或原'位杂交分析这样的方法来检测本发明的核酸。通常通过转染细胞系中的免疫细胞化学或通过十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳接着考马斯蓝染色或蛋白质印迹分析来检测多肽，使用具有特定多肽的特异性结合亲和性的抗体(单克隆或多克隆)。这些方法中的许多更详细地描迷于Sambrook等(1989,MolecularCloning:ALaboratoryManual(分子克隆实验室手册)，第2版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY)。编码免疫共刺激多肽和结合对成员的核酸序列可以在构建体中可操作地相互连接，使用常规的分子生物学技术。参见，例如，A/o/ecw/arC/om"g.'Z^6om"o/Ma"w"/(分子克隆实验室手册)(Sambrook等,2001，第2版，ColdSpringHarborLaboratoryPress)或S/zoW/VofocoAs/"Mo/ecw/"r(分子生物学的简洁实验方案)(Ausubel等，2002,第5版，CurrentProtocols)。适用于这些方法中的构建体是可购得的并是本领域日常使用的。构建体可以包括表达需要的序列，如启动子序列，调控序列，如增强子序列，和应答序列和/或可诱导的序列，调节核酸序列的表达。如在此所用的，"可操作地连接"指的是(i)以指导或调节核酸表达的方式相对于核酸序列来放置启动子和/或其它调控序列；和/或(ii)放置编码免疫共刺激多肽的核酸和编码结合对成员的核酸，使得编码序列"在框内"，即，使得构建体编码包括免疫共刺激多肽和结合对成员的融合蛋白。可以通过本领域已知的方法将构建体繁殖或表达，以在宿主细胞内产生多肽。如在此所用的，术语"宿主"或"宿主细胞"意思是不仅包括原核生物，如大肠杆菌，而且包括真核生物，如酵母、昆虫、植物和动物细胞。动物细胞包括，例如，COS细胞和HeU细胞。可以用DNA分子(例如，构建体)转化或转染宿主细胞，使用本领域技术人员公知的任一种技术，如磷酸仍或醋酸锂沉淀、电穿孔、脂转染和微粒轰击。含有本发明栽体的宿主细胞可以用于如繁殖载体、生产核酸(例如，DNA或RNA)、表达免疫共刺激多肽或其片段或表达融合蛋白的目的，如上所述。图1A&1B、2A&2B、3A&3B、4A&4B、5A&5B和7A&7B显示了代表性的核酸序列(SEQIDNO.1、3、5、8、10&12),这些序列编码包括核心链霉抗生物素蛋白和共刺激多肽的缀合物，以及相应编码的氨基酸序列(SEQIDNO.2、4、6、7、9、11&13)。本发明还提供了包括共刺激部分和作为结合对成员的生物素的缀合物。可以通过本领域已知的方法将共刺激部分生物素化，并且在以下的实施例中举例说明。例如，来自Avidity,Inc.(Denver,CO)的生物素AviTag技术可以用来产生生物素化的蛋白。生物素Av汀ag由唯一的15个氨基酸肽构成，该肽由生物素连接酶BirA识别，生物素酶连接生物素与肽序列中的赖氨酸残基。Schatz，1993，Biotechnology,11:1138-43。生物素AviTag可以在遗传上融合至任何目标蛋白，使得可以用生物素分子标卡己蛋白质。生物素AviTag技术的一个潜在缺陷是低生物素化程度的可能性，因为系统在标记物片段中的单个唯一的赖氨酸残基生物素化蛋白。为了克服任何这样的问题，可以使用纯化的生物素连接酶在体外修饰纯化的得到标记的蛋白。因为通过酶进行生物素化，反应条件是温和的，标记是高度特异性的，并且反应比使用生物素衍生物的蛋白化学修饰更有效。或者，Jordan等上文中所述的方法可以用来产生工程化且生物化的蛋白质。缀合物组合根据一个实施方案，本发明提供了用于扩增Treg细胞方法中的缀合物组合。在一个特定的实施方案中，组合包括(a)至少一个包括(i)刺激信号1、信号2或信号3中至少一个的部分和(ii)结合对的第一个成员的缀合物和(b)至少一个包括(i)刺激信号1、信号2或信号3中至少一个的部分和(ii)第二个结合对成员的缀合物。在一个实施方案中，组合包括刺激信号l、信号2或信号3中至少一个的部分。在一个特定的实施方案中，该部分刺激信号3。例如，该部分可以包括IL-2或IL-4。在另一个实施方案中，组合物包括刺激信号l、2和3中至少两个的部分。在一个特定的实施方案中，该部分刺激信号2和3。在另一个特定的实施方案中，该部分刺激信号1和3。在另一个实施方案中，组合物包括刺激信号l、2和3全部的部分。在一个实施方案中，组合包括(A)—个或多个选自以下的缀合物(a)第一缀合物，其包括(i)包括4-lBBL多肽的第一缀合物成员和(ii)包括结合对的第一个成员的第二缀合物成员；(b)第二缀合物，其包括(i)包括CD80多肽的第一缀合物成员和(ii)包括结合对的第一个成员的第二缀合物成员和(c)第三缀合物，其包括(i)包括TGF-卩多肽的第一缀合物成员和(ii)包括所述结合对的第一个成员的第二缀合物成员，和(B)—个或多个选自以下的缀合物(a，)第四缀合物，其包括(i)包括抗-CD3抗体的第一缀合物成员和(ii)包括所迷结合对成员的第二个成员的第二缀合物成员；(b，)第五缀合物，其包括(i)包括细胞因子的第一缀合物成员和(ii)包括所述结合对的第二个成员的第二缀合物成员；(c，)第六缀合物，其包括(i)包括抗原的第一缀合物成员和Ui)包括第二个结合对成员的第二缀合物成员；和(d，)第七缀合物，其包括(i)包括抗-CD28抗体的第一缀合物成员和(ii)包括所述结合对的第二个成员的第二缀合物成员。如上所述，任一种或多种缀合物可以包括融合多肽，该融合多肽包括第一缀合物(例如，共刺激部分)和第二缀合物成员(例如，结合对成员)。在一个实施方案中，结合对的第一个成员包括抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白(包括核心链霉抗生物素蛋白)，并且结合对的第二个成员包括生物素。可以在分开的组合物，或在单个组合物中来提供缀合物。每个组合物可以进一步包括药物学上可接受的栽体、赋形剂或稀释剂，如本领域已知的。药物学上可接受的栽体是可以用作组合物介质的物质，因为在给药范围中，该物质是惰性的或另外在医学上是可接受的，以及与活性剂是兼容的。药物学上可接受栽体可以含有本领域公知的常4见药物添加剂。在单个组合物中提供組合时，第一、第二或第三缀合物中的至少一个可以通过第一个和第二个结合对成员之间的结合与第四、第五、第六或第七缀合物中的至少一个结合。示例性组合包括以下的一个或多个包括4-1BBL和核心链霉抗生物素蛋白的缀合物或融合蛋白；包括CD80和核心链霉抗生物素蛋白的缀合物或融合蛋白；包括TGF-卩和核心链霉抗生物素蛋白的缀合物或融合蛋白；包括抗原(或抗原/MHC复合物)和生物素的缀合物；包括IL-2和生物素的缀合物；包括IL-4和生物素的缀合物；包括抗-CD3抗体和生物素的缀合物，和包括抗-CD28抗体和生物素的缀合物。方法
技术领域：
：本发明还提供了扩增Treg细胞的方法。在一个实施方案中，该方法涉及将Treg细胞接触(a)至少一个包括(i)刺激信号1、信号2或信号3中至少一个的部分和(ii)结合对的第一个成员的缀合物和(b)至少一个包括(i)刺激信号1、信号2或信号3中至少一个的部分和(ii)第二个结合对成员的缀合物。在一个实施方案中，该方法包括将Treg细胞接触刺激信号1、信号2或信号3中至少一个的部分。在一个特定的实施方案中，该部分刺激信号3。例如，该部分可以包括IL-2或IL-4。在另一个实施方案中，该方法包括将Treg细胞接触刺激信号1、2和3中至少两个的部分。在一个特定的实施方案中，该部分刺激信号2和3。在另一个特定的实施方案中，该方法刺激信号1和3。在另一个实施方案中，该方法包括将Treg细胞接触刺激信号1、2和3中全部信号的部分。根据一个特定的实施方案，该方法包括将Treg细胞群体接触(A)—个或多个选自以下的缀合物(a)第一缀合物，其包括(i)包括4-lBBL多肽的第一缀合物成员和(ii)包括结合对的第一个成员的第二缀合物成员；(b)第二缀合物，其包括(i)包括CD80多肽的第一缀合物成员和(ii)包括结合对的第一个成员的第二缀合物成员和(c)第三缀合物，其包括(i)包括TGF-卩多肽的第一缀合物成员和(ii)包括所迷结合对的第一个成员的第二缀合物成员，和(B)—个或多个选自以下的缀合物(a，)第四缀合物，其包括(i)包括抗-CD3抗体的第一缀合物成员和(ii)包括所述结合对成员的第二个成员的第二缀合物成员；(b，)第五缀合物，其包括(i)包括细胞因子的第一缀合物成员和(ii)包括所迷结合对的第二个成员的第二缀合物成员；(c，)第六缀合物，其包括(i)包括抗原的第一缀合物成员和(ii)包括第二个结合对成员的第二缀合物成员；和(d，)第七缀合物，其包括(i)包括抗-CD28抗体的第一缀合物成员和(ii)包括所述结合对的第二个成员的第二缀合物成员。如上所迷，已经发现Treg细胞表达4-lBBL、CD80和TGF-卩的受体。因此，根椐一个实施方案，Treg细胞包括第一、第二或第三缀合物中至少一个的受体，由此第一、第二或第三缀合物中的至少一个通过第一缀合物成员和受体之间的结合与Treg细胞缀合。根据该实施方案，缀合物将结合其受体并与受体交联，用于Treg激活和扩增。在该实施方案进一步的方面中，第四、第五、第六和第七缀合物中的至少一个通过第一个或第二缀合物中的至少一个与Treg细胞缀合，通过笫一个和第二个结合对成员之间的结合。Treg细胞群体可以包括CD4+细胞、CD25+细胞和FoxP3+细胞。在一个特定的实施方案中，Treg细胞群体包括CD4+CD25+FoxP3+细胞。根据一个实施方案，可以离体来实现该方法，通过离体将Treg细胞接触缀合物。在该实施方案的一个方面中，基本上同时将至少两个缀合物接触Treg细胞。例如，在接触Treg细胞群体的单个组合物中提供至少两个缀合物。在一个特定的实施方案中，第一、第二或第三缀合物中的至少一个通过第一个和第二个结合对成员之间的结合与笫四、第五、第六和第七缀合物中的至少一个结合。根据本发明方法的另一个离体实施方案，按次序将至少两个缀合物与Treg细胞接触。例如，可以在按次序接触Treg细胞群体的分开的组合物中提供至少两个缀合物。根椐该后一个实施方案，通过4-lBBL和/或CD80和/或TGF-卩及其在Treg细胞上的受体之间的结合，第一、第二和/或第三缀合物首先接触并使其结合Treg细胞。然后，第四、第五、第六和/或第七缀合物可以接触并使其结合Treg细胞，通过第一个和第二个结合对成员之间的结合。例如，可以通过使用标准技术从患者获得Treg细胞并纯化来实现Treg细胞的离体扩增，如使用抗CD25和CD4的抗体。然后在包括共刺激部分(如CSA-4-1BBL)的缀合物、包括抗-CD3抗体(如生物素化的抗-CD3抗体)和IL-2(包括生物素化的IL-2)的缀合物的存在下培养純化的Treg细胞。刺激3天后，给培养物补充IL-2(含有或不含有另外的4-lBBL)，持续7天。在一个实施方案中，从开始还使用了包括TGF-卩的缀合物(如CSA-TGF-卩或生物素化的TGF-卩)，持续几周，或贯穿整个培养过程。再次重复该循环，只要将细胞保持于培养物中。根据另一个实施方案，通过将缀合物给药于患者在体内实现扩增Treg细胞的方法。根据该实施方案，可以按次序或基本上同时来给药缀合物。例如，可以按次序或基本上同时作为分开的组合物来给药组合物，或可以作为单个组合物来给药组合物。根据按次序给药組合物的实施方案中，通过4-1BBL和/或CD80和/或TGF-卩及其在Treg细胞上的受体之间的结合，第一、第二和/或第三缀合物首先给药并使其定位于Treg细胞。然后，可以给药第四、第五、第六和/或第七缀合物，并通过第一个和第二个结合对成员之间的结合使其定位于Treg细胞。在单个组合物中同时给药组合物的实施方案中，第一、第二和/或第三缀合物可以通过第一个和第二个结合对成员之间的结合与第四个、第五个、第六个和/或缀合物结合。根据该实施方案，通过4-lBBL和/或CD80和/或TGF-卩及其在Treg细胞上的受体之间的结合，缀合物可以定位于Treg细胞。可以全身或局部给药缀合物，如通过静脉内、腹膜或皮下注射。在一个实施方案中，可以通过不同的途径给药一个或多个缀合物。例如，可以局部给药一种或多种缀合物，并且可以全身给药一个或多个缀合物。本发明还包括在缀合中与缀合物一起使用游离共刺激部分，即该部分不是上迷缀合物成分的实施方案。因此，例如，Treg细胞可以接触一个或多个缀合物，如上所述，并且还接触一个或多个游离共刺激部分，如外源IL-2、IL-4或抗-CD3抗体。可以与接触一个或多个缀合物同时、之前或之后，将Treg细胞接触一个或多个游离共刺激部分。如上所述，可以离体或在体内实现这种接触。根椐该实施方案，所用的外源IL-2的量比现有技术方法需要的高量低得多。例如，在现有技术方法使用2000IU/mL的情况中，我们显示出更低的量，包括25IU/mLIL-2，是有效的。因此，本发明包括低于约25IU/mL至至少约1000IU/mL或更高量的IL-2的方法。例如，本发明包括使用低于约25IU/mL、约25IU/mL、约50IU/mL、约75IU/mL、约100IU/mL、约150IU/mL、约200IU/mL、约250IU/mL、约300IU/mL、约350IU/mL、约400IU/mL、约450IU/mL、约500IU/mL、约600IU/mL、约700IU/mL、约800IU/mL、约900IU/mL、约1000RJ/mL或更高量的IL-2的方法。以下实施例中讨论的数椐表明信号3的刺激对Treg扩增是重要的。在本发明的范围中，可以使用包括刺激信号3的部分的缀合物来刺激信号3，这样的部分包括IL-2、IL-4或另一个细胞因子。或者，可以使用刺激信号3的游离共刺激部分如外源IL-2或IL-4来刺激信号3。在另一个可替换的实施方案中，可以通过任何其他方式，如本领域已知的其他方式来刺激信号3。本发明还提供了将Treg细胞给药于患者的方法，其中根据上迷的方法离体扩增Treg细胞。根椐该实施方案，通过上述在的任何途径如静脉内来给药Treg细胞。合适的患者包括需要Treg细胞扩增的人或其他动物。例如，根据本发明，患有自体免疫疾病如I型糖尿病或处于自体免疫疾病风险中的患者，或接受外源移植植入物的患者(即，同种异体移植患者和异种移植)，是Treg扩增的目标患者，接受骨髓移植的肿瘤患者(来预防GVHD)和接受外源造血或其他干细胞(如进行治疗来产生很能够混合嵌合体来治疗造血遗传缺陷或自体免疫疾病)的患者亦是如此。本发明还可以用于治疗患有由致病丁eff细胞的扩增引起或与致病Teff细胞的扩增相关的任何疾病或处于这样疾病风险中的患者。在一个实施方案中，该方法进一步包括将雷帕霉素给药于患者。雷帕霉素具有有效的免疫抑制活性，并且已经广泛用来防止实验和临床情况中的移植排斥。雷帕霉素没有干扰T细胞的激活，但用来防止IL-2介导的信号，并且细胞周期停止于Gl-S边界，因此导致T细胞无反应性和/或凋亡，并诱导手术耐受性。雷帕霉素通过抑制mTOR来起作用，mTOR是涉及蛋白合成启动和存活信号传输的丝氨酸/苏氨酸激在本发明范围中重要的是就产生、维持和功能而言，雷帕霉素对Treg细胞和Teff细胞的不同作用。和calcineurin抑制剂如环孢霉素和他克莫司不同，雷帕霉素不干扰Treg细胞中FoxP3的激活和高表达水平。参见，例如，Baan等，2005，r謂—"麵ow80:110-17。在体内使用雷帕霉素已经显示出能诱导CD4+CD8+胸腺细胞的凋亡并导致外周调节CD4+CD25+T细胞的扩增。Tian等，2004，7Va"^/aW""o"77:183-89。在离体培养中，显示出雷帕霉素没有千扰人Treg细胞的功能，而是抑制了Teff细胞的增殖和细胞因子分泌，并且与Teff细胞相反，Treg细胞能抵抗雷帕霉素诱导的凋亡。Game等，2005，/iw.rm"^/a"^5:454-64。与这些研究相一致，还已经显示出，在雷帕霉素的存在下，Teff细胞在通过抗原的体外激活后经历激活诱导的细胞死亡(AICD),而Treg细胞优先得到扩增并且在获得性转移至抑制接受者中时能够阻断异源胰岛的排斥。Battaglia等，2005，别ood105:4743-48。雷帕霉素还显示出能改变DC的免疫刺激功能朝向更加致耐受的表型，这随后可以作为正反馈回路，用于Treg细胞的产生和扩增。Chiang等，2004，,/.//mww"o/.172:1355-63。这些受体与流行的观念相一致，该观念为与calcineurin抑制剂不同，雷帕霉素不干扰耐受性诱导。因此，雷帕霉素适用于本发明的方法中，其中Treg扩增是所需的。在另一个实施方案中，该方法进一步包括给予含有展示TGF-P的外源细胞(例如，同种异体或异种)的組合物。例如，可以修饰外源细胞如脾细胞、用抗原脉冲的树突细胞、骨髄细胞、造血千细胞、实体器官和胰岛细胞来展示TGF-P。在该实施方案的一个特定方面中，还将雷帕霉素给药于患者。在一个实施方案中，通过以下的方法获得修饰的外源细胞，该方法包括(a)将外源细胞接触包括结合对的第一个成员和结合细胞表面的分子的双功能分子来形成修饰的外源细胞和(b)将修饰的外源细胞接触包括TGF-卩和第二个结合对成员的缀合物，来形成展示TGF-p的外源细胞。TGF-卩可以是全长TGF-p或其任何活性片段，如上所述。设计双功能分子，使得双功能分子通过双功能分子的细胞表面结合部分结合细胞表面后，结合对的第一个成员基本上保持其对于第二个结合对成员的亲和性。当双功能分子包括生物素时，可以通过以下举例说明的方法或通过其他方法(如WO02/02751中所述的那些)将其定位于细胞表面。在一个特定的实施方案中，双功能分子是可以在体内缀合细胞表面上的蛋白质的生物素形式，如NHS-生物素，包括磺基-NHS-LC-生物素。在双功能分子包括生物素的实施方案中，结合对的第二个成员包括抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白(或其上述的任意变体，包括核心链霉抗生物素蛋白)。本发明还提供了扩增Treg细胞的方法，使用已经evvivo修饰来展示TGF-p的抗原脉冲过的DC。根据本发明的这个方面，用一个或多个抗原如一个或多个自体抗原来脉冲DC,然后离体修饰来展示TGF-卩，如上所述。在一个实施方案中，用一个或多个致糖尿病自体抗原如GAD、胰岛细胞自体抗原(ICA)或自体抗原NRP-A7来脉沖DC。在一个特定的实施方案中，用GAD65、ICA512和NRP-A7中的每一个来脉沖DC。或者，用胰岛裂解物脉沖未成熟的DC。在另一个实施方案中，用胶原来脉沖DC(例如，用于治疗关节炎)。在另一个实施方案中，用髓磷脂碱性蛋白来脉沖DC(例如，用于治疗多发性硬化)。获得展示TGF-卩的脉沖DC的方法的一个实施方案包括(a)用抗原脉沖未成熟的树突细胞，来获得脉沖过的树突细胞；(b)将脉沖的树突细胞接触包括结合对的第一个成员和结合细胞表面的分子的双功能分子来形成修饰的脉冲树突细胞；和(c)将修饰的脉沖树突细胞接触包括TGF-卩和第二个结合对成员的缀合物来形成展示TGF-P的脉冲树突细胞。TGF-P可以是全长TGF-卩或其任意的活性片段，如上所述。在一个特定的实施方案中，双功能分子包括磺基-NHS-LC-生物素。在双功能分子包括生物素的实施方案中，第二个结合对成员包括抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白(或其上迷的任意变体，包括核心链霉抗生物素蛋白)。在一个实施方案中，通过本领域已知的方法驱使脉冲过的DC成熟。例如，可以通过用4-1BBL赙育来驱使脉沖过的DC成熟。根据本发明的这个方面，可以将脉冲过的、展示TGF-卩的DC给予需要Treg扩增的患者，如上述的那些目标患者。可以通过上述的任何途径来给予DC，如通过静脉内给药。可以通过实验来测定DC的最佳剂量，如下文中所述的。之前在NOD小鼠中使用脉沖DC的研究表明5x05细胞/动物和2x105细胞/动物在诱导Treg扩增中是有效的。本发明还包括将脉沖过的、展示TGF-卩的DC结合一种或多种上迷共刺激缀合物和/或结合雷帕霉素来给药的方法。因此，例如，可以将脉沖过的、展示TGF-P的DC结合包括4-lBBL、CD80和/或IL-2或上述任何其他共刺激部分给药于患者。另外地或可替换地，可以将雷帕霉素给药于患者。根据这些实施方案，可以与DC基本上同时，或在DC之前或之后，给药一种或多种缀合物和/或雷帕霉素。在本发明的一个实施方案中，使用包括4-lBBL和/或CD80、IL-2的缀合物和任选的TGF-(3来获得非特异性的Treg扩增。在另一个实施方案中，使用包括4-1BBL和/或CD80和IL-2的缀合物，结合用相关抗原脉沖并用TGF-卩修饰的外源胰岛或器官或树突细胞，在暂时使用雷帕霉素的掩饰下，获得抗原特异性的Treg扩增。本发明还提供了扩增Treg细胞的方法，以上述对于脉冲DC的相同方式，使用TGF-卩修饰的造血干细胞或骨髓细胞(BMC)，包括外源(例如，同种异体或异种)BMC。该方法可用于建立混合的嵌合体，例如，用于诱导对自体抗原、同种抗原和异种抗原的耐受性，和治疗自体免疫力和造血遗传缺陷。可以单独使用该方法，或结合上述的共刺激缀合物和/或结合雷帕霉素，如上所述。使用造血干细胞或BMC不仅扩增Treg细胞，而且将尽力混合的嵌合体，该嵌合体将控制自体免疫力并允许胰腺|3细胞再生，使得预防和/或治疗糖尿病。结合缀合物使用TGF-卩修饰的造血干细胞或外源BMC将扩增Treg细胞，其随后将使得预防千细胞或BMC的排斥和建立控制自体反应性和同种反应性的混合嵌合体。根据本发明的这个实施方案，将造血干细胞或BMC生物素化并用TGF-P-CSA修饰，如上所述，并在雷帕霉素掩饰下静脉内注射。可以结合给药如上制得的一种或多种共刺激缀合物(包括CD80/IL-2和/或4-lBBL/IL-2缀合物)来实现这种处理，以便扩增致耐受性作用。用未修饰的或TGF-P-修饰的造血干细胞或BMC和雷帕霉素的处理将扩增Treg细胞，使得预防糖尿病。如上所述，TGF-P和雷帕霉素可以协同作用来阻断自体抗原特异性Teff细胞的激活和扩增，同时促进Treg细胞的激活和扩增或其从CD4+CD25T细胞的转化。一种或多种共刺激缀合物的任选使用可以进一步扩增该作用。以下实施例更详细地说明了本发明，并且不在任何方面来限制本发明的范围。实施例一般方法动錄非糖尿病小鼠(NOB)购自JacksonLaboraories(BarHarbor,Maine)并依据NIH和Guidelines来饲养。BALB/c和C57BL/6小鼠购自JacksonLaboratory(BarHarbor,ME),在路易斯维尔大学在SPF条件下詞养并根据学会和NIH指导来护理。/《^7^^^3《婉4^3和趟^仏-2和4-/^9L、CD卵和TGF-々炎合资^:可以使用果蝇DES表达系统(lnvitrogen;Carlsbad,CA)来建立表达这些分子的稳定转染子，如Singh等，2003，Ca"cw63:4067-73中所迷的。在设定为25'C和105rpm的培养振荡器中，在补充ImM疏酸铜的果蝇无血清培养基(Gibco;Carlsbad,CA)将转染子孵育72小时，用于重组蛋白表达。通过离心收集培养物上清液并接受大规模纯化，使用钴(II)-羧曱基天冬氨酸盐交联的琼脂糖固定的金属亲和性树脂(BD-Talon，BDBiosciences)或Ni-NTA金属亲和性树脂(Qiagen),利用工程化至蛋白质中的6x-His-标记物。简而言之，通过逐滴加入95°/。乙醇产生10%乙醇的终浓度，以沉淀含有重組蛋白的培养基。在4。C孵育过夜后，将沉淀的蛋白重新溶解于1/10起始体积的结合緩沖液中(50mM磷酸钠pH7.0;500mM氯化钠；0.5%吐温-20;1%甘油；5mM2-巯基乙醇)。使用5x凝胶床体积的结合緩沖液来平衡金属亲和性树脂，加入重新溶解的蛋白溶液中，并在室温用颠倒旋转孵育45分钟。用50-100ml洗涂緩沖液(50mM磷酸钠pH7.0;500mM氯化钠)将结合蛋白质的金属亲和性树脂洗涤2x。使用2x凝胶床体积的洗脱緩沖液(50mM磷酸钠pH7.0;500mM氯化钠；150mM咪唑)从金属亲和性树脂洗脱结合的蛋白质。合并纯化的蛋白洗脱液并装栽于AmiconUltraTM(Millipore;Bedford,Mass)离心过滤装置中，使用30kD分子量截留膜。将离心过滤装置在3000rpm(2000xg)4'C离心15分钟。将无菌PBS加入截留物中并将滤器在3000rpm(2000xg)再次离心。从离心过滤装置中吸出含有浓缩/脱盐蛋白的截留物，置于无菌的低溫瓶中，并储存在液氮中。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定分离蛋白的浓度。根据制造商的说明(Pierce)使用BCA蛋白测试来测定蛋白质浓度。时43和趁^:收集NOD的胰岛并立即在4M硫氰酸胍中均质。按照之前所述的分离总RNA,参见，例如，Shiwan等，1993，《/.//wmmo/.150:2295-304。将纯化的RNA溶解于二乙基焦碳酸盐处理的水中，分配成小的等份，并在使用前存储在-70。C。将该RNA的一部分用作RT-PCR的模板，使用鼠GAD编码序列特异性的引物。参见，例如，Lee等,1993,5ioc/i//n.5/0/7/ip.1216:157-60。将PCR产物克隆至TA克隆栽体中(Invitrogen)。鉴定功能性克隆并用于亚克隆至用于表达的载体中pAC(Avidity)。细菌转化并在氨苄青霉素培养基上选择后，将几个克隆接受最小质粒制备并用合适的限制酶消化来鉴定阳性克隆。将带有插入片段的克隆用于大的质粒制备。将质粒用于转化AVB100大肠杆菌，该菌林具有稳定整合至染色体中的6/M连接酶基因。用L-阿拉伯糖诱导蛋白表达，用于带有生物素标记物的GAD的高水平表达。使用蛋白质印迹和用作探针的碱性磷酸酶缀合物的链霉抗生物素蛋白测定纯化GAD的浓度、内毒素水平和生物素化。如果需要，使用来自Pierce的Detoxi-凝胶内毒素去除试剂盒来除去内毒素。将生物素化GAD等分并冷冻于-70'C直至使用。^^源f:通过在PBS中以1:1的摩尔比混合将包括共刺激部分和核心生物链霉素的缀合物结合生物素化的IL-2和/或生物素化的GAD蛋白。以以下所示的剂量静脉内注射PBS中的所有缀合物和DC。;f^濕合时沐S勿應^^。在5天测试中作为应答剂培养来自天然BALB/c小鼠(lxl0V孔)的脾脏和淋巴结细胞，使用照射过的(2000cGy)来自天然C57BL/6小鼠的脾细胞("105/孔)作为刺激剂。以不同的应答剂与Treg的比例将扩增的Treg细胞加入培养物中。在培养的最后16小时中用H、胸腺嘧啶脱氧核苷来脉沖细胞。腐4移控。通过单次静脉内注射200mg/kg链脲霉素(Biomol,PlymouthMeeting,PA)使雄性BALB/c小鼠(22-26g，6-8周大)患有糖尿病，并通过两次〉300mg/dl连续血糖读数来证实糖尿病。在力夷岛移植前一天，通过静脉内注射将5-8><106个离体扩增的Treg细胞转移至每只动物。使用0.2mg/ml的释放酶溶液(Roche)通过胰腺的原位灌输从完全错配的C57BL/6小鼠收集供体胰岛。在37'C消化17分钟后，使用Ficoll梯度纯化胰岛并在完全培养基中37'C维持过夜(补充10%FBS,2mML-谷氨酰胺，100U/ml青霉素/链霉素和50mM2-巯基乙醇的RPMI)。第二天收集胰岛，用PBS洗涤并将400-600个胰岛移植至每个BALB/c移植接受者的左侧肾嚢下。对照动物移植同种异体胰岛，但没有接受Treg细胞。每周监控接受移植的动物三次，并通过两次〉300mg/dl的连续血糖读数来证实排斥。腐4^逸沐S勿應通过首先用0.2mg/ml释放酶(Roche)消化胰腺从NOD动物的胰岛收集渗透淋巴细胞，例如，如Yolcu等，2002，/wwwm(>M7:795-808中所述的。一旦获得单个胰岛，按照之前所述的将它们消化，例如，Green等,2002,/画wm'(y16:183-91中所述的，来获得胰岛渗透淋巴细胞。将后者染色用于流式细胞术分析。^;《勿/^i:首先通过滴定目标一抗和二抗，然后在流式细胞术中使用最佳浓度来进行流式细胞术分析，使用标准程序。参见，例如，Mhoyan等，1997,7>"^//朋^〃0"64:1665-70。同型-配对抗体作为阴性对照。将样品在FACSCalibur或Vantage(BectonDickinson;MountainView,CA)上运行并4吏用FlowJo(TreeSoft)或CellQuest(BDBiosciences)软件进行分冲斤。炎y^^e^t勿應^W應^勿應^f为、浙在流式细胞术分析中使用这些细胞因子特异性的单克隆抗体(PharMingen)进行胞内IL-2、IL-4、1L-10和IFN-y的分析。参见，例如，Elson等，1995，</.^wnw"o/.154:4294-301。在37°C用4%多聚甲醛将细胞固定5分钟，并用PBS/1%BSA洗涤两次。在补充0.1。/。BSA和10。/。FCS的PBS-S緩沖液中(PBS，0.01MHEPES，0.1%皂草苷)在水上孵育过夜来阻断非特异性结合后，用PBS-S緩冲液将细胞洗涤两次并在水上用细胞因子特异性抗体赙育30分钟。用PBS-S緩沖液洗涂两次后，将它们在水上用FITC-缀合的抗小鼠IgG大鼠抗体孵育30分钟，并通过流式细胞术来分析。同型配对的不相关抗体作为阴性对照。根据制造商的实验方案(eBioscience)来进行胞内FoxP3分析。遞i^^4'细/敏^W71勿應为、i^弄浙;C或费。从天然BALB/c小鼠收集脾脏和淋巴结细胞，加工成单细胞悬浮液，并使用ACK溶液来裂解红血球。为了细胞分选，用抗CD4-FITC、抗CD25-PE和抗CD8-APC将细胞染色。使用FACSVantage细胞分选仪(BDBioscience,SanJose,CA)来分选CD4+CD25'单阳性(SP)和CD4+CD25+双阳性(DP)T细胞。分选的细胞为>95%纯。在流式细胞术中使用CD4-APC、CD4-FITC、CD8-PE、CD8-PerCP、4-lBBL-PE、CD25-PE、CD95-F1TC、生物素-CD137、生物素-CD28、生物素-GITR、生物素-TGF-卩和FITC标记的抗生物素蛋白的Abs来测定原初和扩增的Treg细胞的表型。将具有相配荧光染料的同型Abs用作对照。根据制造商的实验方案"Biosciences,SanDiego，CA)进行胞内FoxP3染色。对于受体表达测试，将分选的CD4+CD25+或CD4+CD25-T细胞在96-孔平板中单独，或在IL-2(25U/ml)、照射过的脾细胞(lx105/孔)或两者的存在下培养2天。在培养2天后，收集一部分细胞，用PBS洗涂两次，并分成两个分开的培养物。同时给一个培养物补充IL-2，而另一个保持没有IL-2。培养2天后，用抗4-lBB或CD28的抗体将细胞染色，并使用流式细胞术来分析。在用IL-2和脾细胞培养2天后，收集一组细胞，洗涤两次，并未处理再培养2天。在另一组细胞中，在第2天加入IL-2并再培养2天。用抗4-lBB或CD28的抗体将细胞染色，并使用流式细胞术来分析。Fo;c尸3W/r-尸C尺。使用TRI试剂从原初BALB/c小鼠的脾脏和淋巴结新鲜分选的CD4+CD25-和CD4+CD25+T细胞或扩增的Treg细胞分离总RNA。使用两pgRNA来产生第一链cDNA,并进行PCR扩增，使用FoxP3和HPRT特异性引物，各自进行33和27个循环。引物序列为FoxP3正向5，-CAGCTGCCTACAGTGCCCCTAG-3'FoxP3负向5，-CATTTGCCAGCAGTGGGTAG-3'HPRT正向5，-GAAGTGTTGGATACAGCCCAGAC-3'HPRT负向5，-GAGGGTAGGCTGGCATCTAGGCT-3，逸欢病理夢评价胰岛的自体免疫的组织学信号及其分泌胰岛素的能力。在处理后的不同时间点从处理过的和对照NOD动物取出胰岛。用10%緩沖的福尔马林固定每个胰岛片，包埋于石蜡中，并以4pM切片，并用苏木精和曙红(H&E)染色来测定一般的生理改变。按照之前所述的进行细胞因子、T细胞和胰岛素的免疫组织化学。参见，例如，Green等，2002，/w/wwm(y16:183-91。DCW^务并^7放潜尿病戎/^脉/，使用GM-CSF和IL-4在来自NOD的骨髓(BM)细胞的培养物中产生未成熟的细胞4-5天。用GAD65、ICA512和NRP-A7肽的混合物(30pg/肽/ml)将细胞脉沖并用100ng/ml小鼠CSA-4-1BBL缀合物或CD40L驱使分化过夜。从GenScriptCorporation购得肽。将细胞彻底洗涤并用TGF-卩修饰(或核心链霉抗生物素蛋白作为对照蛋白)，按照上述和下文中详述的方法。在一些实施方案中，将NODAPC与各种浓度的彻底渗析的NP40裂解物共培养，从用作自体抗原来源的NOD胰岛制备该裂解物。用PBS洗涂后，在流式细胞术中分析一部分细胞，用于在免疫调节之前，在细胞表面上展示TGF-j3，II类上调和CD80/CD86共刺激分子。4细應^面丄W/^^:用水冷PBS洗涤DC并以2.5x106细胞/ml在含有5pMEZ-LinkTM磺基-NHS-LC-生物素(Pierce)的pH8.0的PBS中室温孵育20分钟。将细胞彻底洗涤并以lxl(^细胞/ml在4。C孵育15分钟，使用50-100ng纯化的TGF-p-核心链霉抗生物素蛋白缀合物(或核心链霉抗生物素蛋白作为对照)。用PBS彻底洗涤后，将细胞处理用于流式细胞术分析并用于进一步的研究，如下所述。婉^，使用Kaplan-Meier曲线估算治疗对1型糖尿病预防的作用。使用对数级检验(概括的Savage/MantelCox)测定不同组之间的存活差异。涉及比较来自单个动物组数据的程序首先具有使用F检验(两組)或Levent，s检验(多组)检测到的相等差异。当差异不相等时，进行log转化。当比较正常分布的样品平均值时，使用Student's检验(两组)或Newman-Keuls检验(多组)。当数椐没有正常分布时，使用Mann-WhitneyU检验(两组)或Kruskal-Wallis检验(多组)。统计学显著性定义为p<0，05。实施例l:CSA-4-lBBL缀合物的克隆和表达使用TRI试剂(MolecularResearchCenter,Cincinnati,OH)，从用LPS(5pg/ml)剌激2天的小鼠脾细胞中分离总RNA。将两微克该RNA用于产生第一链cDNA，将其用作PCR的模板来扩增4-1BBL的胞外结构域(aa104-309),使用正义(5，-ATCGAATTCCGCACCGAGCC丁CGGCCAGCG-3，)和反义(5，-GGACTCGAGCATAGCAGCTTGAGGACTTAGC-3，)引物。将引物工程化来包括￡coRI和A7wl位点来促进定向和框内克隆至DES表达栽体中(Invitrogen，SanDiego,CA)。将PCR产物克隆至PCR2.1TOPO栽体中并将几个阳性克隆接受DNA测序。用EcoRI和A7zo1消化含有正确4-1BBL序列的单个克隆并亚克隆至含有6xHis标记物和核心链霉抗生物素蛋白(CSA)的pMT/BiP/V5-His表达载体中，使得小鼠4-1BBL的胞外结构域在C-端克隆至CSA的生物素-结合和四聚体形成结构域。图8A,在金属可诱导表达栽体中，使用果蝇的分泌信号将嵌合基因框内亚克隆，并使用果蝇DES表达系统在S2昆虫细胞中表达CSA-4-1BBL缀合物，使用琼脂糖柱纯化，并使用鲎阿米巴样细胞裂解物试剂盒(CharlesRiver)测试内毒素。CSA-4-BBL缀合物作为四聚体和更高阶结构存在，如在天然条件下通过PAGE测定的。只在变性条件下将四聚/寡聚结构解离成37kDa单体，并通过SDS-PAGE分级。图8B显示了变性(泳道2)和天然(泳道3)条件下纯化CSA-4-1BBL的蛋白质印迹分析。在变性条件下，CSA-4-1BBL作为37kDa的单体出现，而在天然条件下，蛋白质作为四聚体和H50kDa的高阶结构出现。如下测定了CSA-4-1BBL与4-1BB受体的结合。在总的混合的淋巴细胞反应(MLR)培养基(补充5%FBS、2mML-谷氨酰胺、100U/ml青霉素/链霉素、10mMHEPES和100mMMEM-丙酮酸钠的DMEM)(Invitrogen,Carlsbad,CA)和50mM2-巯基乙醇(SIGMA,St.Louis.MO)中用5pg/mlConA(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)刺激来自BALB/c或C57BL/6小鼠的脾细胞48小时。然后用CSA-4國BBL缀合物(200ng/lxl()6细胞)或等摩尔量的CSA对照蛋白(76ng/lxl06细胞)在旋转振荡器上将激活的和/或静息细胞4'C孵育30分钟。孵育后，用PBS将细胞洗涤几次，用抗CD4(APC)、CD8(PerCP)、4-lBBL(PE)和SA(FITC)的抗体染色，并通过流式细胞术分析。将静息和CSA-孵育的细胞用作阴性对照。对于阻断测试，还用过量(50ng/lx06细胞)的抗4-1BB抗体(3H3，由Emery大学的R,Mittler友情提供，CA)将一百万个激活的细胞孵育30分钟。然后用PBS将细胞洗涂几次，然后用200ng嵌合4-lBBL(CSA-4-1BBL)再孵育30分钟。然后用PBS洗涂细胞并用抗CD4-APC、CD8-PerCP、4-1BBL-PE和CSA-FITC的抗体染色，并通过流式细胞术分析。将静息和CSA-孵育的细胞用作阴性对照。用4-1BBL(200ng/lxl()6细胞)或对照CSA蛋白(76一><106细胞)将来自BALS/c小鼠的静息或ConA激活的脾细胞在4'C孵育30分钟。使用抗小鼠4-lBBL的抗体检测CD4+和CD8+T细胞上的4-1BBL结合(黑线)。用CSA蛋白孵育的细胞用作对照(灰色填充的)。如图8C中所示的，CSA-4-BBL结合表达4-lBB受体的激活CD8+和CD4+T细胞。这种结合对于4-lBB是特异性的，因为天然T细胞缺乏受体分选阴性，此外，首先用抗4-lBB抗体阻断受体导致失去了结合(图8C，右图)。为了测试4-lBBL是否是功能性的，在各种浓度(图8D中以ng/ml来显示)的可溶性CSA-4-lBBL缀合物或对照CSA蛋白的存在下，用次佳浓度的抗-CD3抗体将从天然BALB/c的脾脏和淋巴结純化的总CD4+T细胞刺激4天。图8D。用。3八-4-881^缀合物的共刺激在004+T细胞中产生了强有力的增殖应答，这是浓度依赖性的并且在统计学上是显著的(p<0.05)。增殖应答是4-1BBL依赖性的，因为在等摩尔水平使用的CSA蛋白没有在测量上增加由次佳剂量的抗-CD3抗体获得的应答。总而言之，这些结果了CSA-4-1BBL缀合物具有核心链霉抗生物素蛋白的结构特征，因为其形成了四聚体和寡聚体，结合激活的T细胞上的4-1BB,并在次佳抗-CD3抗体刺激下作为T细胞的有效激活剂。实施例2:使用CSA-4-BBL缀合物的Treg扩增使用焚光激活的细胞分选(FACS)从BALB/c小鼠的脾脏中分选出CD4+CD25+Treg细胞(图9A),并在同源APC存在下，用抗-CD3抗体(0.5ng/ml)、CSA-4-BBL(l^ig/ml)和IL-2(25IU/ml)激活。然后将细胞以lxi(^细胞/ml来维持，每3天使用补充IL-2的培养基，持续10-12天。然后将培养物接受另一轮的激活，接着用IL-2维持。如图9中所示的，该方案使得Treg细胞在18-24天内Treg细胞扩增55至110倍，在25天内扩增110倍(图9B)。在相同条件下但没有CSA-4-1BBL缀合物维持的Treg细胞只得到了最小扩增。扩增的Treg细胞形成了由CD4+CD25*细胞构成的同种群(图9A，右下图)，该细胞表达高水平的FoxP3蛋白(通过RT-PCR或抗FoxP3抗体测定的)以及Fas、CD62L、GITR、CD25、CD28和细胞表面TGF-卩(数据未显示)，并抑制异源应答以及使用抗CD3刺激的T细胞的多克隆激活(数据未显示)。相反，没有用4-1BBL的培养物只显示出DP细胞数量的2.5倍扩增，并显示出由CD4+CD25"*细胞和CD4+CD25*细胞构成的异种群(图9A，右上图)。与扩增的CD4""SP细胞不同，Treg细胞表达高水平的4-lBB。图10(黑色填充的群未同型对照)。实施例3:扩增的Treg细胞延长胰乌同种异体移植的存活为了测试多克隆扩增到的Treg细胞的治疗效果，将化学诱导的(用链脲霉素)糖尿病BALS/c小鼠获得性转移5-1(^106个如上所迷的在培养物中扩增的Treg细胞，持续20-25天，然后在24小时后，给予完全错配的C57BL/6同种异体胰岛的移植。监控动物的血糖水平，每周三次。所有Treg处理的动物(o)具有延长的存活(MST=68.7±10天)，在观察阶段的85天内，超过1/3(66%)没有排斥移植物。图11。明显相反，所有没有用Treg细胞治疗的对照动物()强烈排斥移植物(MST=16.6±2.7天)。实施例4:扩增的CD4+CD25+Treg细胞是抑制性的在传统的抑制测试中使用CD3刺激来表征扩增的Treg细胞的功能。与天然Treg细胞相似，在应答CD3刺激中保持无变应性的扩增的Treg细胞能够抑制CD4+Teff细胞的多克隆增殖，并且这种抑制功能应当受到4-1BBL的抑制(图12A)。使用混合淋巴细胞反应提供了如上所述的根据本发明扩增的Treg细胞的抑制功能的更多证椐。将天然BALS/c小鼠的脾脏和外周淋巴结细胞用作应答剂，而将来自天然C57BL/6小鼠的照射过的脾细胞用作刺激剂。存在显著的(p<0,05)由扩增的Treg细胞引起的异体抗原驱使的Teff增殖的有效抑制，即使在10:1应答剂比Treg的比例(图12B)。这表明了扩增的Treg细胞赋予了属于天然产生的Treg细胞的传统抑制总而言之，这些数据证明了用CSA-4-1BBL缀合物扩增的Treg功能实施例5A.4-lBBL和IL-2对于Treg细胞的协同作用在0.5ng/ml抗-CD3抗体的存在下，将分选的天然DP细胞与照射过的同源脾细胞共培养3天。给培养物补充25U/mlIL-2、lpg/mlCSA-4-1BBL或两者的混合物。给Treg培养物加入IL-2或4-lBBL足以诱导Treg细胞(DP)增殖；然而，与补充Ipg/ml4-lBBL的那些相比较，在补充25U/mlIL-2的培养物中，存在4倍的增殖提高。图13A。结合使用4-lBBL和IL-2产生了最大的增殖应答(超过单独的IL-2两倍；图13A),表明这两个蛋白协同作用来促进Treg细胞的增殖。还检测了没有APC的培养物系统中信号1、2和3各自对Treg增殖的单独贡献。在该测试中，通过可溶性抗-CD3抗体来提供信号1，通过4-lBBL提供信号2,通过IL-2提供信号3。单独使用分选的天然DP细胞，没有使用照射过的脾细胞，并给培养物补充抗-CD3抗体、CSA-4-1BBL和/或IL-2。如图13B中所示的和表1中所概括的，剌激单独的信号1或2在诱导Treg细胞增殖中是无效的，而刺激信号3导致适度的扩增。刺激信号l和2两者也具有最小的Treg扩增效果。然而，剌激信号1或2结合通过IL-2的信号3刺激具有显著的增殖效果，当所有三个信号得到刺激时，观察到对Treg增殖的最剧烈的效果(2-3周内达到110-倍扩增)。扩增的Treg细胞全部是CD25亮并表达高水平的CD28、4-lBB、GITR、Fas、CD62L、膜结合TGF-p和FoxP3，与没有用4-lBBL扩增的DP细胞相比4交。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>这些结果表明在刺激信号1、2和3对Treg细胞增殖的效果中存在等级制度。单独刺激信号1或2实际上不具有效果，而单独刺激信号3(通过IL-2)或除了信号1和/或2以外刺激信号3具有显著的效果。刺激所有三个信号具有最显著的效果，接着是信号2和3的刺激，然后是1和3。B.IL-2上调CD4+CD25+Treg细胞上的4-1BB受体的表达在IL-2和/或照射过的APC的存在或不存在下，将分选的CD4+CD25+(DP)Treg和CD4+CD25'(SP)Treg细胞培养2天。然后收集细胞，并在流式细胞术中分析4-1BB的表达。只有22。/。新鲜分选的Treg细胞表达了4-1BB,而没有一个分选的Teff细胞对该受体是阳性的。当细胞单独培养2天时，4-1BB的表达下调至背景水平(2%)。在照射过的APC的存在下培养Treg细胞对维持Treg细胞上的4-1BB的组成型表达具有最小的作用(8%)。明显相反的是，将IL-2加入Treg细胞的培养物中不仅导致4-1BB受体的维持，而且介导上调(新鲜细胞的29%vs22%)。照射过的APC的加入进一步提高了IL-2对4-lBB表达上调的作用(53%)。为了进一步探测IL-2在维持/上调Treg细胞上的4-1BB中的作用，将APC加IL-2存在下培养的细胞彻底洗涤，并在IL-2不存在下重新培养2天(图13C，上图中的最后一个柱状)。所有Treg细胞将4-lBB表达下调至背景水平。4-1BB表达通过IL-2的调节是Treg细胞特异性的，因为相似的处理在Teff细胞上的4-1BB表达模式的改变中是无效的(图UC，下图)。这些结果对我们的只是而言是第一次证明了IL-2维持/上调Treg细胞上的4-1BB表达，并提供了观察IL-2和4-1BBL之间对Treg细胞离体增殖的协同作用的机理基础。实施例6:功能性TGF-p-CSA級合物的构建按照上述的一般方法产生了包括CSA和TGF-卩活性形式的缀合物。当用于MLR测试中(图14)或用抗CD3多克隆激活(数据未显示)时，TGF-P-CSA缀合物对T细胞的增殖显示出有效的抑制活性。这些数据证明了TGF-P-CSA是有活性的，并且可以用来阻断抗原特异性增殖，并因此在体外和体内的Treg细胞扩增中是有用的。实施例7:用4-lBBL、CD80&IL-2的非选摔性Treg扩増如上所迷，理解NOD小鼠中糖尿病的产生涉及控制致病的Teff细胞的Treg细胞的功能的破坏。与糖尿病抗性抹相比，NOD小鼠在外周具有较少数量的Treg细胞，并随着年龄显示出Treg细胞数量和功能的下降，这与糖尿病的发作相关。尽管引起这种情况的确切机理还是未知的，APC调节Treg细胞的产生和维持的能力的缺乏可能起着作用。与这种论点相一致的是以下的观察结果(i)NOD中的DC显示出降低的共刺激分子如CD80的表达，这些共刺激分子对于Treg细胞的产生和功能是重要的，和(ii)各种对NOD小鼠中糖尿病的发病率具有保护作用的生物物质如蠕虫和病毒可能通过DC的调节诱导Treg细胞。该实施例说明了使用包括CD80和/或4-1BBL和IL-2的缀合物在NOD小鼠中选择性地扩增Treg细胞，并显示了该方法对于保护NOD中的1型糖尿病的功效。缀合物将优先结合Treg细胞并以治疗方式来扩增它们。可以将NOD中的糖尿病阶段粗略地分为胰岛炎前(1-3周)、胰岛炎(4-8周)、前驱糖尿病(8-24周)和糖尿病(>28周)。这些阶段根据圏养动物的结构而不同。选择前驱糖尿病的雌性NOD小鼠，因为这些动物将具有充分发展的自体免疫力以及预期的Treg细胞和APC不足，预防这些动物中的糖尿病将具有临床结果。为了在体内扩增Treg细胞，以各种组合、频率和剂量，给动物静脉内注射包括CD80和IL-2或4-1BBL和IL-2的缀合物。核心链霉抗生物素蛋白(CSA)/IL-2缀合物将用作对照。通过在使用前将CSA-CD80或CSA-4-1BBL缀合物与生物素化的IL-2以1:1的摩尔比混合来制备缀合物。使用CD28的超兴奋(s叩eragonistic)抗体，发现在注射后3天产生峰值Treg扩增应答。因此，每3天给动物注射缀合物并就在下一次缀合物注射之前放血，来测定Treg扩增的水平。在流式细胞术中使用抗CD4和FoxP3的抗体进行定型。一旦从该血液分析测定了峰值Treg细胞扩增的时间，将动物牺牲，用于收集外周淋巴结，包括胰腺淋巴结、脾脏和胰腺。将脾脏和淋巴结以及从每只动物的胰岛收集的GIL处理成单细胞悬浮液，并使用各种细胞表面CD4、CD8、4-1BB、CD62L、TGF-卩、CD25和胞内FoxP3、IL-10和IFN-y标记通过流式细胞术来定型，以具有T细胞状态的综合观察。如在此所述的前驱糖尿病的NOD小鼠的处理将快速扩增Treg细胞而超过Teff细胞。预期通过CD80、4-lBBL和IL-2共刺激和存活信号的提供导致Treg细胞的快速扩增。通过DC的激活可以进一步加强这种效果，这可以归功于Treg细胞功能的扩增和/或恢复。所得到的扩增可以是全身的，或Treg细胞可以优选回到胰腺淋巴结和胰腺，用于保护性应答。扩增的Treg细胞将表达所有典型的Treg细胞标记，如细胞表面TGF-卩、CD25、4-1BB和胞内IL-IO。实施例8:通过非选择性Treg扩增预防1型糖尿病如下证明了前驱糖尿病的NOD动物中Treg扩增来预防或延迟1型糖尿病发作的能力。用包括CD80和IL-2或4-1BBL和IL-2的缀合物处理前驱糖尿病的NOD(12周大)动物，如上所述，并在允许Treg细胞强烈扩增的条件下处理，如以上的研究所测定的。监控动物的糖尿病发展，持续25周(到该时间为止，我们群体中超过85%的未操纵的雌性产生了糖尿病)。认为两次连续每日测量血糖水平超过250mg/dl是糖尿病的证实。将28周时处理失败的动物以及没有产生糖尿病的那些牺牲，并收集各种组织，用于Treg表型测定以及免疫组织化学，以测定疾病的状态(无vs.胰岛炎前vs.胰岛炎)。留下未处理或用CSA-IL-2缀合物处理的动物将作为糖尿病发病率的对照。根椐本发明，前驱糖尿病动物中的Treg细胞扩增将防止糖尿病的产生。持续的预防效果可能需要使用缀合物的周期性治疗，以维持高比例的Treg比自体免疫Teff细胞。长期非糖尿病动物可以完全没有疾病或可能带有没有临床呈现的前胰岛炎。预期患病的动物具有降低数量的Treg细胞，表达较低量的膜TGF-卩和分泌的IL-10。这些动物可能还含有大量分泌IFN-y的CD4+和CD8+Teff细胞。实施例9:使用4-lBBL&自体抗原的选择性Treg扩增尽管Treg细胞能够以抗原非特异性方式来抑制免疫应答，但抗原驱使的Treg细胞的激活和扩增就特异性和提高的功效而言可以给予很多优势。该实施例说明了自体抗原特异性Treg细胞的选择性扩增，使用包括4-lBBL和自体抗原GAD的缀合物，结合包括CD80和IL-2以及TGF-(3和IL-2的缀合物，用于将自体抗原有效地传送至DC。还使用了雷帕霉素来提高功效。如上所述，DC组成型地表达4-1BB，并且通过4-lBBL/GAD缀合物结合的通过该受体的信号将导致DC的激活，共刺激分子的上调以及有效T细胞应答需要的各种细胞因子的合成和分泌。此外，CD80和IL-2将优先扩增Treg细胞，其组成型地表达CD28和CD25。同时，使用TGF-卩和IL-2将阻断Teff细胞的功能和扩增，并提高Treg细胞的功能和扩增。雷帕霉素将通过阻断Teff细胞的增殖并促进其凋亡来增大TGF-卩的作用，而对Treg细胞的扩增没有主要的影响。因此，在TGF-卩和雷帕霉素的存在下，自体抗原的识别将选择性地阻断Teff细胞的激活和功能，同时促进抗原特异性Treg细胞的产生和扩增，而4-1BBL将激活DC,用于持续的Treg应答。以各种组合、频率和剂量，给十二周龄的前驱糖尿病动物给药(通过静脉内注射)包括4-1BBL和GAD、CD80和IL-2,以及TGF-卩和IL-2的缀合物。通过将CSA-4-lBBL缀合物与生物素化的GAD混合(如上述所制备的)或如上所述通过将CSA-CD80或TGF-P-CSA缀合物与生物素化的IL-2混合来制备缀合物。在用缀合物治疗的整个持续期间，每天通过腹膜内给予1.5mg/kg剂量的雷帕霉素。在流式细胞术中使用CD4和FoxP3的抗体监控动物血液中Treg细胞的峰值扩增。一旦测定到峰值Treg应答的时间，使动物安乐死，用于收集外周淋巴结，包括胰腺淋巴结，脾脏和胰腺，并按照以上实施例7中所述的，对各种细胞表面和胞内标记进行多参数定型。留下未处理或用各种缀合物组合处理的NOD接受者将用作对照。之前，测定了对于Treg细胞扩增最有效的条件，将它们用于处理另一组动物，用于预防糖尿病。预期用全部四个缀合物(4-1BBL/GAD;4-1BBL/IL-2;CD80/IL-2;丁GF-卩/IL-2)和雷帕霉素的联合治疗是用于抗原特异性的Treg细胞扩增和预防前驱糖尿病动物的糖尿病的有效方案。4-1BBL/GAD缀合物将GAD自体抗原传送至DC，导致蛋白质加工，DC的激活并将GAD递呈至Treg细胞以及致病的Teff细胞。TGF-卩和雷帕霉素将协同作用来阻断自体抗原特异性Teff细胞的激活和扩增，同时促进通过CD80/IL-2以及4-1BBL/IL-2和/或4-1BBL/GAD缀合物的Treg细胞的激活和扩增。TGF-卩和雷帕霉素还将通过诱导FoxP3表达而促进CD4+CD25-原初T细胞转化成Treg细胞。在用TGF-卩或雷帕霉素中至少之一处理的组中将获得自体抗原特异性Treg细胞的特异性扩增，因为这两种物质优先阻断Teff细胞增殖，而对Treg细胞的扩增没有明显的影响。Treg细胞的扩增与糖尿病的预防相关。使用缀合物的周期性重复治疗对于维持Treg集合是有用的。使用另外的自体抗原(例如，包括4-1BBL和其他不同的自体抗原的缀合物)可以通过扩增更宽类别的Treg细胞来提高效果。实施例10:使用修饰的、脉冲的DC选择性扩增Treg细胞该实施例说明了使用DC来扩增Treg细胞，该DC已经用三种致糖尿病自体抗原(GAD、ICA152和NRP-A7)的混合脉冲过，并用TGF-卩修饰过。可以单独使用该方法，或结合上述的共剌激缀合物和/或结合上述的雷帕霉素来使用。使用用三种自体抗原脉沖的DC将引发不同类型的Treg细胞，并且DC上TGF-卩的直接展示不仅限制了任何可能与全身使用可溶性蛋白相关的毒性，而且还将有效地扩增和/或恢复Treg细胞的功能，使得防止NOD中的糖尿病。使用GM-CSF和IL-4从NOD的骨髓产生未成熟的DC，如上所迷。用致糖尿病抗原GAD65、胰岛细胞自体抗原(ICA512)肽和NRP-A7肽的混合物将细胞脉沖。通过用4-1BBL过夜孵育驱使未成熟DC成熟，并通过流式细胞术来表征，使用抗CDllc的抗体和各种成熟标记，如高水平的II类MHC、CD80和CD86分子。将DC生物素化(5pMEZ-LinkSulfo-NHS-LC-Btioin，Pierce)并用TGF-p-CSA(100ng/l(^细胞)修饰，如上所述，并在雷帕霉素的掩饰下，静脉内注射至前驱糖尿病动物中。以不同的剂量静脉内注射DC，开始为5><105细胞/动物。(该剂量的用两个GAD肽和一个hsp60肽脉沖的DC已经显示出能有效降低前驱糖尿病NOD小鼠中的糖尿病发病率)。在相关的实验中，还给予了如上制得的CD80/IL-2和4-1BBL/IL-2缀合物(结合脉冲的、修饰的DC),来增大致耐受性效果。将未修饰的细胞和用CSA修饰的细胞用作对照。如上所述，分析动物的Treg细胞扩增和糖尿病的预防。用未修饰的或TGF-卩修饰的脉沖的DC和雷帕霉素的处理将扩增Treg细胞，使得预防糖尿病。如上所述，TGF-P和雷帕霉素可以协同工作来阻断自体抗原特异性Teff细胞的激活和扩增，同时促进Treg细胞的激活和扩增，或其从CD4+CD25T细胞的转化。任选使用CD80/IL-2和4-1BBL/IL-2缀合物可以进一步扩增这种效果。实施例ll:使用修饰的BMC选择性扩增Treg细胞该实施例说明了使用用TGF-(3修饰的外源(同种异体或异种)骨髓细胞(BMC)来扩增Treg细胞。可以单独使用该方法，或结合上迷的共刺激缀合物和/或结合雷帕霉素，如上所述。使用BMC不仅扩增Treg细胞，而且还建立了混合的嵌合体，这将控制自体免疫力并允许胰岛卩细胞再生，使得预防和/或治疗糖尿病。使用用TGF-卩修饰的外源BMC结合缀合物将扩增Treg细胞，其随后将使得预防BMC排斥并建立混合嵌合体，这将控制自体和异种两种反应性。如上所述将BMC生物素化(5pMEZ-LinkSulfo-NHS-LC-Btioin,Pierce)并用TGF-卩-CSA(100ng/106细胞)修饰，并在雷帕霉素的掩饰下，静脉内注射至前驱糖尿病的动物中。以不同的剂量静脉内注射BMC,开始为5xl05细胞/动物。在相关的实验中，还给予了如上制得的CD80/IL-2和4-1BBL/IL-2缀合物(结合修饰的BMC)，来增大致耐受性效果。将未修饰的细胞和用CSA修饰的细胞用作对照。如上所述，分析动物的Treg细胞扩增和糖尿病的预防。用未修饰的或TGF-p修饰的BMC和雷帕霉素的处理将扩增Treg细胞，使得预防糖尿病。如上所述，TGF-卩和雷帕霉素可以协同工作来阻断自体抗原特异性Teff细胞的激活和扩增，同时促进Treg细胞的激活和扩增，或其从CD4+CD25'T细胞的转化。任选使用CD80/IL-2和4-1BBL/IL-2缀合物可以进一步扩增这种效果。实施例12:嵌合4-lBBL(CSA-4-BBL)抑制Treg细胞的抑制性功能，同时驱使Treg细胞和Teff细胞增殖我们使用嵌合4-1BBL蛋白(CSA-4-BBL)研究了4-1BB信号在Treg功能中的作用。在基于卩H]胸苷引入的共培养实验中，从天然BALB/c小鼠分选的CD4+CD25+双阳性(DP)T细胞显著抑制了由CD3刺激诱导的单阳性(SP)CD4+CD25Teff细胞的增殖性应答(图15A)。通过给培养物补充lpg/ml嵌合4-lBBL(CSA-4-1BBL)有效(p<0.05)且特异性地抑制了这种抑制性作用，但没有使用等摩尔浓度的CSA对照蛋白。为了测试所观察到的由嵌合4-1BBL引起的抑制作用的抑制是否是由于CD4+Teff细胞增殖应答的恢复或诱导的Treg细胞的增殖所引起的，用CFSE(羧基荧光素琥珀酰亚胺酯)将SP细胞标记，并用于共培养实验中(图2B，上图)。与对照相比较(56%),用嵌合4-lBBL共刺激导致提高的CD4+Teff细胞增殖(75%)。将Treg细胞加入培养物中显著降低了CD4+Teff细胞的增殖(30%),这通过4-lBBL得到了部分恢复(62%)。共培养实验中缺乏应答4-lBBL共刺激的CD4+Teff细胞增殖的全部恢复可能是由于Treg细胞与Teff细胞竟争嵌合蛋白和/或其他因子，如IL-2。在平行的实验中，将CFSE标记的DP细胞用于共培养实验中，来测试Treg细胞是否还显示出对4-1BBL刺激的增殖应答(图15B,下图)。当单独培养(44%,与对照的17%相比)或结合SPTeff细胞(58%vs.对照的28。/。)培养时，存在Treg细胞应答4-lBBL的显著增殖。总而言之，这些结果证明了4-lBBL驱使Treg细胞增殖，而抑制其抑制性功能。实施例13:扩增的CD4+CD25+Treg细胞的表型使用流式细胞术将实施例2中扩增的细胞对传统的Treg细胞标记进一步表征。扩增的Treg细胞表达CD25、4-lBB、CD28、GITR、Fas、CD62L和细胞表面TGF-P。重要地，与没用4-1BBL扩增的那些相比较，所有这些标记在4-1BBL扩增的Treg细胞上得到显著上调(图9A和16A)。扩增的Treg细胞还表达了信号转录因子FoxP3，如通过RT-PCR所测定的(图16B),以及胞内信号(图16C)。重要地，与没用4-1BB刺激的Treg细胞相比较，在4-lBBL存在下扩增的Treg细胞具有提高水平的FoxP3蛋白。总而言之，这些数据证明了4-lBBL刺激上调了涉及天然产生Treg细胞的产生/功能的所有细胞表面标记以及FoxP3。*承承承尽管足够详细地描述和举例说明了本发明，用于本领域技术人员来制备和使用，各种替换、改变和改进应当是清楚的，而没有脱离本发明的精神和范围。在此提供的实施例是优选实施方案的表示，并不是打算来限制本发明的范围。本领域技术人员将产生其中的改变和其他用途。这些改变包括在本发明精神内，并由权利要求的范围来限定。对在此公开的本发明形成各种替代和改变而没有脱离本发明的范围和精神是本领域技术人员显而易见的。人员水平的表示。在此引入所有专利和出版物作为参考，至如同每篇单独的出版物特意并单独表示引入作为参考的相同程度。可以在缺少在此未特意公开的任意要素、限制的情况下合适地实施在此说明性描述的本发明。因此，例如，在此的每个情况中，术语"包括"、"基本上包括"和"包含"中的任一个可以由其他两个术语中的任一个来替代。已经使用的术语和表述用作描述而非限制的术语，分的意图，但是认为各种改变:所要求的本发明^围内是可^的。因此，应当理解尽管已经通过优选的实施方案和任选特征特异性地公开了本发明，在此公开的概念的改变和变化依靠本领域的技术人员，并其他实施方案列于以下的示例性实施方案和随后的权利要求内示例性实施方案1.一种组合，包括(A)—个或多个选自以下的缀合物(a)第一缀合物，其包括(i)包括4-lBBL多肽的第一缀合物成员和(ii)包括结合对的第一个成员的第二缀合物成员；(b)第二缀合物，其包括(i)包括CD80多肽的第一缀合物成员和(ii)包括结合对的第一个成员的第二缀合物成员；(c)第三缀合物，其包括(i)包括TGF-p多肽的第一缀合物成员和(ii)包括所述结合对的第一个成员的第二缀合物成员；和(B)—个或多个选自以下的缀合物(a，)第四缀合物，其包括(i)包括抗-CD3抗体的第一缀合物成员和(ii)包括所述结合对的第二个成员的第二缀合物成员；(b，)第五缀合物，其包括(i)包括细胞因子的第一缀合物成员和(ii)包括所述结合对的第二个成员的第二缀合物成员；(c，)第六缀合物，其包括(i)包括抗原的第一缀合物成员和(ii)包括所述结合对的第二个成员的第二缀合物成员；和(d，)第七缀合物，其包括(i)包括抗-CD28抗体的第一缀合物成员和(ii)包括所述结合对的第二个成员的第二缀合物成员。在实施方案1中，细胞因子的选择不受限制。2.实施方案1的组合，其中所迷结合对的所述第一个成员包括抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白，并且所述结合对的所述第二个成员包括生物素。3.实施方案1的组合，其中所迷结合对的所述第一个成员包括核心生物素。4.实施方案1的组合，其中所迷第一、第二或第三缀合物中的至少一个包括融合多肽，该融合多肽包括所述第一缀合物成员和所迷第二缀合物成员。5.实施方案1的组合，其中所述细胞因子选自IL-2、IL-4或IL-7。6.实施方案1的组合，其中所迷抗原是自体抗原。7.实施方案1的组合，其中所述抗原选自胰岛素、胶原、髓磷脂碱性蛋白和MHC/抗原复合物。8.实施方案1的组合，其中所述抗原选自谷氨酸脱氢酶(GAD)、胰岛细胞自体抗原(ICA)和自体抗原帖NRP-A7。9.实施方案1的组合，其中在分开的组合物中提供所述缀合物。10.实施方案6的组合，其中所述分开组合物中的至少一种进一步包括药物学上可接受的栽体、赋形剂或稀释剂。11.实施方案1的组合，其中在单个组合物中提供所述缀合物。12.实施方案8的组合，其中所述单个组合物进一步包括药物学上可接受的栽体、赋形剂或稀释剂。13.实施方案8的组合，其中所述第一、第二或第三缀合物中的至少一个通过所述结合对的所述第一个和第二个成员之间的结合与所述第四、第五、第六或第七缀合物中的至少一个结合。14.扩增Treg细胞的方法，所迷方法包括将Treg细胞群体接触(A)—个或多个选自以下的缀合物(a)第一缀合物，其包括(i)包括4-lBBL多肽的第一缀合物成员和(ii)包括结合对的第一个成员的第二缀合物成员；(b)第二缀合物，其包括(i)包括CD80多肽的第一缀合物成员和(ii)包括结合对的第一个成员的第二缀合物成员；(c)第三缀合物，其包括(i)包括TGF-卩多肽的第一缀合物成员和(ii)包括所述结合对的第一个成员的第二缀合物成员；和(B)—个或多个选自以下的缀合物(a，)第四缀合物，其包括(i)包括抗-CD3抗体的第一缀合物成员和(ii)包括所述结合对的第二个成员的笫二缀合物成员；(b，)第五缀合物，其包括(i)包括细胞因子的第一缀合物成员和(ii)包括所述结合对的第二个成员的第二缀合物成员；(c，)第六缀合物，其包括(i)包括抗原的第一缀合物成员和(ii)包括所述结合对的第二个成员的第二缀合物成员；和(d，)第七缀合物，其包括(i)包括抗-CD28抗体的第一缀合物成员和(ii)包括所述结合对的第二个成员的第二缀合物成员。15.实施方案14的方法，其中所述Treg细胞包括所述第一、第二或第三缀合物中至少一个的受体，并且其中所迷第一、第二或第三缀合物中的至少一个通过所述第一缀合物成员和所述受体之间的结合与所述Treg细胞缀合，并且所述第四、第五、第六和第七缀合物中的至少一个通过所述第一个和第二个结合对成员之间的结合与所述Treg细胞缀合。16.实施方案14的方法，其中离体实现所述接触。17.实施方案16的方法，其中所述缀合物中的至少两个基本上同时接触所述Treg细胞。18.实施方案16的方法，其中在单个组合物中提供所述缀合物中的至少两个。19.实施方案18的方法，其中所述第一、第二或第三缀合物中的至少一个通过所述第一个和第二个结合对成员之间的结合与所述第四、第五、第六和第七缀合物中的至少一个缀合。20.实施方案16的方法，其中所述缀合物中的至少两个按次序接触所迷Treg细胞。21.权利要求16的方法，进一步包括将所述扩增的Treg细胞给药于患者。22.权利要求14的方法，其中通过将所述缀合物给药于患者在体内实现所述接触。23.实施方案14的方法，其中所述Treg细胞群体包括选自CD4+细胞、CD25+细胞和FoxP3+细胞的Treg细胞。24.实施方案23的方法，其中所述Treg细胞群体包括CD4+CD25+FoxP3十细胞。25.实施方案21或22的方法，其中所迷患者患有自体免疫疾病或处于自体免疫疾病的风险中。26.实施方案25的方法，其中所述患者患有I型糖尿病或处于I型糖尿病的风险中。27.实施方案21或22的方法，其中所述患者是外源移植患者。28.实施方案21或22的方法，进一步包括将雷帕霉素给药于所述患者。29.实施方案21或22的方法，进一步包括将包括展示TGF-p的外源细胞的组合物给药于所述患者。30.实施方案29的方法，进一步包括将雷帕霉素给药于所迷患者。31.实施方案29的方法，其中所述外源细胞选自脾细胞、胰岛组织和骨髓细胞。32.实施方案29的方法，其中通过以下方法获得所迷外源细胞(a)将外源细胞接触包括结合对的第一个成员和结合所述细胞表面的分子的双功能分子来形成修饰的外源细胞；和(b)将所述修饰的外源细胞接触包括TGF-卩和所述结合对的第二个成员的缀合物来形成展示TGF-p的外源细胞。33.实施方案14的方法，其中所述结合对的所述第一个成员包括抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白，并且所述结合对的所迷第二个成员包括生物素。34.实施方案14的方法，其中所述结合对的所述第一个成员包括核心链霉抗生物素蛋白。35.实施方案14的方法，其中所述第一、第二或第三缀合物中的至少一个包括融合多肽，该融合多肽包括所迷第一缀合物成员和所迷第二缀合物成员。36.实施方案4的方法，其中所述细胞因子选自IL-2和IL-4。37.实施方案14的方法，其中所述抗原是自体抗原。38.实施方案14的方法，其中所述抗原选自胰岛素、胶原、髓磷脂碱性蛋白和MHC/抗原复合物。39.实施方案14的方法，其中所述抗原选自谷氨酸脱羧酶(GAD)、胰岛细胞自体抗原(ICA)和自体抗原NRP-A7。40.实施方案14的方法，进一步包括将所述Treg细胞接触游离的IL-2。41.实施方案14的方法，进一步包括将所述Treg细胞接触游离的抗-CD3抗体或游离的抗-CD28抗体。42.获得展示TGF-卩的脉冲树突细胞的方法，包括(a)用抗原脉沖未成熟树突细胞，以获得脉沖的树突细胞；(b)将所述脉沖的树突细胞接触包括结合对的第一个成员和结合所述细胞表面的分子的双功能分子来形成修饰的脉沖树突细胞；和(c)将所述修饰的脉沖树突细胞接触包括TGF-p和所迷结合对的第二个成员的缀合物来形成展示TGF-P的脉沖树突细胞。43.实施方案42的方法，其中所述抗原是致糖尿病自体抗原。44.实施方案43的方法，其中所述致糖尿病自体抗原选自谷氨酸脱羧酶(GAD)、胰岛细胞自体抗原(ICA)和自体抗原NRP-A7。45.实施方案44的方法，其中所迷致糖尿病自体抗原选自GAD65和ICA512。46.实施方案45的方法，包括用GAD65、ICA512和NRP-A7中的每一个脉沖所迷未成熟树突细胞。47.实施方案42的方法，其中所述抗原是胶原。48.实施方案42的方法，其中所述抗原是髓磷脂碱性蛋白。49.实施方案42的方法，进一步包括驱使所述脉沖的树突细胞成熟。50.实施方案49的方法，其中所述驱使包括用4-1BBL孵育所述脉沖的树突细胞。51.展示TGF-卩的抗原脉冲的树突细胞群体。52.通过实施方案42的方法制得的展示TGF-卩的抗原脉沖的树突细胞群体。53.在患者中扩增Treg细胞的方法，包括将含有展示TGF-卩的抗原脉沖的树突细胞的组合物给药于所述患者。54.在患者中扩增Treg细胞的方法，包括将含有通过实施方案42的方法制得的展示TGF-p的脉沖树突细胞的组合物给药于所述患者。55.实施方案54的方法，进一步包括将雷帕霉素给药于所述患者。56.获得展示TGF-卩的造血干细胞或骨髄细胞的方法，包括(a)将造血干细胞或骨髓细胞接触包括结合对的第一个成员和结合所述细胞表面的分子的双功能分子来形成修饰的细胞；和(b)将所述修饰的细胞接触包括TGF-(3和所述结合对的第二个成员的缀合物来形成展示TGF-卩的细胞。57.实施方案56的方法，其中所述结合对的所述笫一个成员包括生物素和所迷结合对的所迷第二个成员包括核心链霉素。58.在患者中扩增Treg细胞的方法，包括将含有展示TGF-p的造血干细胞或展示TGF-卩的骨髓细胞的组合物给药于所迷患者。59.实施方案58的方法，其中通过以下方法制备展示TGF-卩的细胞，该方法包括(a)将造血千细胞或骨髄细胞接触包括结合对的第一个成员和结合所述细胞表面的分子的双功能分子来形成修饰的细胞；和(b)将所迷修饰的细胞接触包括TGF-卩和所迷结合对的第二个成员的缀合物来形成展示TGF-卩的细胞。60.实施方案58的方法，进一步包括将雷帕霉素给药于所迷患者。61.实施方案58的方法，其中所述患者是需要对自体抗原、同种抗原或异种抗原的耐受性诱导；卩细胞再生；外源移植排斥的预防；或遗传上固有造血性疾病治疗的患者。62.展示TGF-p的骨髓细胞群体。63.通过以下方法制得的展示TGF-卩的骨髓细胞群体，该方法包括(a)将骨髓细胞接触包括结合对的第一个成员和结合所述细胞表面的分子的双功能分子来形成修饰的细胞；和(b)将所述修饰的细胞接触包括TGF-卩和所述结合对的第二个成员的缀合物来形成展示TGF-p的细胞。64.展示TGF-J3的造血干细胞群体。65.通过以下方法制得的展示TGF-|3的造血千细胞群体，该方法包括(a)将造血干细胞接触包括结合对的第一个成员和结合所述细胞表面的分子的双功能分子来形成修饰的细胞；和(b)将所述修饰的细胞接触包括TGF-卩和所迷结合对的第二个成员的缀合物来形成展示TGF-卩的细胞。权利要求1.一种组合，其包括(A)一个或多个选自以下的缀合物(a)第一缀合物，其包括(i)包括4-1BBL多肽的第一缀合物成员和(ii)包括结合对的第一个成员的第二缀合物成员；(b)第二缀合物，其包括(i)包括CD80多肽的第一缀合物成员和(ii)包括结合对的第一个成员的第二缀合物成员；和(c)第三缀合物，其包括(i)包括TGF-β多肽的第一缀合物成员和(ii)包括所述结合对的第一个成员的第二缀合物成员；和(B)一个或多个选自以下的缀合物(a’)第四缀合物，其包括(i)包括抗-CD3抗体的第一缀合物成员和(ii)包括所述结合对的第二个成员的第二缀合物成员；(b’)第五缀合物，其包括(i)包括细胞因子的第一缀合物成员和(ii)包括所述结合对的第二个成员的第二缀合物成员；(c’)第六缀合物，其包括(i)包括抗原的第一缀合物成员和(ii)包括所述结合对的第二个成员的第二缀合物成员；和(d’)第七缀合物，其包括(i)包括抗-CD28抗体的第一缀合物成员和(ii)包括所述结合对的第二个成员的第二缀合物成员。2.权利要求1的组合，其中所迷第一、第二或第三缀合物中的至少一个包括融合多肽，该融合多肽包括所述第一缀合物成员和所述第二缀合物成员。3.权利要求1的組合，其中所迷细胞因子选自IL-2、IL-4或IL-7。4.权利要求l的组合，其中所迷抗原是自体抗原。5.权利要求1的组合，其中所迷抗原选自胰岛素、胶原、髄磷脂碱性蛋白、MHC/抗原复合物、谷氨酸脱羧酶(GAD)、胰岛细胞自体抗原(ICA)和自体抗原NRP-A7。6.权利要求1的组合，其中在分开的組合物中提供所述缀合物。7.权利要求l的组合，其中在单个组合物中提供所述缀合物。8.扩增Treg细胞的方法，所述方法包括将Treg细胞群体接触(A)—个或多个选自以下的缀合物(a)第一缀合物，其包括(i)包括4-lBBL多肽的笫一缀合物成员和(ii)包括结合对的第一个成员的第二缀合物成员；(b)第二缀合物，其包括(i)包括CD80多肽的笫一缀合物成员和(ii)包括结合对的第一个成员的第二缀合物成员；(c)第三缀合物，其包括(i)包括TGF-卩多肽的第一缀合物成员和(ii)包括所述结合对的第一个成员的第二缀合物成员；和(B)—个或多个选自以下的缀合物(a，)第四缀合物，其包括(i)包括抗-CD3抗体的第一缀合物成员和(ii)包括所述结合对的第二个成员的第二缀合物成员；(b，)第五缀合物，其包括(i)包括细胞因子的第一缀合物成员和(ii)包括所迷结合对的第二个成员的第二缀合物成员；(c，)第六缀合物，其包括(i)包括抗原的第一缀合物成员和(ii)包括所述结合对的第二个成员的第二缀合物成员；和(d，)第七缀合物，其包括(i)包括抗-CD28抗体的第一缀合物成员和(ii)包括所述结合对的第二个成员的第二缀合物成员。9.权利要求8的方法，其中(a)离体和/或(b)在体内实现所述接触。10.权利要求8的方法，其中所述的Treg细胞群体包括选自CD4+纟田胞、CD25+多田胞和FoxP3+纟田胞的Treg纟田胞。11.权利要求8的方法，进一步包括将含有展示TGF-|3的外源细胞的组合物给予所述患者，其中所述外源细胞选自脾细胞、胰岛組织和骨髓细胞。12.权利要求8的方法，其中所述抗原选自胰岛素、胶原、髄磷脂碱性蛋白、MHC/抗原复合物、谷氨酸脱羧酶(GAD)、胰岛细胞自体抗原(ICA)和自体抗原NRP-A7。13.获得展示TGF-卩的脉沖树突细胞的方法，所述方法包括(a)用抗原脉沖未成熟树突细胞，来获得脉沖的树突细胞；(b)将所述的脉沖树突细胞接触包括结合对的第一个成员和结合所述细胞表面的分子的双功能分子来形成修饰的脉沖树突细胞；和(c)将所述修饰的脉沖树突细胞接触包括TGF-卩和所述结合对的第二个成员的缀合物来形成展示TGF-p的脉沖树突细胞。14.权利要求13的方法，其中所述抗原选自胶原；髓磷脂碱性蛋白；和糖尿病自体抗原，其中所述糖尿病自体抗原进一步选自谷氨酸脱羧酶(GAD)、胰岛细胞自体抗原(ICA)和自体抗原NRP-A7。15.展示TGF-卩的抗原脉沖的树突细胞群体。16.在患者中扩增Treg细胞的方法，所迷方法包括将含有展示TGF-卩的抗原脉沖的树突细胞的组合物给药于所迷患者。17.获得展示TGF-卩的造血干细胞或骨髄细胞的方法，所迷方法包括(a)将造血干细胞或骨髓细胞接触包括结合对的第一个成员和结合所迷细胞表面的分子的双功能分子来形成修饰的细胞；和(b)将所迷修饰的细胞接触包括TGF-卩和所迷结合对的第二个成员的缀合物来形成展示TGF-(3的细胞。18.在患者中扩增Treg细胞的方法，所迷方法包括将含有展示TGF-卩的造血干细胞或展示TGF-卩的骨髄细胞的组合物给药于所述患者。19.展示TGF-卩的细胞群体，其中所述细胞选自骨髄细胞和造血干细胞。20.权利要求19的展示TGF-P的细胞群体，所述细胞群体是通过以下方法制得的，该方法包括(a)将细胞接触包括结合对的第一个成员和结合所述细胞表面的分子的双功能分子来形成修饰的细胞，其中所述细胞选自骨髓细胞和造血干细胞；和(b)将所述修饰的细胞接触包括TGF-卩和所述结合对的第二个成员的缀合物来形成展示TGF-卩的细胞。全文摘要本发明提供了用于离体或在体内扩增Treg细胞的方法和组合物，其使用一个或多个包括共刺激部分的缀合物，该共刺激部分刺激涉及Treg细胞发展的三个信号中的至少一个，和/或使用用抗原脉冲的并修饰来展示TGF-β的树突细胞，或修饰来展示TGF-β的造血干细胞或骨髓细胞。该方法和组合物可以用于，例如，治疗和预防自体免疫疾病，包括1型糖尿病，和预防外源移植排斥，以及建立混合的嵌合体，诱导对自体抗原、同种抗原和异种抗原的耐受性，β细胞再生，预防外源移植排斥和治疗遗传上固有的造血性疾病。文档编号C07K14/495GK101378783SQ200680052490公开日2009年3月4日申请日期2006年12月7日优先权日2005年12月8日发明者H·什尔万申请人:路易斯维尔大学研究基金会有限公司