具有表皮生长因子受体和/或血管内皮生长因子结合特异性的配体及其使用方法

专利名称：具有表皮生长因子受体和/或血管内皮生长因子结合特异性的配体及其使用方法
技术领域：
本发明涉及具有VEGF(例如人VEGF)结合特异性的配体，具有EGFR(例如人EGFR)结合特异性的配体以及具有VEGF和EGFR(例如人VEGF和人EGFR)结合特异性的配体。例如，配体可包含具有VEGF结合特异性结合位点的多肽域，具有EGFR结合特异性结合位点的多肽域，或者包含具有VEGF结合特异性结合位点的多肽域和具有EGFR结合特异性结合位点的多肽域。
本发明的配体提供一些优势，例如如本文所述，可修饰配体使之具有所需体内血清半衰期。因此，配体可用于控制、降低或消除治疗药(例如用于治疗癌症的毒素)的一般毒性。此外，dAb比常规抗体小很多，给予dAb比给予常规抗体的组织渗透性更好。因此，当用于治疗癌症(例如通过靶向实体瘤)时，dAb和包含dAb的配体比常规抗体更具优势。此外，许多癌症过量表达EGFR，可以给予具有EGFR和VEGF结合特异性的配体，将VEGF-抑制活性靶向肿瘤或癌细胞的环境。该方法直接给予肿瘤或癌症部位两个有利活性，即通过结合EGFR并抑制配体(例如EGF、TGFα)与受体结合，以及抑制支持肿瘤形成和发育的血管生成，而导致抗癌活性。因此，可将具有VEGF和EGFR结合特异性的配体给予癌症(例如表达EGFR的癌症)患者，以便用单一治疗药达到良好治疗。
此外，通过EGFR转导的信号可导致血管生成因子(例如VEGF)的产生。表达或过量表达EGFR的癌细胞(例如在肿瘤中)可产生高水平VEGF，其在局部起到减少肿瘤血管生成的作用。因此，可将具有VEGF和EGFR结合特异性的本发明配体给予患者，以便将配体的VEGF抑制活性定向给予过量表达EGFR的细胞。因此，可将抗血管生成治疗特异性给予产生VEGF的部位(例如给予过量表达EGFR的细胞)。
在某些实施方案中，配体具有VEGF结合特异性并且包含(至少一个)具有VEGF结合特异性的免疫球蛋白单可变区。在其它实施方案中，配体具有EGFR结合特异性并且包含(至少一个)具有EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区。在某些实施方案中，配体具有VEGF和EGFR结合特异性，并且包含(至少一个)具有VEGF结合特异性的免疫球蛋白单可变区和(至少一个)具有EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区。
如本文所述，可以精制本发明的配体。例如，可以精制本发明的配体以改变其体内血清半衰期。如有必要，配体还可包含本文所述的毒素或毒素部分。在某些实施方案中，配体包含表面活性毒素，例如自由基产生物(例如含硒毒素)或放射性核素。在其它实施方案中，毒素或毒素部分是具有胞内靶结合特异性结合位点的多肽域(例如dAb)。在具体实施方案中，配体是具有VEGF和EGFR(例如人VEGF和人EGFR)结合特异性的IgG样形式。
配体形式 如本文所述，本发明的配体可精制成单特异性、双特异性或多特异性配体。另见WO 03/002609中关于配体精制，其全部内容通过引用结合到本文中。所述双特异性配体包含具有不同结合特异性的免疫球蛋白单可变区。所述双特异性配体可包含重链区和轻链区的组合。例如，双特异性配体可包含VH区和VL区，其可以scFv形式连接在一起(例如使用合适的接头，例如Gly4Ser)，或者精制成双特异性抗体或其抗原结合片段(例如F(ab’)2片段)。双特异性配体并不包括互补VH/VL对，其形成能协同结合抗原或表位的常规两条链的抗体抗原结合位点。而双形式的配体却包含VH/VL互补对，其中V区具有不同的结合特异性。
另外，如有必要，双特异性配体可包含一个或多个CH区或CL区。如有必要，也可包含铰链区。这样的各区组合可以例如模拟天然抗体，例如IgG或IgM或其片段，例如Fv、scFv、Fab或F(ab’)2分子。也考虑了其它结构，例如包含VH、VL、CH1和CL区的IgG分子的单臂。优选本发明的双特异性配体仅包含两个可变区，尽管几个这样的配体也能掺入同一蛋白质，例如两个这样的配体可以掺入IgG或多聚体形式的免疫球蛋白，例如IgM。或者，在另一个实施方案中，多个双特异性配体结合在一起形成多聚体。例如，两个不同双特异性配体结合在一起，产生四特异性分子。本领域技术人员可以理解，本发明方法所产生的双特异性配体的轻链可变区和重链可变区，可以在同一多肽链上或者在不同多肽链上。就可变区在不同多肽链上而言，它们可以通过接头、通常是柔性接头(例如多肽链)、化学连接基团而连接，或者通过本领域已知的任何其它方法而连接。
在某些实施方案中，接头可以是含有抗体可变区羧基端氨基酸和抗体恒定区氨基端氨基酸的“天然接头”。例如，天然接头可含有Vκ的羧基端氨基酸和Cκ的氨基端氨基酸(例如KVEIKRTVAAPS(SEQ ID NO706))。在其它实施方案中，接头可含比天然接头更少的Lys和Arg残基(例如LVTVSSAST(SEQ ID NO707)或(LVTVSSGGGGSGGGS(SEQ ID NO708))。如有必要，可使接头突变，以取代一些或全部带正电荷的残基(例如在天然接头中)，例如用在生理pH下不带正电荷的残基取代Lys和/或Arg。例如，Lys和/或Arg残基可以用Asn、Leu、Gln或Ser取代。这类接头具有降低蛋白酶敏感性的优势(例如丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、基质金属蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、弹性蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、羧肽酶、组织蛋白酶(例如组织蛋白酶G)、蛋白酶3)。这些接头的实例包括GQGTNVEINRTVAAPS(SEQ ID NO710)、GQGTNVEINQTVAAPS(SEQ ID NO711)、GQGTNVEIQRTVAAPS(SEQ ID NO712)或GQGTLVTVSSTVAAPS(SEQ ID NO713)。
蛋白酶(例如丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、基质金属蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、弹性蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、羧肽酶、组织蛋白酶(例如组织蛋白酶G)、蛋白酶3)在蛋白质的正常更新和代谢中起作用。然而，在某些生理状态(例如炎症状态(例如COPD)和癌症)下，组织、器官或动物体内(例如肺部、肿瘤内或其附近)存在的蛋白酶的数量会增加。这样的蛋白酶的增加可导致内源蛋白质加速降解或失活，以及所给予的治疗或诊断用肽、多肽和蛋白质的加速降解或失活。事实上，某些具有体内用途(例如用于治疗、诊断活预防疾病)的药物只有有限功效，因为它们被蛋白酶快速降解而失活。
本发明涉及包含能耐受蛋白酶降解的接头的配体。本发明的蛋白酶耐受性配体具有一些优势。例如，可将蛋白酶耐受性配体给予患者，比起蛋白酶敏感性药物而言，其活性在体内保留时间更长。因此，蛋白酶耐受性配体可在足够产生生物效应的时间周期内保持功能。
在适于蛋白酶活性的条件下，将耐受蛋白酶降解的配体或接头与蛋白酶一起孵育至少约2小时、至少约3小时、至少约4小时、至少约5小时、至少约6小时、至少约7小时、至少约8小时、至少约9小时、至少约10小时、至少约11小时、至少约12小时、至少约24小时、至少约36小时或至少约48小时，耐受蛋白酶降解的配体或接头基本上不被蛋白酶降解。将配体或接头与蛋白酶一起孵育至少约2小时之后，当不超过约25％、不超过约20％、不超过约15％、不超过约14％、不超过约13％、不超过约12％、不超过约11％、不超过约10％、不超过约9％、不超过约8％、不超过约7％、不超过约6％、不超过约5％、不超过约4％、不超过约3％、不超过约2％、不超过约1％或基本上没有配体或接头被蛋白酶降解时，则配体或接头基本上不被降解。可采用SDS-PAGE等合适方法评价蛋白质降解。
可用任何合适方法评价蛋白酶耐受性。例如，可将蛋白酶添加到配体或接头的合适缓冲液(例如PBS)的溶液中，得到配体或接头/蛋白酶溶液，例如至少约0.01％(w/w)蛋白酶、约0.01％至约5％(w/w)蛋白酶、约0.05％至约5％(w/w)蛋白酶、约0.1％至约5％(w/w)蛋白酶、约0.5％至约5％(w/w)蛋白酶、约1％至约5％(w/w)蛋白酶、至少约0.01％(w/w)蛋白酶、至少约0.02％(w/w)蛋白酶、至少约0.03％(w/w)蛋白酶、至少约0.04％(w/w)蛋白酶、至少约0.05％(w/w)蛋白酶、至少约0.06％(w/w)蛋白酶、至少约0.07％(w/w)蛋白酶、至少约0.08％(w/w)蛋白酶、至少约0.09％(w/w)蛋白酶、至少约0.1％(w/w)蛋白酶、至少约0.2％(w/w)蛋白酶、至少约0.3％(w/w)蛋白酶、至少约0.4％(w/w)蛋白酶、至少约0.5％(w/w)蛋白酶、至少约0.6％(w/w)蛋白酶、至少约0.7％(w/w)蛋白酶、至少约0.8％(w/w)蛋白酶、至少约0.9％(w/w)蛋白酶、至少约1％(w/w)蛋白酶、至少约2％(w/w)蛋白酶、至少约3％(w/w)蛋白酶、至少约4％(w/w)蛋白酶或约5％(w/w)蛋白酶的溶液。在适于蛋白酶活性的温度(例如在37℃)中，孵育配体或接头/蛋白酶混合物，定时取样(例如在1小时、2小时、3小时等)并终止蛋白酶反应。然后用SDS-PAGE分析等合适方法分析样品中的蛋白质降解。结果用于绘制降解的时间曲线。
配体可精制成双特异性或多特异性抗体或抗体片段或双特异性或多特异性非抗体结构。合适的形式包括任何合适的多肽结构，其中可以掺入抗体可变区或其一个或多个CDR，以便在结构上赋予对抗原的结合特异性。各种合适的抗体形式是本领域已知的，例如双特异性IgG样形式(例如嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、单链抗体、抗体重链和/或轻链的异型二聚体、任何前述抗原结合片段(例如Fv片段(例如单链Fv(scFv)、二硫键连接的Fv)、Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段)、单可变区(例如VH、VL、VHH)、dAb和任何前述的修饰形式(例如通过共价连接聚亚烷基二醇(例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚丁二醇)或其它合适的聚合物)而修饰)。参见PCT/GB03/002804(2003年6月30日申请，指定国为美国(WO 2004/081026)有关PEG化单可变区和dAb、其合适的制备方法、PEG化单可变区和dAb单体和多聚体的延长的体内半衰期、合适的PEG、优选的PEG流体动力学尺寸和优选的PEG化单可变区和dAb单体和多聚体的流体动力学尺寸。PCT/GB03/002804(WO 2004/081026)的全部公开内容，包括上面提及的部分，全都通过引用结合到本文中。
可以精制配体，例如使用合适接头，例如(Gly4Ser)n，其中n＝1-8，例如2、3、4、5、6或7。如有必要，配体(包括dAb单体、二聚体和三聚体)可以与抗体Fc区(包含CH2区和CH3区中的一个或两者都包含)和任选铰链区连接。例如，将编码配体的载体与Fc区连接成为一个核苷酸序列，用于制备所述多肽。在某些实施方案中，配体包含具有相同或不同结合特异性的一个、两个或更多个dAb，以及CH2、CH3、CH2-CH3、铰链-CH2、铰链-CH3、铰链-CH2-CH3、铰链-CH2的部分、铰链-CH3的部分、或铰链-CH2-CH3的部分。在这样的实施方案中，CH2、CH3、CH2-CH3、铰链-CH2、铰链-CH3、铰链-CH2-CH3、铰链-CH2的部分、铰链-CH3的部分和铰链-CH2-CH3的部分可来自所需抗体，例如人IgG、例如人IgG1或人IgG4。
在某些实施方案中，本发明的配体包含与抗体Fc区融合(例如直接或通过接头)的抗EGFR dAb或抗VEGF dAb。在某些实施方案中，配体是包含以二硫键结合抗EGFR dAb的抗VEGF dAb的Fc融合体。在具体实例中，配体包含两个或更多个dAb(例如两个能结合EGFR的dAb、两个能结合VEGF的dAb、一个能结合EGFR的dAb和一个能结合VEGF的dAb)和Fc区，而且从氨基端到羧基端，配体的结构为VH-VH-Fc、VL-VL-Fc、VH-VL-Fc、VL-VH-Fc。例如，配体的结构为VH-VK-铰链-CH2-CH3、VK-VH-铰链-CH2-CH3、VK-VK-铰链-CH2-CH3或VH-VH-铰链-CH2-CH3。如有必要，任何上述通式所表示的VH都可以是VHH。含有Fc区的两个配体可以结合在一起形成二聚体，例如通过二硫键(例如在铰链区内)。
通常，具有靶(例如dAb)结合特异性结合位点的多肽域的方向，以及配体是否包含接头，都是设计选择的问题。然而，与其它方向相比，某些方向(有或无接头)可提供优选结合特性。所有方向(例如dAb1-dAb2-Fc；dAb2-dAb1-Fc)都涵盖在本发明之内，可通过常规筛选，容易地鉴定出含有能提供所需结合特异性的方向的配体。
配体和dAb单体也可以结合到和/或精制到非抗体多配体结构中，形成多价复合物，其可结合具有相同抗原的靶分子，因而提供优越亲合力。例如天然细菌受体(例如SpA)已经用作移植CDR的支架，以产生能特异性结合一个或多个表位的配体。该方法的细节参见US5,831,012。其它合适的支架包括基于纤连蛋白和亲和体的支架。合适方法的细节参见WO 98/58965。其它合适的支架包括脂质运载蛋白和CTLA4(参见van den Beuken等，J.Mol.Biol.310，591-601(2001))以及例如描述于WO00/69907(Medical Research Council)的支架，所述支架是基于例如细菌GroEL的环状结构或其它多肽陪伴分子。蛋白质支架可以进行组合；例如，CDR可以移植到CTLA4支架上并且与免疫球蛋白VH区或VL区一起使用，以构成配体。同样，纤连蛋白、脂质运载蛋白和其它支架也可以进行组合。
制备任何所需形式的各种合适方法是本领域已知的，例如可以通过表达合适的表达构建体和/或培养合适细胞(例如杂交瘤、异源杂交瘤、含有编码所述形式的重组构建体的重组宿主细胞)，来制备抗体链和抗体形式(例如双特异性IgG样形式、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、单链抗体、抗体重链和/或轻链的同型二聚体和异型二聚体)。此外，可以通过表达合适的表达构建体或通过抗体的酶促消化(例如用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶)，制备抗体或抗体链的抗原结合片段(例如双特异性结合片段，例如Fv片段(例如单链Fv(scFv)、二硫键连接的Fv)、Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段)等形式。
配体可以精制成多特异性配体，例如按照WO 03/002609所述，该文献所公开的内容通过引用全部结合到本文中。这样的双特异性配体具有不止一个表位结合特异性。通常，多特异性配体包含两个或更多个表位结合域，例如包含表位结合位点的dAb或非抗体蛋白结构域，例如亲和体、SpA区、LDL受体A类区、EGF区、高亲和性多聚体。多特异性配体可按本文所述进一步精制。
在某些实施方案中，配体是IgG样形式。这类形式具有常规IgG分子的4条链结构(2条重链和2条轻链)，其中一个或多个可变区(VH和/或VL)已经被具有所需特异性的dAb即单可变区置换。优选各可变区(2个VH区和2个VL区)被dAb即单可变区置换。包括在IgG样形式中的dAb即单可变区可具有相同特异性或不同特异性。在某些实施方案中，IgG样形式是四价的，并且可具有1、2、3或4种特异性。例如，IgG样形式可以是单特异性的，并且包含4个具有相同特异性的dAb；可以是双特异性的，并且包含3个具有相同特异性的dAb和另一具有不同特异性的dAb；可以是双特异性的，并且包含2个具有相同特异性的dAb和2个具有相同特异性但该特异性与上述的不同的dAb；可以是三特异性的，并且包含具有相同特异性的第一和第二dAb，具有不同特异性的第三dAb，具有不同于第一、第二和第三dAb的特异性的第四dAb；或者可以是四特异性的，并且包含4个各自具有不同特异性的dAb。可以制备IgG样形式的抗原结合片段(例如Fab、F(ab’)2、Fab’、Fv、scFv)。另外，可以选择Fc部分(例如IgG，例如IgG1)的具体恒定区、变异体或其部分，以改变效应器功能。例如，如果需要补体激活和/或抗体依赖性细胞毒性(ADCC)功能的话，配体可以是IgG1样形式。如有必要，IgG样形式可包含突变的恒定区(变异IgG重链恒定区)，以尽可能降低与Fc受体结合和/或结合补体的能力。(参见例如Winter等，GB 2,209,757B；Morrison等，WO 89/07142；Morgan等，WO 94/29351，1994年12月22日)。
在某些实施方案中，IgG样形式可包含抗EGFR dAb(例如DOM16-39-542、DOM16-39-618或DOM16-39-619)、抗VEGF dAb(例如DOM15-26-501)或抗EGFR dAb和抗VEGF dAb。
本发明的配体可精制成含有第一免疫球蛋白单可变区直接与第二免疫球蛋白单可变区融合的融合蛋白。如有必要，这样的形式还可包含半衰期延长部分。例如，配体可包含第一免疫球蛋白单可变区、第二免疫球蛋白单可变区和能结合血清白蛋白的免疫球蛋白单可变区，其中第一免疫球蛋白单可变区直接与第二免疫球蛋白单可变区融合，而第二免疫球蛋白单可变区又直接与能结合血清白蛋白的免疫球蛋白单可变区融合。例如，配体可以是两个或更多个具有EGFR结合特异性结合位点的蛋白质部分的线状融合体(in line fusion)，所述蛋白质部分可与抗EGFR域抗体(例如本文所公开的任何DOM16 dAb)竞争性结合EGFR，并且与抗血清白蛋白dAb(例如本文所公开的任何DOM7 dAb)融合。在某些实施方案中，具有EGFR结合特异性结合位点的蛋白质部分(例如抗EGFR dAb)具有不同表位特异性。在其它实例中，配体是线状融合蛋白，所述蛋白包含具有EGFR结合特异性结合位点的蛋白质部分(例如抗EGFR dAb)、具有VEGF结合特异性结合位点的蛋白质部分和抗血清白蛋白dAb。
在具体实施方案中，这样的线状融合体包含DOM16-39-618dAb和/或DOM16-39-619和抗血清白蛋白dAb(例如DOM16-39-618—DOM7h-14、DOM7h-14—DOM16-39-618、DOM16-39-619—DOM7h-14、DOM7h-14—DOM16-39-619)。在其它实施方案中，线状融合体包含与DOM16-39-618氨基酸序列具有至少约80％、85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸序列同一性的蛋白质部分(例如dAb)，包含与DOM16-39-619氨基酸序列具有至少约80％、85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸序列同一性的蛋白质部分，和/或包含与本文所公开的抗血清白蛋白dAb(例如DOM7h-14)氨基酸序列具有至少约80％、85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸序列同一性的蛋白质部分(例如dAb)。
在其它具体的实施方案中，配体包含抗VEGF dAb、抗EGFR dAb和抗血清白蛋白dAb(例如DOM15-10—DOM16-39—抗血清白蛋白dAb、DOM16-39—DOM15-10—抗血清白蛋白dAb、DOM15-26-501—DOM16-39—抗血清白蛋白dAb、DOM16-39—DOM15-26-501—抗血清白蛋白dAb)。在其它实施方案中，线状融合体包含与本文所公开的抗VEGF dAb(例如DOM15-10或DOM15-25-501)的氨基酸序列具有至少约80％、85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸序列同一性的蛋白质部分(例如dAb)，和/或与本文所公开的抗EGFR dAb(例如DOM16-39)的氨基酸序列具有至少约80％、85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸序列同一性的蛋白质部分，和/或与本文所公开的抗血清白蛋白dAb(例如DOM7h-14)的氨基酸序列具有至少约80％、85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸序列同一性的蛋白质部分(例如dAb)。
通常，具有靶结合特异性结合位点的多肽域的方向，以及配体是否包含接头，都是设计选择的问题。然而，与其它方向相比，某些方向(有或无接头)可提供更好的结合特性。所有方向(例如dAb1-接头-dAb2；dAb2-接头-dAb1)都涵盖在本发明之内，可通过筛选，容易地鉴定出含有能提供所需结合特异性的方向的配体。
延长半衰期的形式 可以精制配体和dAb单体以延长其体内血清半衰期。延长体内半衰期可用于免疫球蛋白(尤其是抗体、最尤其是小尺寸的抗体片段，例如dAb)的体内应用。这样的片段(Fv、二硫键连接的Fv、Fab、scFv、dAb)被快速地从体内清除掉，这极大地限制了临床应用。
可将配体精制成为抗体的较大抗原结合片段或具有较大流体动力学尺寸的抗体(例如精制成Fab、Fab’、F(ab)2、F(ab’)2、IgG、scFv)。配体也可精制成为具有较大流体动力学尺寸，例如通过连接聚亚烷基二醇基团(例如聚乙二醇(PEG)基团、聚丙二醇、聚丁二醇)、血清白蛋白、转铁蛋白、转铁蛋白受体或者至少其转铁蛋白结合部分、抗体Fc区，或者通过与抗体区缀合。在某些实施方案中，将配体(例如dAb单体)PEG化。优选PEG化配体(例如dAb单体)与非PEG化的同样配体对VEGF和/或EGFR都具有基本相同的结合亲和力或亲合力。例如，配体可以是包含能结合VEGF或EGFR的dAb的PEG化配体，其亲和力或亲合力与未PEG化形式的配体的亲和力差异不超过约1000倍、优选不超过约100倍，更优选不超过约10倍，或者前者的亲和力或亲合力相对于未PEG化形式的亲和力或亲合力来说基本不变。参见PCT/GB03/002804(2003年6月30日申请，指定国为美国(WO2004/081026)有关PEG化单可变区和dAb、其合适的制备方法、PEG化单可变区和dAb单体和多聚体的延长的体内半衰期、合适的PEG、优选的PEG流体动力学尺寸和优选的PEG化单可变区和dAb单体和多聚体的流体动力学尺寸。PCT/GB03/002804(WO 2004/081026)的全部公开内容，包括上面提及的部分，全都通过引用结合到本文中。
可用本领域众所周知的方法，测定本发明配体(例如dAb单体和多聚体)的流体动力学尺寸。例如，可采用凝胶过滤色谱来测定配体的流体动力学尺寸。用于测定配体流体动力学尺寸的合适凝胶过滤基质(例如交联琼脂糖基质)是众所周知的，容易获得。
配体形式的尺寸(例如与dAb单体连接的PEG部分的尺寸)因所需用途而异。例如，当需要配体离开循环而进入外周组织时，最好保持配体的流体动力学尺寸较小，以便从血流中外渗。或者，当需要配体在体循环中保留长时间时，可增加配体尺寸，例如通过精制成Ig样蛋白或通过添加30-60kDa PEG部分(例如直链或支链PEG30-40kDaPEG，例如添加两个20kDa PEG部分)。可改变配体形式的尺寸，从而达到所需体内血清半衰期，例如为了控制与毒素的接触和/或降低毒性试剂的副作用。
也可通过将配体与本文所述的结合域(例如抗体或抗体片段)缀合或连接，而增加配体(例如dAb单体)的流体动力学尺寸及其血清半衰期，所述结合域能结合能增加体内半衰期的抗原或表位。例如，配体(例如dAb单体)可以与抗血清白蛋白或抗新生动物Fc受体抗体或抗体片段(例如抗SA或抗新生动物Fc受体dAb、Fab、Fab’或scFv)或与抗SA亲和体或抗新生动物Fc受体亲和体缀合或连接。
用于本发明配体的合适白蛋白、白蛋白片段或白蛋白变异体的实例参见WO 2005/077042A2，所述文献通过引用全部结合到本文中。具体地讲，下面的白蛋白、白蛋白片段或白蛋白变异体可用于本发明 ●SEQ ID NO1(公开于WO 2005/077042A2，该序列通过引用明确地结合到本说明书中)； ●白蛋白片段或变异体，其包含WO 2005/077042A2中SEQ IDNO1的氨基酸1-387或由其组成； ●白蛋白或其片段或变异体，其包含选自以下的氨基酸序列 (a)WO 2005/077042A2中SEQ ID NO1的氨基酸54-61； (b)WO 2005/077042A2中SEQ ID NO1的氨基酸76-89； (c)WO 2005/077042A2中SEQ ID NO1的氨基酸92-100； (d)WO 2005/077042A2中SEQ ID NO1的氨基酸170-176； (e)WO 2005/077042A2中SEQ ID NO1的氨基酸247-252； (f)WO 2005/077042A2中SEQ ID NO1的氨基酸266-277； (g)WO 2005/077042A2中SEQ ID NO1的氨基酸280-288； (h)WO 2005/077042A2中SEQ ID NO1的氨基酸362-368； (i)WO 2005/077042A2中SEQ ID NO1的氨基酸439-447； (j)WO 2005/077042A2中SEQ ID NO1的氨基酸462-475； (k)WO 2005/077042A2中SEQ ID NO1的氨基酸478-486； 和 (l)WO 2005/077042A2中SEQ ID NO1的氨基酸560-566。
用于本发明配体的合适白蛋白、片段和类似物的其它实例参见WO 03/076567 A2，所述文献通过引用全部结合到本文中。具体地讲，下面的白蛋白、片段或变异体可用于本发明 ●人血清白蛋白，参见WO 03/076567A2，例如在图3中(该序列信息通过引用明确地结合到本说明书中)； ●人血清白蛋白(HA)，它由585个氨基酸的单一非糖基化多肽链组成，分子量为66,500(参见Meloun等，FEBS Letters 58136(1975)；Behrens等，Fed.Proc.34591(1975)；Lawn等，NucleicAcids Research 96102-6114(1981)；Minghetti等，J.Biol.Chem.2616747(1986))； ●白蛋白多态变体或其类似物或片段，参见Weitkamp等，Ann.Hum.Genet.37219(1973)； ●白蛋白片段或变异体，参见EP322094，例如HA(1-373)、HA(1-388)、HA(1-389)、HA(1-369)和HA(1-419)以及1-369和1-419间的片段； ●白蛋白片段或变异体，参见EP 399666，例如HA(1-177)和HA(1-200)和HA(1-X)之间的片段，其中X为178-199间的任意数字。
当(一个或多个)延长半衰期的部分(例如白蛋白、转铁蛋白及其片段和类似物)用于本发明配体时，可以用任何合适方法将其与配体缀合，例如通过与靶结合部分(例如dAb或抗体片段)直接融合，例如通过使用编码融合蛋白的单个核苷酸构建体，其中融合蛋白编码成为单一多肽链，具有延长半衰期的部分(位于细胞表面靶结合部分的N端或C端)。或者，可以通过使用各部分间的肽接头(例如WO 03/076567A2或WO 2004/003019所述的肽接头(这些接头的全部公开内容通过引用结合到本说明书中，以提供用于本发明的实例))，来完成缀合反应。通常，能延长体内血清半衰期的多肽是这样的多肽其在体内天然存在，能抵抗通过内源机制所致的降解或清除，所述机制能够从生物体(例如人体)内除去不想要的物质。例如，可从以下蛋白质中选出延长体内血清半衰期的多肽来自胞外基质的蛋白质，血液中的蛋白质，血脑屏障或神经组织中的蛋白质，局限于肾、肝、肺、心、皮肤或骨骼中的蛋白质，应激蛋白，疾病特异性蛋白或参与Fc转运的蛋白质。
能延长体内血清半衰期的合适多肽包括例如转铁蛋白受体特异性配体-神经药物(neuropharmaceutical agent)融合蛋白(参见美国专利号5,977,307，其公开内容通过引用结合到本文中)、脑毛细血管内皮细胞受体、转铁蛋白、转铁蛋白受体(例如可溶性转铁蛋白受体)、胰岛素、胰岛素样生长因子1(IGF 1)受体、胰岛素样生长因子2(IGF 2)受体、胰岛素受体、凝血因子X、α1-抗胰蛋白酶和HNF1α。能延长血清半衰期的合适多肽还包括α-1糖蛋白(血清类粘蛋白(orosomucoid)；AAG)、α-1抗胰凝乳蛋白酶(ACT)、α-1微球蛋白(蛋白HC；AIM)、抗凝血酶III(AT III)、载脂蛋白A-1(Apo A-1)、载脂蛋白B(Apo B)、血浆铜蓝蛋白(Cp)、补体成分C3(C3)、补体成分C4(C4)、Cl酯酶抑制剂(Cl INH)、C-反应蛋白(CRP)、铁蛋白(FER)、血红素结合蛋白(HPX)、脂蛋白(a)[Lp(a)]、甘露糖结合蛋白(MBP)、肌红蛋白(Myo)、前白蛋白(运甲状腺素蛋白(transthyretin))(PAL)、视黄醇结合蛋白(RBP)和类风湿因子(RF)。
来自胞外基质的合适蛋白质包括例如胶原蛋白、层粘连蛋白、整联蛋白和纤连蛋白。胶原蛋白是胞外基质的主要蛋白质。目前已经知道约15种胶原蛋白分子，在身体的不同部位发现，例如I型胶原蛋白(占身体总胶原蛋白的90％)在骨、皮肤、腱、韧带、角膜、内脏中发现，而II型胶原蛋白在软骨、椎间盘(vertebral disc)、脊索、眼睛的玻璃体中发现。
来自血液的合适蛋白质包括例如血浆蛋白(例如血纤蛋白、α-2巨球蛋白、血清白蛋白、血纤蛋白原(例如血纤蛋白原A、血纤蛋白原B)、血清淀粉样蛋白A、触珠蛋白、抑制蛋白、泛蛋白、子宫球蛋白和β-2-微球蛋白)；酶和酶抑制剂(例如血纤蛋白溶解酶原、溶菌酶、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、α-1-抗胰蛋白酶和胰腺胰蛋白酶抑制剂)；免疫系统蛋白质，例如免疫球蛋白(例如IgA、IgD、IgE、IgG、IgM、免疫球蛋白轻链(κ/λ))；转运蛋白(例如视黄醇结合蛋白、α-1微球蛋白)；防卫素(例如β-防卫素1、嗜中性粒细胞防卫素1、嗜中性粒细胞防卫素2和嗜中性粒细胞防卫素3)等。
血脑屏障或神经组织中发现的合适蛋白质包括例如黑皮质素受体、髓磷脂、抗坏血酸转运蛋白等。
能延长体内血清半衰期的合适多肽还包括局限于肾脏中的蛋白质(例如多囊蛋白、IV型胶原蛋白、有机阴离子转运蛋白K1、Heymann抗原)、局限于肝脏中的蛋白质(例如醇脱氢酶、G250)、局限于肺部的蛋白质(例如分泌成分，其可结合IgA)、局限于心脏中的蛋白质(例如HSP27，其与扩张型心肌病相关)、局限于皮肤的蛋白质(例如角蛋白)、骨特异性蛋白(例如骨形态发生蛋白(BMP)，它们是表现出成骨活性(osteogenic activity)的转化生长因子β超家族亚类(例如BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-8))、肿瘤特异性蛋白(例如滋养层抗原、herceptin受体、雌激素受体、组织蛋白酶(例如组织蛋白酶B，其在肝和脾中发现))。
合适的疾病特异性蛋白包括例如仅在活化T细胞上表达的抗原，包括LAG-3(淋巴细胞活化基因)、护骨蛋白(osteoprotegerin)配体(OPGL；参见Nature 402，304-309(1999))、OX40(TNF受体家族成员，在活化T细胞上表达并在人T细胞白血病病毒I型(HTLV-I)产生细胞中被特异性上调；参见Immunol.165(1)263-70(2000))。合适的疾病特异性蛋白质还包括例如金属蛋白酶(与关节炎/癌症有关)，包括CG6512果蝇(Drosophila)、人截瘫蛋白、人FtsH、人AFG3L2、鼠ftsH；以及血管生成生长因子，包括酸性成纤维细胞生长因子(FGF-1)、碱性成纤维细胞生长因子(FGF-2)、血管内皮生长因子/血管通透因子(VEGF/VPF)、转化生长因子-α(TGFα)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、血管生成素、白介素-3(IL-3)、白介素-8(IL-8)、血小板衍生内皮生长因子(PD-ECGF)、胎盘生长因子(PlGF)、中期因子(midkine)血小板衍生生长因子-BB(PDGF)和CXXXC趋化因子(fractalkine)。
能延长体内血清半衰期的合适多肽还包括应激蛋白，例如热激蛋白(HSP)。HSP通常在胞内发现。当在胞外发现它们时，就表明细胞已经死亡并溢出其内容物。这样的非程序性细胞死亡(坏死)仅当作为创伤、疾病或损伤、胞外HSP触发免疫系统反应的结果时才发生。与胞外HSP的结合可使本发明组合物局限于疾病部位。
参与Fc转运的合适蛋白质包括例如Brambell受体(也称为FcRB)。该Fc受体具有两个功能，这两者可潜在用于递送。其功能是(1)跨越胎盘将IgG从母亲转运给孩子，(2)保护IgG免遭降解，因而延长其血清半衰期。认为受体从核内体中再循环IgG。(参见Holliger等，Nat Biotechnol 15(7)632-6(1997))。
药代动力学分析方法和配体半衰期的测定方法是本领域技术人员熟知的。有关细节可参见Kenneth，A等，Chemical Stability ofPharmaceuticalsA Handbook for Pharmacists和载于Peters等，Pharmacokinetc analysisA Practical Approach(1996)。参考文献也可参见“Pharmacokinetics”，M Gibaldi & D Perron，Marcel Dekker出版，2ndRev.ex edition(1982)，该文献介绍了药代动力学参数，例如tα和tβ半衰期和曲线下面积(AUC)。
含有毒素部分或毒素的配体 本发明也涉及包含毒素部分或毒素的配体。合适的毒素部分包括毒素(例如表面活性毒素、细胞毒素)。采用任何合适方法，可将毒素部分或毒素与配体连接或缀合。例如，毒素部分或毒素可以直接或通过合适接头与配体共价键合。合适的接头可包括不可裂解或可裂解接头(例如pH可裂解接头)，可裂解接头包含细胞酶(例如细胞酯酶、细胞蛋白酶例如组织蛋白酶B)的裂解位点。这样的可裂解接头可用于制备配体，当这样的配体内在化后，可释放出毒素部分或毒素。
各种用于将毒素部分或毒素与配体连接或缀合的方法都可使用。所选具体方法取决于毒素部分或毒素以及有待连接或缀合的配体。如有必要，可使用含有末端官能团的接头来连接配体和毒素部分或毒素。通常，通过将含有活性官能团(或经修饰而含有活性官能团)的毒素部分或毒素与接头或直接与配体反应，完成缀合。使含有(或经修饰后含有)在合适条件下能与第二化学基团反应而形成共价键的化学部分或官能团的毒素部分或毒素发生反应，形成共价键。如有必要，可采用任何合适方法，将合适活性化学基团添加到配体或接头上(参见例如Hermanson，G.T.，Bioconjugate Techniques，Academic PressSanDiego，CA(1996))。许多合适的活性化学基团组合是本领域已知的，例如胺基可与亲电子基团反应，所述亲电子基团例如甲苯磺酸酯、甲磺酸酯、卤素(氯、溴、氟、碘)、N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)等。硫醇可以与马来酰亚胺、碘乙酰基、丙烯酰基(acrylolyl)、吡啶基二硫化物、5-巯基-2-硝基苯甲酸硫醇(TNB-硫醇)等反应。醛官能团可以与含胺或酰肼的分子偶联，而叠氮基可以与三价磷基团反应而形成氨基磷酸酯或磷酰亚胺键(phosphorimide linkage)。将活化基团引入分子的合适方法是本领域已知的(参见例如Hermanson，G.T.，BioconjugateTechniques，Academic PressSan Diego，CA(1996))。
合适的毒素部分和毒素包括例如美登木素生物碱(例如美登木醇，例如DM1、DM4)、紫杉烷、加利车霉素、倍癌霉素或其衍生物。美登木素生物碱可以是例如美登木醇或美登木醇类似物。美登木醇类似物的实例包括具有修饰芳环的那些类似物(例如C-19-脱氯(decloro)、C-20-脱甲氧基、C-20-酰氧基)以及在其它位置上修饰的那些类似物(例如C-9-CH、C-14-烷氧基甲基、C-14-羟甲基或乙酰氧基甲基(aceloxymethyl)、C-15-羟基/酰氧基、C-15-甲氧基、C-18-N-脱甲基、4，5-脱氧)。美登木醇和美登木醇类似物可参见例如美国专利号5,208,020和6,333,410，所述文献的内容通过引用结合到本文中。美登木醇可以与抗体和抗体片段偶联，使用例如3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-琥珀酰亚胺基酯(也称为4-(2-吡啶基二硫基)戊酸N-琥珀酰亚胺基酯或SPP)、4-琥珀酰亚胺基-氧基羰基-a-(2-吡啶基二硫基)-甲苯(SMPT)、3-(2-吡啶基二硫基)丁酸N-琥珀酰亚胺基酯(SDPB)、2-亚氨基硫杂环戊烷(2 iminothiolane)或S-乙酰基琥珀酸酐。紫杉烷可以是例如泰素、泰索帝或新的紫杉烷(参见例如WO 01/38318)。加利车霉素可以是例如溴-加利车霉素络合物(例如α、β或γ溴络合物)、碘-加利车霉素络合物(例如α、β或γ碘络合物)或其类似物和模拟物。溴-加利车霉素络合物包括I1-BR、I2-BR、I3-BR、I4-BR、J1-BR、J2-BR和K1-BR。碘-加利车霉素络合物包括I1-I、I2-I、I3-I、J1-I、J2-I、L1-I和K1-BR。加利车霉素及其突变体、类似物和模拟物可参见例如美国专利号4,970,198、5,264,586、5,550,246、5,712,374和5,714,586，所述文献的内容通过引用结合到本文中。倍癌霉素类似物(例如KW-2189、DC88、DC89CBI-TMI及其衍生物)可参见例如美国专利号5,070,092、美国专利号5,187,186、美国专利号5,641,780、美国专利号5,641,780、美国专利号4,923,990和美国专利号5,101,038，所述文献的内容通过引用结合到本文中。
其它毒素的实例包括但不限于抗代谢药(例如甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、氮烯咪胺(decarbazine))、烷化剂(例如氮芥、塞替派(thioepa)苯丁酸氮芥、CC-1065(参见美国专利号5,475,092、5,585,499、5,846,545)、美法仑、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链佐星(streptozotocin)、丝裂霉素C和顺-二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂)、蒽环类(例如柔红霉素(以前称为道诺霉素)和多柔比星)、抗生素(例如放线菌素D(以前称为放线菌素)、博来霉素、光辉霉素、丝裂霉素、嘌罗霉素、安曲霉素(AMC))、倍癌霉素及其类似物或衍生物和抗有丝分裂药(例如长春新碱、长春碱、泰素、auristatins(例如auristatin E)和美登木素生物碱及其类似物或同系物。
毒素也可以是表面活性毒素，例如作为自由基产生物(例如含硒毒素部分)的毒素或含有放射性核素的部分的毒素。合适的含有放射性核素的部分包括例如含有放射性碘(131I或125I)、钇(90Y)、镥(177Lu)、锕(225Ac)、镨、砹(211At)、铼(186Re)、铋(212Bi或213Bi)、铟(111In)、锝(99mTc)、磷(32P)、铑(188Rh)、硫(35S)、碳(14C)、氚(3H)、铬(51Cr)、氯(36Cl)、钴(57Co或58Co)、铁(59Fe)、硒(75Se)或镓(67Ga)的部分。
毒素可以是蛋白质、多肽或肽，来源于细菌蛋白质(例如白喉毒素、假单胞菌外毒素(PE))和植物蛋白质(例如蓖麻毒蛋白A链(RTA))，而多花白树毒蛋白(gelonin)、美洲商陆抗病毒蛋白、皂草毒蛋白和商陆毒蛋白(dodecandron)等核糖体失活蛋白(RIP)，也可考虑用作毒素。
可以结合、废止、促进降解或阻止负责特定靶蛋白产生的mRNA的产生的反义核酸化合物，也可用作毒素。反义化合物包括反义RNA或DNA，单链或双链，寡核苷酸或其类似物，其可与单独的mRNA特异性杂交并阻止转录和/或mRNA的RNA加工和/或所编码多肽的翻译，并因而导致相应的所编码多肽数量下降。Ching等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.8610006-10010(1989)；Broder等，Ann.Int.Med.113604-618(1990)；Loreau等，FEBS Letters 27453-56(1990)；有用的反义治疗药包括例如VeglinTM(VasGene)和OGX-011(Oncogenix)。
毒素也可以是光敏剂。合适的光敏剂包括基于卟啉的物质，例如卟吩姆钠、绿卟啉、二氢卟酚E6、其血卟啉衍生物、酞菁、初红紫素(etiopurpurin)、德卟啉(texaphrin)等。
毒素可以是能结合胞内靶(例如胞内抗体)的抗体或抗体片段，例如能结合胞内靶的dAb。这样的抗体或抗体片段(dAb)可靶向指定亚细胞区室或靶。例如，抗体或抗体片段(dAb)可结合选自以下的胞内靶erbB2、EGFR、BCR-ABL、p21Ras、胱冬蛋白酶3、胱冬蛋白酶7、Bcl-2、p53、细胞周期蛋白E、ATF-1/CREB、HPV16 E7、HP1、IV型胶原酶、组织蛋白酶L以及以下文献所描述的其它胞内靶Kontermann，R.E.，Methods，34163-170(2004)，所述文献通过引用全部结合到本文中。
能结合VEGF的多肽域 本发明提供具有VEGF结合特异性结合位点的多肽域(例如免疫球蛋白单可变区、dAb单体)。在优选的实施方案中，经表面等离子共振测定，多肽域(例如dAb)与VEGF结合的亲和力(KD；KD＝K解离(kd)/K结合(ka))为300nM至1pM(即3 x 10-7M至5 x 10-12M)、优选50nM至1pM、更优选5nM至1pM、最优选1nM至1pM，例如KD为1 x 10-7M以下、优选1 x 10-8M以下、更优选1 x 10-9M以下、有利的是1 x 10-10M以下、最优选1 x 10-11M以下；和/或K解离速率常数为5 x 10-1s-1至1 x 10-7s-1、优选1 x 10-2s-1至1 x 10-6s-1、更优选5 x 10-3s-1至1 x 10-5s-1、例如5 x 10-1s-1以下、优选1 x 10-2s-1以下、有利的是1 x 10-3s-1以下、更优选1 x 10-4s-1以下、还更优选1 x 10-5s-1以下、最优选1 x 10-6s-1以下。
在某些实施方案中，具有VEGF结合特异性结合位点的多肽域与选自以下的dAb竞争性结合VEGFTAR15-1(SEQ ID NO100)、TAR15-3(SEQ ID NO101)、TAR15-4(SEQ ID NO102)、TAR15-9(SEQ ID NO103)、TAR15-10(SEQ ID NO104)、TAR15-11(SEQ IDNO105)、TAR15-12(SEQ ID NO106)、TAR15-13(SEQ ID NO107)、TAR15-14(SEQ ID NO108)、TAR15-15(SEQ ID NO109)、TAR15-16(SEQ ID NO110)、TAR15-17(SEQ ID NO111)、TAR15-18(SEQ IDNO112)、TAR15-19(SEQ ID NO113)、TAR15-20(SEQ ID NO114)、TAR15-22(SEQ ID NO115)、TAR15-5(SEQ ID NO116)、TAR15-6(SEQ ID NO117)、TAR15-7(SEQ ID NO118)、TAR15-8(SEQ IDNO119)、TAR15-23(SEQ ID NO120)、TAR15-24(SEQ ID NO121)、TAR15-25(SEQ ID NO122)、TAR15-26(SEQ ID NO123)、TAR15-27(SEQ ID NO124)、TAR15-29(SEQ ID NO125)、TAR15-30(SEQ IDNO126)、TAR15-6-500(SEQ ID NO127)、TAR15-6-501(SEQ IDNO128)、TAR15-6-502(SEQ ID NO129)、TAR15-6-503(SEQ IDNO130)、TAR15-6-504(SEQ ID NO131)、TAR15-6-505(SEQ IDNO132)、TAR15-6-506(SEQ ID NO133)、TAR15-6-507(SEQ IDNO134)、TAR15-6-508(SEQ ID NO135)、TAR15-6-509(SEQ IDNO136)、TAR15-6-510(SEQ ID NO137)、TAR15-8-500(SEQ IDNO138)、TAR15-8-501(SEQ ID NO139)、TAR15-8-502(SEQ IDNO140)、TAR15-8-503(SEQ ID NO141)、TAR15-8-505(SEQ IDNO142)、TAR15-8-506(SEQ ID NO143)、TAR15-8-507(SEQ IDNO144)、TAR15-8-508(SEQ ID NO145)、TAR15-8-509(SEQ IDNO146)、TAR15-8-510(SEQ ID NO147)、TAR15-8-511(SEQ IDNO148)、TAR15-26-500(SEQ ID NO149)、TAR15-26-501(SEQ IDNO150)、TAR15-26-502(SEQ ID NO151)、TAR15-26-503(SEQ IDNO152)、TAR15-26-504(SEQ ID NO153)、TAR15-26-505(SEQ IDNO154)、TAR15-26-506(SEQ ID NO155)、TAR15-26-507(SEQ IDNO156)、TAR15-26-508(SEQ ID NO157)、TAR15-26-509(SEQ IDNO158)、TAR15-26-510(SEQ ID NO159)、TAR15-26-511(SEQ IDNO160)、TAR15-26-512(SEQ ID NO161)、TAR15-26-513(SEQ IDNO162)、TAR15-26-514(SEQ ID NO163)、TAR15-26-515(SEQ IDNO164)、TAR15-26-516(SEQ ID NO165)、TAR15-26-517(SEQ IDNO166)、TAR15-26-518(SEQ ID NO167)、TAR15-26-519(SEQ IDNO168)、TAR15-26-520(SEQ ID NO169)、TAR15-26-521(SEQ IDNO170)、TAR15-26-522(SEQ ID NO171)、TAR15-26-523(SEQ IDNO172)、TAR15-26-524(SEQ ID NO173)、TAR15-26-525(SEQ IDNO174)、TAR15-26-526(SEQ ID NO175)、TAR15-26-527(SEQ IDNO176)、TAR15-26-528(SEQ ID NO177)、TAR15-26-529(SEQ IDNO178)、TAR15-26-530(SEQ ID NO179)、TAR15-26-531(SEQ IDNO180)、TAR15-26-532(SEQ ID NO181)、TAR15-26-533(SEQ IDNO182)、TAR15-26-534(SEQ ID NO183)、TAR15-26-535(SEQ IDNO184)、TAR15-26-536(SEQ ID NO185)、TAR15-26-537(SEQ IDNO186)、TAR15-26-538(SEQ ID NO187)、TAR15-26-539(SEQ IDNO188)、TAR15-26-540(SEQ ID NO189)、TAR15-26-541(SEQ IDNO190)、TAR15-26-542(SEQ ID NO191)、TAR15-26-543(SEQ IDNO192)、TAR15-26-544(SEQ ID NO193)、TAR15-26-545(SEQ IDNO194)、TAR15-26-546(SEQ ID NO195)、TAR15-26-547(SEQ IDNO196)、TAR15-26-548(SEQ ID NO197)、TAR15-26-549(SEQ IDNO198)、TAR15-26-550(SEQ ID NO539)和TAR15-26-551(SEQ IDNO540)。
在某些实施方案中，具有VEGF结合特异性结合位点的多肽域与TAR15-26-555(SEQ ID NO704)竞争性结合VEGF。
在某些实施方案中，具有VEGF结合特异性结合位点的多肽域包含的氨基酸序列与选自以下dAb的氨基酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％氨基酸序列同一性TAR15-1(SEQ ID NO100)、TAR15-3(SEQ ID NO101)、TAR15-4(SEQ ID NO102)、TAR15-9(SEQ IDNO103)、TAR15-10(SEQ ID NO104)、TAR15-11(SEQ ID NO105)、TAR15-12(SEQ ID NO106)、TAR15-13(SEQ ID NO107)、TAR15-14(SEQ ID NO108)、TAR15-15(SEQ ID NO109)、TAR15-16(SEQ IDNO110)、TAR15-17(SEQ ID NO111)、TAR15-18(SEQ ID NO112)、TAR15-19(SEQ ID NO113)、TAR15-20(SEQ ID NO114)、TAR15-22(SEQ ID NO115)、TAR15-5(SEQ ID NO116)、TAR15-6(SEQ IDNO117)、TAR15-7(SEQ ID NO118)、TAR15-8(SEQ ID NO119)、TAR15-23(SEQ ID NO120)、TAR15-24(SEQ ID NO121)、TAR15-25(SEQ ID NO122)、TAR15-26(SEQ ID NO123)、TAR15-27(SEQ IDNO124)、TAR15-29(SEQ ID NO125)、TAR15-30(SEQ ID NO126)、TAR15-6-500(SEQ ID NO127)、TAR15-6-501(SEQ ID NO128)、TAR15-6-502(SEQ ID NO129)、TAR15-6-503(SEQ ID NO130)、TAR15-6-504(SEQ ID NO131)、TAR15-6-505(SEQ ID NO132)、TAR15-6-506(SEQ ID NO133)、TAR15-6-507(SEQ ID NO134)、TAR15-6-508(SEQ ID NO135)、TAR15-6-509(SEQ ID NO136)、TAR15-6-510(SEQ ID NO137)、TAR15-8-500(SEQ ID NO138)、TAR15-8-501(SEQ ID NO139)、TAR15-8-502(SEQ ID NO140)、TAR15-8-503(SEQ ID NO141)、TAR15-8-505(SEQ ID NO142)、TAR15-8-506(SEQ ID NO143)、TAR15-8-507(SEQ ID NO144)、TAR15-8-508(SEQ ID NO145)、TAR15-8-509(SEQ ID NO146)、TAR15-8-510(SEQ ID NO147)、TAR15-8-511(SEQ ID NO148)、TAR15-26-500(SEQ ID NO149)、TAR15-26-501(SEQ ID NO150)、TAR15-26-502(SEQ ID NO151)、TAR15-26-503(SEQ ID NO152)、TAR15-26-504(SEQ ID NO153)、TAR15-26-505(SEQ ID NO154)、TAR15-26-506(SEQ ID NO155)、TAR15-26-507(SEQ ID NO156)、TAR15-26-508(SEQ ID NO157)、TAR15-26-509(SEQ ID NO158)、TAR15-26-510(SEQ ID NO159)、TAR15-26-511(SEQ ID NO160)、TAR15-26-512(SEQ ID NO161)、TAR15-26-513(SEQ ID NO162)、TAR15-26-514(SEQ ID NO163)、TAR15-26-515(SEQ ID NO164)、TAR15-26-516(SEQ ID NO165)、TAR15-26-517(SEQ ID NO166)、TAR15-26-518(SEQ ID NO167)、TAR15-26-519(SEQ ID NO168)、TAR15-26-520(SEQ ID NO169)、TAR15-26-521(SEQ ID NO170)、TAR15-26-522(SEQ ID NO171)、TAR15-26-523(SEQ ID NO172)、TAR15-26-524(SEQ ID NO173)、TAR15-26-525(SEQ ID NO174)、TAR15-26-526(SEQ ID NO175)、TAR15-26-527(SEQ ID NO176)、TAR15-26-528(SEQ ID NO177)、TAR15-26-529(SEQ ID NO178)、TAR15-26-530(SEQ ID NO179)、TAR15-26-531(SEQ ID NO180)、TAR15-26-532(SEQ ID NO181)、TAR15-26-533(SEQ ID NO182)、TAR15-26-534(SEQ ID NO183)、TAR15-26-535(SEQ ID NO184)、TAR15-26-536(SEQ ID NO185)、TAR15-26-537(SEQ ID NO186)、TAR15-26-538(SEQ ID NO187)、TAR15-26-539(SEQ ID NO188)、TAR15-26-540(SEQ ID NO189)、TAR15-26-541(SEQ ID NO190)、TAR15-26-542(SEQ ID NO191)、TAR15-26-543(SEQ ID NO192)、TAR15-26-544(SEQ ID NO193)、TAR15-26-545(SEQ ID NO194)、TAR15-26-546(SEQ ID NO195)、TAR15-26-547(SEQ ID NO196)、TAR15-26-548(SEQ ID NO197)、TAR15-26-549(SEQ ID NO198)、TAR15-26-550(SEQ ID NO539)和TAR15-26-551(SEQ ID NO540)。
在某些实施方案中，具有VEGF结合特异性结合位点的多肽域包含的氨基酸序列与TAR15-26-555(SEQ ID NO704)的氨基酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％氨基酸序列同一性。
在优选的实施方案中，具有VEGF结合特异性结合位点的多肽域包含的氨基酸序列与选自以下dAb的氨基酸序列具有至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％氨基酸序列同一性TAR15-6(SEQ ID NO117)、TAR15-8(SEQ ID NO119)和TAR15-26(SEQ ID NO123)。例如，具有VEGF结合特异性结合位点的多肽域可包含TAR15-6(SEQ ID NO117)、TAR15-8(SEQ ID NO119)或TAR15-26(SEQ ID NO123)。
在某些实施方案中，具有VEGF结合特异性结合位点的多肽域与本文公开的任何dAb竞争性结合VEGF。
优选具有VEGF结合特异性结合位点的多肽域是免疫球蛋白单可变区。具有VEGF结合特异性结合位点的多肽域可包含任何合适免疫球蛋白可变区，并且优选包含人可变区或包含人构架区的可变区。在某些实施方案中，具有VEGF结合特异性结合位点的多肽域包含本文所述的通用构架。
通用构架可以是VL构架(Vλ或Vκ)，例如包含由人种系DPK1、DPK2、DPK3、DPK4、DPK5、DPK6、DPK7、DPK8、DPK9、DPK10、DPK12、DPK13、DPK15、DPK16、DPK18、DPK19、DPK20、DPK21、DPK22、DPK23、DPK24、DPK25、DPK26或DPK28免疫球蛋白基因区段所编码的构架氨基酸序列的构架。如有必要，VL构架还可包含由人种系Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4或Jκ5免疫球蛋白基因区段所编码的构架氨基酸序列。
在其它实施方案中，通用构架可以是VH构架，例如包含由人种系DP4、DP7、DP8、DP9、DP10、DP31、DP33、DP38、DP45、DP46、DP47、DP49、DP50、DP51、DP53、DP54、DP65、DP66、DP67、DP68或DP69免疫球蛋白基因区段所编码的构架氨基酸序列的构架。如有必要，VH构架还可包含由人种系JH1、JH2、JH3、JH4、JH4b、JH5和JH6免疫球蛋白基因区段所编码的构架氨基酸序列。
在某些实施方案中，具有VEGF结合特异性结合位点的多肽域包含一个或多个构架区，其氨基酸序列与人种系抗体基因区段所编码的相应构架区的氨基酸序列相同，或者一个或多个所述构架区的氨基酸序列与由人种系抗体基因区段编码的所述相应构架区氨基酸序列相比具有总共至多5个氨基酸的差异。
在其它实施方案中，具有VEGF结合特异性结合位点的多肽域的FW1、FW2、FW3和FW4氨基酸序列，与人种系抗体基因区段所编码的相应构架区的氨基酸序列相同，或者FW1、FW2、FW3和FW4的氨基酸序列与由所述人种系抗体基因区段编码的相应构架区的氨基酸序列相比具有总共至多10个氨基酸的差异 在其它实施方案中，具有VEGF结合特异性结合位点的多肽域包含FW1、FW2和FW3区，而且所述FW1、FW2和FW3区的氨基酸序列与由人种系抗体基因区段编码的相应构架区的氨基酸序列相同。
在具体实施方案中，具有VEGF结合特异性结合位点的多肽域包含DPK9 VL构架或选自DP47、DP45和DP38的VH构架。具有VEGF结合特异性结合位点的多肽域可包含普通配体(例如蛋白A、蛋白L和蛋白G)的结合位点。
在某些实施方案中，具有VEGF结合特异性的结合位点的多肽域基本上能抵抗聚集。例如，在某些实施方案中，当将1-5mg/ml、5-10mg/ml、10-20mg/ml、20-50mg/ml、50-100mg/ml、100-200mg/ml或200-500mg/ml配体或dAb于药物配制常用溶剂(例如盐水、缓冲盐水、柠檬酸缓冲盐水、水、乳化剂和任何这些含有可接受的赋形剂的溶剂，所述赋形剂例如为由FDA批准的赋形剂)中的溶液在约22℃、22-25℃、25-30℃、30-37℃、37-40℃、40-50℃、50-60℃、60-70℃、70-80℃、15-20℃、10-15℃、5-10℃、2-5℃、0-2℃、-10℃至0℃、-20℃至-10℃、-40℃至-20℃、-60℃至-40℃或-80℃至-60℃的温度下保持一段时间(例如10分钟、1小时、8小时、24小时、2天、3天、4天、1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、6个月、1年或2年)时，具有VEGF结合特异性的结合位点的多肽域有小于约10％、小于约9％、小于约8％、小于约7％、小于约6％、小于约5％、小于约4％、小于约3％、小于约2％或小于约1％聚集。
可采用诸如显微镜检、通过目测或分光镜或任何其它合适的方法评价溶液浊度的任何合适方法，对聚集进行评价。优选通过动态光散射来评价聚集。抗聚集的、具有VEGF结合特异性结合位点的多肽域具有若干优势。例如，通过采用合适的生物生产系统(例如大肠杆菌)进行表达，容易高收率产生可溶性蛋白质的形式的这类具有VEGF结合特异性结合位点的多肽域，并可以比常规多肽更高的浓度来配制和/或贮存，几乎没有聚集和活性损失。
另外，可以比其它抗原或表位结合多肽(例如常规抗体)更经济地产生抗聚集的、具有VEGF结合特异性结合位点的多肽域。例如，一般而言，预期用于体内用途的抗原或表位结合多肽的配制包括除去聚集多肽的过程(例如凝胶过滤)。如果不能去除这样的聚集物，制备物就不适用于体内应用，因为例如预期起到拮抗剂作用的抗原结合多肽聚集物，可通过诱导靶抗原的交联或成簇而起到激动剂的作用。蛋白聚集还会通过在它们所给予的患者体内诱导免疫应答而降低治疗性多肽的功效。
相比之下，可以制备本发明的抗聚集的、具有VEGF结合特异性结合位点的多肽域，用于体内应用，而无需包括去除聚集物的加工步骤，并且可用于体内应用而没有由多肽聚集而引起的前述缺点。
在某些实施方案中，当加热到温度(Ts)并冷却至温度(Tc)时，具有VEGF结合特异性结合位点的多肽域能可逆地解折叠，其中Ts高于具有VEGF结合特异性结合位点的多肽域的解链温度(Tm)，而Tc低于具有VEGF结合特异性结合位点的多肽域的解链温度。例如，当加热到80℃并冷却至约室温时，具有VEGF结合特异性结合位点的多肽域能可逆地解折叠。可逆地解折叠的多肽在解折叠时会丧失功能，而一旦重折叠后又会恢复功能。这类多肽不同于在解折叠时聚集的多肽或不适当重折叠(即不能恢复功能)的多肽(错误折叠的多肽)。
可以采用任何合适方法，通过直接或间接测定多肽结构来评价多肽解折叠和重折叠。例如，可以通过圆二色性(CD)(例如远UV CD、近UV CD)、荧光(例如色氨酸侧链的荧光)、对蛋白酶解的敏感性、核磁共振(NMR)，或者通过检测或测定依赖于正确折叠的多肽功能(例如与靶配体的结合、与通用配体的结合)，来测定多肽结构。在一个实例中，采用功能测定评价多肽解折叠，其中结合功能(例如结合通用配体和/或靶配体、结合底物)的丧失表明该多肽是解折叠的。
可以采用解折叠或变性曲线，测定具有VEGF结合特异性结合位点的多肽域的解折叠和重折叠的程度。可通过纵坐标为温度与横坐标为折叠多肽相对浓度作图，绘制解折叠曲线。可以采用任何合适的方法(例如CD、荧光、结合测定)，直接或间接测定具有VEGF结合特异性的结合位点的折叠多肽域的相对浓度。例如，可以制备具有VEGF结合特异性的结合位点的多肽域溶液，并通过CD测定溶液的椭圆率。所得椭圆率值表示折叠配体(例如dAb单体)的相对浓度为100％。再通过逐渐升高溶液温度，使溶液中具有VEGF结合特异性的结合位点的多肽域解折叠，然后以合适增量(例如温度每升高一度后)测定椭圆率。然后通过逐渐降低溶液温度，使溶液中具有VEGF结合特异性的结合位点的多肽域重折叠，再以合适增量测定椭圆率。可以对数据作图，绘制解折叠曲线和重折叠曲线。解折叠曲线和重折叠曲线具有特征性的S形曲线，它包括其中具有VEGF结合特异性的结合位点的多肽域分子折叠的部分，其中具有VEGF结合特异性的结合位点的多肽域分子解折叠到不同程度的解折叠/重折叠转换部分，以及其中具有VEGF结合特异性的结合位点的多肽域解折叠的部分。重折叠曲线的Y轴截距是恢复的重折叠的具有VEGF结合特异性的结合位点的多肽域的相对数量。至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约75％、或至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％的恢复，表明配体或dAb单体可逆地解折叠。
在一个优选实施方案中，通过制备具有VEGF结合特异性的结合位点的多肽域溶液并绘制加热解折叠和重折叠曲线，测定具有VEGF结合特异性的结合位点的多肽域解折叠的可逆性。可以在任何合适溶剂中制备具有VEGF结合特异性的结合位点的多肽域溶液，所述溶剂例如为含水缓冲液，其pH适于让具有VEGF结合特异性的结合位点的多肽域溶解(例如pH比等电点(pI)高或低约3个单位)。具有VEGF结合特异性的结合位点的多肽域溶液足够浓，以便可检测出解折叠/折叠。例如，配体或dAb单体溶液可以为约0.1μM至约100μM、或优选约1μM至约10μM。
如果具有VEGF结合特异性的结合位点的多肽域的解链温度(Tm)是已知的，则可将溶液加热至比Tm低约10度(Tm-10)，然后通过椭圆率或荧光(例如从200nm至250nm的远UV CD扫描，于235nm或225nm的固定波长CD；于300-450nm的色氨酸荧光发射光谱和298nm的激发)评价折叠，以提供100％的相对折叠配体或dAb单体。再按预定增量(例如约0.1度至约1度的增加)，将溶液加热至比Tm高至少10度(Tm+10)，以每个增量测定椭圆率或荧光。然后，以预定增量通过冷却到至少Tm-10使具有VEGF结合特异性的结合位点的多肽域重折叠，并以每个增量测定椭圆率或荧光。如果不知道具有VEGF结合特异性的结合位点的多肽域的解链温度，则可以通过从约25℃至约100℃递增加热，使溶液解折叠，再递增冷却到至少约25℃使其重折叠，以每个加热和冷却增量测定椭圆率或荧光。可以对所得数据作图，绘制解折叠曲线和重折叠曲线，其中重折叠曲线的Y轴截距是恢复的重折叠蛋白质的相对数量。在某些实施方案中，具有VEGF结合特异性的结合位点的多肽域不含骆驼科动物免疫球蛋白可变区，或者不含骆驼科动物种系抗体基因区段所编码的免疫球蛋白可变区所特有的一个或多个构架氨基酸。
优选地，具有VEGF结合特异性的结合位点的多肽域当在大肠杆菌(E.coli)或毕赤酵母(Pichia sp.)(例如巴斯德毕赤酵母(P.pastoris))中表达时，其分泌量为至少约0.5mg/L。在其它优选的实施方案中，当在大肠杆菌或毕赤酵母(例如巴斯德毕赤酵母)中表达时，具有VEGF结合特异性的结合位点的多肽域的分泌量为至少约0.75mg/L、至少约1mg/L、至少约4mg/L、至少约5mg/L、至少约10mg/L、至少约15mg/L、至少约20mg/L、至少约25mg/L、至少约30mg/L、至少约35mg/L、至少约40mg/L、至少约45mg/L、或至少约50mg/L、或至少约100mg/L、或至少约200mg/L、或至少约300mg/L、或至少约400mg/L、或至少约500mg/L、或至少约600mg/L、或至少约700mg/L、或至少约800mg/L、至少约900mg/L、或至少约1g/L。在其它优选的实施方案中，当在大肠杆菌或毕赤酵母(例如巴斯德毕赤酵母)中表达时，具有VEGF结合特异性的结合位点的多肽域的分泌量为至少约1mg/L到至少约1g/L、至少约1mg/L到至少约750mg/L、至少约100mg/L到至少约1g/L、至少约200mg/L到至少约1g/L、至少约300mg/L到至少约1g/L、至少约400mg/L到至少约1g/L、至少约500mg/L到至少约1g/L、至少约600mg/L到至少约1g/L、至少约700mg/L到至少约1g/L、至少约800mg/L到至少约1g/L、或至少约900mg/L到至少约1g/L。尽管在大肠杆菌或毕赤酵母(例如巴斯德毕赤酵母)中表达时，本文所述的具有VEGF结合特异性的结合位点的多肽域可为可分泌的，但是它们也可以采用任何合适方法来制备，例如不需要用大肠杆菌或毕赤酵母的合成化学方法或生物学制备方法。
能结合EGFR的多肽域 本发明提供具有EGFR结合特异性结合位点的多肽域(例如dAb)。在优选的实施方案中，经表面等离子共振测定，多肽域(例如dAb)与EGFR结合的亲和力(KD；KD＝K解离(kd)/K结合(ka))为300nM至1pM(即3 x 10-7M至5 x 10-12M)、优选100nM至1pM、或50nM至10pM、更优选10nM至100pM、最优选约1nM，例如KD为1 x 10-7M以下、优选1 x 10-8M以下、更优选约1 x 10-9M以下、1 x 10-10M以下或1 x 10-11M以下；和/或K解离速率常数为5 x 10-1s-1至1 x 10-7s-1、优选1 x 10-2s-1至1 x 10-6s-1、更优选5 x 10-3s-1至1 x 10-5s-1、例如5 x 10-1s-1以下、优选1 x 10-2s-1以下、有利的是1 x 10-3s-1以下、更优选1 x 10-4s-1以下、还更优选1 x 10-5s-1以下、最优选1 x 10-6s-1以下。
在某些实施方案中，具有EGFR结合特异性结合位点的多肽域与选自以下的dAb竞争性结合EGFRDOM16-17(SEQ ID NO325)、DOM16-18(SEQ ID NO326)、DOM16-19(SEQ ID NO327)、DOM16-20(SEQ ID NO328)、DOM16-21(SEQ ID NO329)、DOM16-22(SEQ ID NO330)、DOM16-23(SEQ ID NO331)、DOM16-24(SEQ ID NO332)、DOM16-25(SEQ ID NO333)、DOM16-26(SEQ ID NO334)、DOM16-27(SEQ ID NO335)、DOM16-28(SEQ ID NO336)、DOM16-29(SEQ ID NO337)、DOM16-30(SEQ ID NO338)、DOM16-31(SEQ ID NO339)、DOM16-32(SEQ ID NO340)、DOM16-33(SEQ ID NO341)、DOM16-35(SEQ ID NO342)、DOM16-37(SEQ ID NO343)、DOM16-38(SEQ ID NO344)、DOM16-39(SEQ ID NO345)、DOM16-40(SEQ ID NO346)、DOM16-41(SEQ ID NO347)、DOM16-42(SEQ ID NO348)、DOM16-43(SEQ ID NO349)、DOM16-44(SEQ ID NO350)、DOM16-45(SEQ ID NO351)、DOM16-46(SEQ ID NO352)、DOM16-47(SEQ ID NO353)、DOM16-48(SEQ ID NO354)、DOM16-49(SEQ ID NO355)、DOM16-50(SEQ ID NO356)、DOM16-59(SEQ ID NO357)、DOM16-60(SEQ ID NO358)、DOM16-61(SEQ ID NO359)、DOM16-62(SEQ ID NO360)、DOM16-63(SEQ ID NO361)、DOM16-64(SEQ ID NO362)、DOM16-65(SEQ ID NO363)、DOM16-66(SEQ ID NO364)、DOM16-67(SEQ ID NO365)、DOM16-68(SEQ ID NO366)、DOM16-69(SEQ ID NO367)、DOM16-70(SEQ ID NO368)、DOM16-71(SEQ ID NO369)、DOM16-72(SEQ ID NO370)、DOM16-73(SEQ ID NO371)、DOM16-74(SEQ ID NO372)、DOM16-75(SEQ ID NO373)、DOM16-76(SEQ ID NO374)、DOM16-77(SEQ ID NO375)、DOM16-78(SEQ ID NO376)、DOM16-79(SEQ ID NO377)、DOM16-80(SEQ ID NO378)、DOM16-81(SEQ ID NO379)、DOM16-82(SEQ ID NO380)、DOM16-83(SEQ ID NO381)、DOM16-84(SEQ ID NO382)、DOM16-85(SEQ ID NO383)、DOM16-87(SEQ ID NO384)、DOM16-88(SEQ ID NO385)、DOM16-89(SEQ ID NO386)、DOM16-90(SEQ ID NO387)、DOM16-91(SEQ ID NO388)、DOM16-92(SEQ ID NO389)、DOM16-94(SEQ ID NO390)、DOM16-95(SEQ ID NO391)、DOM16-96(SEQ ID NO392)、DOM16-97(SEQ ID NO393)、DOM16-98(SEQ ID NO394)、DOM16-99(SEQ ID NO395)、DOM16-100(SEQ ID NO396)、DOM16-101(SEQ ID NO397)、DOM16-102(SEQ ID NO398)、DOM16-103(SEQ ID NO399)、DOM16-104(SEQ ID NO400)、DOM16-105(SEQ ID NO401)、DOM16-106(SEQ ID NO402)、DOM16-107(SEQ ID NO403)、DOM16-108(SEQ ID NO404)、DOM16-109(SEQ ID NO405)、DOM16-110(SEQ ID NO406)、DOM16-111(SEQ ID NO407)、DOM16-112(SEQ ID NO408)、DOM16-113(SEQ ID NO409)、DOM16-114(SEQ ID NO410)、DOM16-115(SEQ ID NO411)、DOM16-116(SEQ ID NO412)、DOM16-117(SEQ ID NO413)、DOM16-118(SEQ ID NO414)、DOM16-119(SEQ ID NO415)、DOM16-39-6(SEQ ID NO416)、DOM16-39-8(SEQ ID NO417)、DOM16-39-34(SEQ ID NO418)、DOM16-39-48(SEQ ID NO419)、DOM16-39-87(SEQ ID NO420)、DOM16-39-90(SEQ ID NO421)、DOM16-39-96(SEQ ID NO422)、DOM16-39-100(SEQ ID NO423)、DOM16-39-101(SEQ ID NO424)、DOM16-39-102(SEQ ID NO425)、DOM16-39-103(SEQ ID NO426)、DOM16-39-104(SEQ ID NO427)、DOM16-39-105(SEQ ID NO428)、DOM16-39-106(SEQ ID NO429)、DOM16-39-107(SEQ ID NO430)、DOM16-39-108(SEQ ID NO431)、DOM16-39-109(SEQ ID NO432)、DOM16-39-110(SEQ ID NO433)、DOM16-39-111(SEQ ID NO434)、DOM16-39-112(SEQ ID NO435)、DOM16-39-113(SEQ ID NO436)、DOM16-39-114(SEQ ID NO437)、DOM16-39-115(SEQ ID NO438)、DOM16-39-116(SEQ ID NO439)、DOM16-39-117(SEQ ID NO440)、DOM16-39-200(SEQ ID NO441)、DOM16-39-201(SEQ ID NO442)、DOM16-39-202(SEQ ID NO443)、DOM16-39-203(SEQ ID NO444)、DOM16-39-204(SEQ ID NO445)、DOM16-39-205(SEQ ID NO446)、DOM16-39-206(SEQ ID NO447)、DOM16-39-207(SEQ ID NO448)、DOM16-39-209(SEQ ID NO449)、DOM16-52(SEQ ID NO450)、NB1(SEQ ID NO451)、NB2(SEQ IDNO452)、NB3(SEQ ID NO453)、NB4(SEQ ID NO454)、NB5(SEQ IDNO455)、NB6(SEQ ID NO456)、NB7(SEQ ID NO457)、NB8(SEQ IDNO458)、NB9(SEQ ID NO459)、NB10(SEQ ID NO460)、NB11(SEQID NO461)、NB12(SEQ ID NO462)、NB13(SEQ ID NO463)、NB14(SEQ ID NO464)、NB15(SEQ ID NO465)、NB16(SEQ ID NO466)、NB17(SEQ ID NO467)、NB18(SEQ ID NO468)、NB19(SEQ IDNO469)、NB20(SEQ ID NO470)、NB21(SEQ ID NO471)和NB22(SEQ ID NO472)。
在某些实施方案中，具有EGFR结合特异性结合位点的多肽域与选自以下的dAb竞争性结合EGFRDOM16-39-210(SEQ ID NO541)、DOM16-39-211(SEQ ID NO542)、DOM16-39-212(SEQ ID NO543)、DOM16-39-213(SEQ ID NO544)、DOM16-39-214(SEQ ID NO545)、DOM16-39-215(SEQ ID NO546)、DOM16-39-216(SEQ ID NO547)、DOM16-39-217(SEQ ID NO548)、DOM16-39-218(SEQ ID NO549)、DOM16-39-219(SEQ ID NO550)、DOM16-39-220(SEQ ID NO551)、DOM16-39-221(SEQ ID NO552)、DOM16-39-222(SEQ ID NO553)、DOM16-39-223(SEQ ID NO554)、DOM16-39-224(SEQ ID NO555)、DOM16-39-225(SEQ ID NO556)、DOM16-39-226(SEQ ID NO557)、DOM16-39-227(SEQ ID NO558)、DOM16-39-228(SEQ ID NO559)、DOM16-39-229(SEQ ID NO560)、DOM16-39-230(SEQ ID NO561)、DOM16-39-231(SEQ ID NO562)、DOM16-39-232(SEQ ID NO563)、DOM16-39-233(SEQ ID NO564)、DOM16-39-234(SEQ ID NO565)、DOM16-39-235(SEQ ID NO566)、DOM16-39-500(SEQ ID NO725)、DOM16-39-502(SEQ ID NO726)、DOM16-39-503(SEQ ID NO567)、DOM16-39-504(SEQ ID NO568)、DOM16-39-505(SEQ ID NO569)、DOM16-39-506(SEQ ID NO570)、DOM16-39-507(SEQ ID NO571)、DOM16-39-508(SEQ ID NO572)、DOM16-39-509(SEQ ID NO573)、DOM16-39-510(SEQ ID NO574)、DOM16-39-511(SEQ ID NO575)、DOM16-39-512(SEQ ID NO576)、DOM16-39-521(SEQ ID NO577)、DOM16-39-522(SEQ ID NO578)、DOM16-39-523(SEQ ID NO579)、DOM16-39-524(SEQ ID NO580)、DOM16-39-527(SEQ ID NO581)、DOM16-39-525(SEQ ID NO582)、DOM16-39-526(SEQ ID NO583)、DOM16-39-540(SEQ ID NO584)、DOM16-39-541(SEQ ID NO585)、DOM16-39-542(SEQ ID NO586)、DOM16-39-543(SEQ ID NO587)、DOM16-39-544(SEQ ID NO588)、DOM16-39-545(SEQ ID NO589)、DOM16-39-550(SEQ ID NO590)、DOM16-39-551(SEQ ID NO591)、DOM16-39-552(SEQ ID NO592)、DOM16-39-553(SEQ ID NO593)、DOM16-39-554(SEQ ID NO594)、DOM16-39-555(SEQ ID NO595)、DOM16-39-561(SEQ ID NO596)、DOM16-39-562(SEQ ID NO597)、DOM16-39-563(SEQ ID NO598)、DOM16-39-564(SEQ ID NO599)、DOM16-39-571(SEQ ID NO600)、DOM16-39-572(SEQ ID NO601)、DOM16-39-573(SEQ ID NO602)、DOM16-39-574(SEQ ID NO603)、DOM16-39-580(SEQ ID NO604)、DOM16-39-591(SEQ ID NO605)、DOM16-39-592(SEQ ID NO606)、DOM16-39-593(SEQ ID NO607)、DOM16-39-601(SEQ ID NO608)、DOM16-39-602(SEQ ID NO609)、DOM16-39-603(SEQ ID NO610)、DOM16-39-604(SEQ ID NO611)、DOM16-39-605(SEQ ID NO612)、DOM16-39-607(SEQ ID NO613)、DOM16-39-611(SEQ ID NO614)、DOM16-39-612(SEQ ID NO615)、DOM16-39-613(SEQ ID NO616)、DOM16-39-614(SEQ ID NO617)、DOM16-39-615(SEQ ID NO618)、DOM16-39-616(SEQ ID NO619)、DOM16-39-617(SEQ ID NO620)、DOM16-39-618(SEQ ID NO621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO622)。
在某些实施方案中，具有EGFR结合特异性结合位点的多肽域包含的氨基酸序列与选自以下dAb的氨基酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％氨基酸序列同一性DOM16-17(SEQ ID NO325)、DOM16-18(SEQ ID NO326)、DOM16-19(SEQ ID NO327)、DOM16-20(SEQ IDNO328)、DOM16-21(SEQ ID NO329)、DOM16-22(SEQ ID NO330)、DOM16-23(SEQ ID NO331)、DOM16-24(SEQ ID NO332)、DOM16-25(SEQ ID NO333)、DOM16-26(SEQ ID NO334)、DOM16-27(SEQ ID NO335)、DOM16-28(SEQ ID NO336)、DOM16-29(SEQ ID NO337)、DOM16-30(SEQ ID NO338)、DOM16-31(SEQ ID NO339)、DOM16-32(SEQ ID NO340)、DOM16-33(SEQ ID NO341)、DOM16-35(SEQ ID NO342)、DOM16-37(SEQ ID NO343)、DOM16-38(SEQ ID NO344)、DOM16-39(SEQ ID NO345)、DOM16-40(SEQ ID NO346)、DOM16-41(SEQ ID NO347)、DOM16-42(SEQ ID NO348)、DOM16-43(SEQ ID NO349)、DOM16-44(SEQ ID NO350)、DOM16-45(SEQ ID NO351)、DOM16-46(SEQ ID NO352)、DOM16-47(SEQ ID NO353)、DOM16-48(SEQ ID NO354)、DOM16-49(SEQ ID NO355)、DOM16-50(SEQ ID NO356)、DOM16-59(SEQ ID NO357)、DOM16-60(SEQ ID NO358)、DOM16-61(SEQ ID NO359)、DOM16-62(SEQ ID NO360)、DOM16-63(SEQ ID NO361)、DOM16-64(SEQ ID NO362)、DOM16-65(SEQ ID NO363)、DOM16-66(SEQ ID NO364)、DOM16-67(SEQ ID NO365)、DOM16-68(SEQ ID NO366)、DOM16-69(SEQ ID NO367)、DOM16-70(SEQ ID NO368)、DOM16-71(SEQ ID NO369)、DOM16-72(SEQ ID NO370)、DOM16-73(SEQ ID NO371)、DOM16-74(SEQ ID NO372)、DOM16-75(SEQ ID NO373)、DOM16-76(SEQ ID NO374)、DOM16-77(SEQ ID NO375)、DOM16-78(SEQ ID NO376)、DOM16-79(SEQ ID NO377)、DOM16-80(SEQ ID NO378)、DOM16-81(SEQ ID NO379)、DOM16-82(SEQ ID NO380)、DOM16-83(SEQ ID NO381)、DOM16-84(SEQ ID NO382)、DOM16-85(SEQ ID NO383)、DOM16-87(SEQ ID NO384)、DOM16-88(SEQ ID NO385)、DOM16-89(SEQ ID NO386)、DOM16-90(SEQ ID NO387)、DOM16-91(SEQ ID NO388)、DOM16-92(SEQ ID NO389)、DOM16-94(SEQ ID NO390)、DOM16-95(SEQ ID NO391)、DOM16-96(SEQ ID NO392)、DOM16-97(SEQ ID NO393)、DOM16-98(SEQ ID NO394)、DOM16-99(SEQ ID NO395)、DOM16-100(SEQ ID NO396)、DOM16-101(SEQ ID NO397)、DOM16-102(SEQ ID NO398)、DOM16-103(SEQ ID NO399)、DOM16-104(SEQ ID NO400)、DOM16-105(SEQ ID NO401)、DOM16-106(SEQ ID NO402)、DOM16-107(SEQ ID NO403)、DOM16-108(SEQ ID NO404)、DOM16-109(SEQ ID NO405)、DOM16-110(SEQ ID NO406)、DOM16-111(SEQ ID NO407)、DOM16-112(SEQ ID NO408)、DOM16-113(SEQ ID NO409)、DOM16-114(SEQ ID NO410)、DOM16-115(SEQ ID NO411)、DOM16-116(SEQ ID NO412)、DOM16-117(SEQ ID NO413)、DOM16-118(SEQ ID NO414)、DOM16-119(SEQ ID NO415)、DOM16-39-6(SEQ ID NO416)、DOM16-39-8(SEQ ID NO417)、DOM16-39-34(SEQ ID NO418)、DOM16-39-48(SEQ ID NO419)、DOM16-39-87(SEQ ID NO420)、DOM16-39-90(SEQ ID NO421)、DOM16-39-96(SEQ ID NO422)、DOM16-39-100(SEQ ID NO423)、DOM16-39-101(SEQ ID NO424)、DOM16-39-102(SEQ ID NO425)、DOM16-39-103(SEQ ID NO426)、DOM16-39-104(SEQ ID NO427)、DOM16-39-105(SEQ ID NO428)、DOM16-39-106(SEQ ID NO429)、DOM16-39-107(SEQ ID NO430)、DOM16-39-108(SEQ ID NO431)、DOM16-39-109(SEQ ID NO432)、DOM16-39-110(SEQ ID NO433)、DOM16-39-111(SEQ ID NO434)、DOM16-39-112(SEQ ID NO435)、DOM16-39-113(SEQ ID NO436)、DOM16-39-114(SEQ ID NO437)、DOM16-39-115(SEQ ID NO438)、DOM16-39-116(SEQ ID NO439)、DOM16-39-117(SEQ ID NO440)、DOM16-39-200(SEQ ID NO441)、DOM16-39-201(SEQ ID NO442)、DOM16-39-202(SEQ ID NO443)、DOM16-39-203(SEQ ID NO444)、DOM16-39-204(SEQ ID NO445)、DOM16-39-205(SEQ ID NO446)、DOM16-39-206(SEQ ID NO447)、DOM16-39-207(SEQ ID NO448)、DOM16-39-209(SEQ ID NO449)、DOM16-52(SEQ ID NO450)、NB1(SEQ ID NO451)、NB2(SEQ ID NO452)、NB3(SEQ ID NO453)、NB4(SEQ ID NO454)、NB5(SEQ ID NO455)、NB6(SEQ ID NO456)、NB7(SEQ ID NO457)、NB8(SEQ ID NO458)、NB9(SEQ ID NO459)、NB10(SEQ ID NO460)、NB11(SEQ ID NO461)、NB12(SEQ IDNO462)、NB13(SEQ ID NO463)、NB14(SEQ ID NO464)、NB15(SEQID NO465)、NB16(SEQ ID NO466)、NB17(SEQ ID NO467)、NB18(SEQ ID NO468)、NB19(SEQ ID NO469)、NB20(SEQ ID NO470)、NB21(SEQ ID NO471)和NB22(SEQ ID NO472)。
在某些实施方案中，具有EGFR结合特异性结合位点的多肽域包含的氨基酸序列与选自以下dAb的氨基酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％氨基酸序列同一性DOM16-39-210(SEQ ID NO541)、DOM16-39-211(SEQ ID NO542)、DOM16-39-212(SEQ ID NO543)、DOM16-39-213(SEQ ID NO544)、DOM16-39-214(SEQ ID NO545)、DOM16-39-215(SEQ ID NO546)、DOM16-39-216(SEQ ID NO547)、DOM16-39-217(SEQ ID NO548)、DOM16-39-218(SEQ ID NO549)、DOM16-39-219(SEQ ID NO550)、DOM16-39-220(SEQ ID NO551)、DOM16-39-221(SEQ ID NO552)、DOM16-39-222(SEQ ID NO553)、DOM16-39-223(SEQ ID NO554)、DOM16-39-224(SEQ ID NO555)、DOM16-39-225(SEQ ID NO556)、DOM16-39-226(SEQ ID NO557)、DOM16-39-227(SEQ ID NO558)、DOM16-39-228(SEQ ID NO559)、DOM16-39-229(SEQ ID NO560)、DOM16-39-230(SEQ ID NO561)、DOM16-39-231(SEQ ID NO562)、DOM16-39-232(SEQ ID NO563)、DOM16-39-233(SEQ ID NO564)、DOM16-39-234(SEQ ID NO565)、DOM16-39-235(SEQ ID NO566)、DOM16-39-500(SEQ ID NO725)、DOM16-39-502(SEQ ID NO726)、DOM16-39-503(SEQ ID NO567)、DOM16-39-504(SEQ ID NO568)、DOM16-39-505(SEQ ID NO569)、DOM16-39-506(SEQ ID NO570)、DOM16-39-507(SEQ ID NO571)、DOM16-39-508(SEQ ID NO572)、DOM16-39-509(SEQ ID NO573)、DOM16-39-510(SEQ ID NO574)、DOM16-39-511(SEQ ID NO575)、DOM16-39-512(SEQ ID NO576)、DOM16-39-521(SEQ ID NO577)、DOM16-39-522(SEQ ID NO578)、DOM16-39-523(SEQ ID NO579)、DOM16-39-524(SEQ ID NO580)、DOM16-39-527(SEQ ID NO581)、DOM16-39-525(SEQ ID NO582)、DOM16-39-526(SEQ ID NO583)、DOM16-39-540(SEQ ID NO584)、DOM16-39-541(SEQ ID NO585)、DOM16-39-542(SEQ ID NO586)、DOM16-39-543(SEQ ID NO587)、DOM16-39-544(SEQ ID NO588)、DOM16-39-545(SEQ ID NO589)、DOM16-39-550(SEQ ID NO590)、DOM16-39-551(SEQ ID NO591)、DOM16-39-552(SEQ ID NO592)、DOM16-39-553(SEQ ID NO593)、DOM16-39-554(SEQ ID NO594)、DOM16-39-555(SEQ ID NO595)、DOM16-39-561(SEQ ID NO596)、DOM16-39-562(SEQ ID NO597)、DOM16-39-563(SEQ ID NO598)、DOM16-39-564(SEQ ID NO599)、DOM16-39-571(SEQ ID NO600)、DOM16-39-572(SEQ ID NO601)、DOM16-39-573(SEQ ID NO602)、DOM16-39-574(SEQ ID NO603)、DOM16-39-580(SEQ ID NO604)、DOM16-39-591(SEQ ID NO605)、DOM16-39-592(SEQ ID NO606)、DOM16-39-593(SEQ ID NO607)、DOM16-39-601(SEQ ID NO608)、DOM16-39-602(SEQ ID NO609)、DOM16-39-603(SEQ ID NO610)、DOM16-39-604(SEQ ID NO611)、DOM16-39-605(SEQ ID NO612)、DOM16-39-607(SEQ ID NO613)、DOM16-39-611(SEQ ID NO614)、DOM16-39-612(SEQ ID NO615)、DOM16-39-613(SEQ ID NO616)、DOM16-39-614(SEQ ID NO617)、DOM16-39-615(SEQ ID NO618)、DOM16-39-616(SEQ ID NO619)、DOM16-39-617(SEQ ID NO620)、DOM16-39-618(SEQ ID NO621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO622)。
在优选的实施方案中，具有EGFR结合特异性结合位点的多肽域包含的氨基酸序列与DOM16-39(SEQ ID NO345)的氨基酸序列具有至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％氨基酸序列同一性。例如，具有EGFR结合特异性结合位点的多肽域可包含DOM16-39-87(SEQ ID NO420)、DOM16-39-100(SEQ IDNO423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO430)、DOM16-39-109(SEQ IDNO432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO438)或DOM16-39-200(SEQ IDNO441)的氨基酸序列。
在其它优选的实施方案中，具有EGFR结合特异性结合位点的多肽域包含的氨基酸序列与以下的氨基酸序列具有至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％氨基酸序列同一性DOM16-39-521(SEQ ID NO577)、DOM16-39-541(SEQ ID NO585)、DOM16-39-542(SEQ ID NO586)、DOM16-39-551(SEQ ID NO591)、DOM16-39-601(SEQ ID NO608)、DOM16-39-604(SEQ ID NO611)、DOM16-39-618(SEQ ID NO621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO622)。
在某些实施方案中，具有EGFR结合特异性结合位点的多肽域与本文公开的任何dAb竞争性结合EGFR。
优选具有EGFR结合特异性结合位点的多肽域是免疫球蛋白单可变区。具有EGFR结合特异性结合位点的多肽域可包含任何合适的免疫球蛋白可变区，并且优选包含人可变区或包含人构架区的可变区。在某些实施方案中，具有EGFR结合特异性结合位点的多肽域包含本文所述的通用构架。
在某些实施方案中，具有EGFR结合特异性结合位点的多肽域能抵抗聚集，可逆地解折叠，并且包含构架区和/或如上所述地分泌具有VEGF结合特异性结合位点的多肽域。
能结合血清白蛋白的dAb单体 本发明的配体还可包含dAb单体，其结合血清白蛋白(SA)的Kd为1nM至500μM(即x 10-9至5 x 10-4)、优选100nM至10μM。优选地，对于含有抗SA dAb的配体来说，配体与其靶标的结合(例如通过表面等离子共振(例如使用BiaCore)测定的Kd和/或K解离)比SA强1-100000倍(优选100-100000倍、更优选1000-100000倍、或10000-100000倍)。优选地，血清白蛋白为人血清白蛋白(HSA)。在一个实施方案中，第一dAb(或dAb单体)与SA(例如HSA)结合的Kd约为50nM、优选70nM、更优选100nM、150nM或200nM。
在某些实施方案中，如以上对结合CD38的dAb单体的描述，结合SA的dAb单体能抵抗聚集、可逆地解折叠和/或包含构架区。
在具体的实施方案中，结合血清白蛋白的抗体的抗原结合片段是结合人血清白蛋白的dAb。在某些实施方案中，dAb结合人血清白蛋白，并与选自以下的dAb竞争性结合白蛋白DOM7m-16(SEQ ID NO473)、DOM7m-12(SEQ ID NO474)、DOM7m-26(SEQ ID NO475)、DOM7r-1(SEQ ID NO476)、DOM7r-3(SEQ ID NO477)、DOM7r-4(SEQ ID NO478)、DOM7r-5(SEQ ID NO479)、DOM7r-7(SEQ ID NO480)、DOM7r-8(SEQ ID NO481)、DOM7h-2(SEQ ID NO482)、DOM7h-3(SEQ ID NO483)、DOM7h-4(SEQ ID NO484)、DOM7h-6(SEQ ID NO485)、DOM7h-1(SEQ ID NO486)、DOM7h-7(SEQ IDNO487)、DOM7h-22(SEQ ID NO489)、DOM7h-23(SEQ ID NO490)、DOM7h-24(SEQ ID NO491)、DOM7h-25(SEQ ID NO492)、DOM7h-26(SEQ ID NO493)、DOM7h-21(SEQ ID NO494)、DOM7h-27(SEQ ID NO495)、DOM7h-8(SEQ ID NO496)、DOM7r-13(SEQ ID NO497)、DOM7r-14(SEQ ID NO498)、DOM7r-15(SEQ ID NO499)、DOM7r-16(SEQ ID NO500)、DOM7r-17(SEQ ID NO501)、DOM7r-18(SEQ ID NO502)、DOM7r-19(SEQ ID NO503)、DOM7r-20(SEQ ID NO504)、DOM7r-21(SEQ ID NO505)、DOM7r-22(SEQ ID NO506)、DOM7r-23(SEQ ID NO507)、DOM7r-24(SEQ ID NO508)、DOM7r-25(SEQ ID NO509)、DOM7r-26(SEQ ID NO510)、DOM7r-27(SEQ ID NO511)、DOM7r-28(SEQ ID NO512)、DOM7r-29(SEQ ID NO513)、DOM7r-30(SEQ ID NO514)、DOM7r-31(SEQ ID NO515)、DOM7r-32(SEQ ID NO516)和DOM7r-33(SEQ ID NO517)。
在某些实施方案中，dAb结合人血清白蛋白，其含有的氨基酸序列与选自以下dAb的氨基酸序列具有至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％或至少约99％氨基酸序列同一性DOM7m-16(SEQ ID NO473)、DOM7m-12(SEQ ID NO474)、DOM7m-26(SEQ ID NO475)、DOM7r-1(SEQ ID NO476)、DOM7r-3(SEQ ID NO477)、DOM7r-4(SEQ ID NO478)、DOM7r-5(SEQ ID NO479)、DOM7r-7(SEQ ID NO480)、DOM7r-8(SEQ ID NO481)、DOM7h-2(SEQ ID NO482)、DOM7h-3(SEQ ID NO483)、DOM7h-4(SEQ ID NO484)、DOM7h-6(SEQ ID NO485)、DOM7h-1(SEQ ID NO486)、DOM7h-7(SEQ IDNO487)、DOM7h-22(SEQ ID NO489)、DOM7h-23(SEQ ID NO490)、DOM7h-24(SEQ ID NO491)、DOM7h-25(SEQ ID NO492)、DOM7h-26(SEQ ID NO493)、DOM7h-21(SEQ ID NO494)、DOM7h-27(SEQ ID NO495)、DOM7h-8(SEQ ID NO496)、DOM7r-13(SEQ ID NO497)、DOM7r-14(SEQ ID NO498)、DOM7r-15(SEQ ID NO499)、DOM7r-16(SEQ ID NO500)、DOM7r-17(SEQ ID NO501)、DOM7r-18(SEQ ID NO502)、DOM7r-19(SEQ ID NO503)、DOM7r-20(SEQ ID NO504)、DOM7r-21(SEQ ID NO505)、DOM7r-22(SEQ ID NO506)、DOM7r-23(SEQ ID NO507)、DOM7r-24(SEQ ID NO508)、DOM7r-25(SEQ ID NO509)、DOM7r-26(SEQ ID NO510)、DOM7r-27(SEQ ID NO511)、DOM7r-28(SEQ ID NO512)、DOM7r-29(SEQ ID NO513)、DOM7r-30(SEQ ID NO514)、DOM7r-31(SEQ ID NO515)、DOM7r-32(SEQ ID NO516)和DOM7r-33(SEQ ID NO517)。
例如，结合人血清白蛋白的dAb含有的氨基酸序列与以下序列具有至少约90％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％或至少约99％的氨基酸序列同一性DOM7h-2(SEQ IDNO482)、DOM7h-3(SEQ ID NO483)、DOM7h-4(SEQ ID NO484)、DOM7h-6(SEQ ID NO485)、DOM7h-1(SEQ ID NO486)、DOM7h-7(SEQ ID NO487)、DOM7h-8(SEQ ID NO496)、DOM7r-13(SEQ IDNO497)、DOM7r-14(SEQ ID NO498)、DOM7h-22(SEQ ID NO489)、DOM7h-23(SEQ ID NO490)、DOM7h-24(SEQ ID NO491)、DOM7h-25(SEQ ID NO492)、DOM7h-26(SEQ ID NO493)、DOM7h-21(SEQ ID NO494)和DOM7h-27(SEQ ID NO495)。
氨基酸序列同一性优选使用合适的序列比对算法和默认参数进行测定，例如BLAST P(Karlin和Altschul、Proc.Natl.Acad.Sci.USA87(6)2264-2268(1990))。
在更具体的实施方案中，dAb是结合人血清白蛋白并具有选自以下的氨基酸序列的Vκ dAbDOM7h-2(SEQ ID NO482)、DOM7h-3(SEQ ID NO483)、DOM7h-4(SEQ ID NO484)、DOM7h-6(SEQ IDNO485)、DOM7h-1(SEQ ID NO486)、DOM7h-7(SEQ ID NO487)、DOM7h-8(SEQ ID NO496)、DOM7r-13(SEQ ID NO497)和DOM7r-14(SEQ ID NO498)，或者具有选自以下的氨基酸序列的VH dAbDOM7h-22(SEQ ID NO489)、DOM7h-23(SEQ ID NO490)、DOM7h-24(SEQ ID NO491)、DOM7h-25(SEQ ID NO492)、DOM7h-26(SEQ ID NO493)、DOM7h-21(SEQ ID NO494)、DOM7h-27(SEQ ID NO495)。在其它实施方案中，结合血清白蛋白的抗体的抗原结合片段是结合人血清白蛋白并含有任一种前述氨基酸序列的CDR的dAb。
结合血清白蛋白的合适的骆驼科动物VHH包括公开于WO2004/041862(Ablynx N.V.)的那些和本文的序列A(SEQ ID NO518)、序列B(SEQ ID NO519)、序列C(SEQ ID NO520)、序列D(SEQ IDNO521)、序列E(SEQ ID NO522)、序列F(SEQ ID NO523)、序列G(SEQ ID NO524)、序列H(SEQ ID NO525)、序列I(SEQ ID NO526)、序列J(SEQ ID NO527)、序列K(SEQ ID NO528)、序列L(SEQ IDNO529)、序列M(SEQ ID NO530)、序列N(SEQ ID NO531)、序列O(SEQ ID NO532)、序列P(SEQ ID NO533)、序列Q(SEQ IDNO534)。在某些实施方案中，骆驼科动物VHH结合人血清白蛋白，并含有与SEQ ID NO518-534中的任一种具有至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
氨基酸序列同一性优选使用合适的序列比对算法和默认参数进行测定，例如BLAST P(Karlin和Altschul，Proc.Natl.Acad.Sci.USA87(6)2264-2268(1990))。
在某些实施方案中，配体含有的抗血清白蛋白dAb与本文所公开的任何抗血清白蛋白dAb竞争性结合血清白蛋白(例如人血清白蛋白)。
核酸分子、载体和宿主细胞 本发明还提供编码本文所述的配体(双特异性配体和多特异性配体)的分离和/或重组核酸分子。
本文中“分离的”核酸是已从其来源的基因组DNA或细胞RNA的核酸(例如当它存在于细胞中或核酸混合物(例如文库)中)分离出来的核酸，并且包括通过本文所述的方法或其它合适方法而得到的核酸，包括基本纯的核酸，通过化学合成、通过生物和化学方法组合而产生的核酸，以及分离的重组核酸(参见例如Daugherty，B.L.等，Nucleic AcidsRes.，19(9)2471-2476(1991)；Lewis，A.P.和J.S.Crowe，Gene，101297-302(1991))。
本文中“重组的”核酸是通过重组DNA方法产生的核酸，包括通过依靠人工重组方法产生的核酸，所述方法例如聚合酶链式反应(PCR)和/或用限制酶克隆到载体中。
在某些实施方案中，分离和/或重组核酸包含编码本文所述的配体的核苷酸序列，其中所述配体包含的氨基酸序列与本文所公开的结合VEGF的dAb或本文所公开的结合EGFR的dAb的氨基酸序列相比，具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％氨基酸序列同一性。
例如，在某些实施方案中，分离和/或重组核酸包含编码本文所述的具有VEGF结合特异性的配体的核苷酸序列，其中所述配体包含的氨基酸序列与选自以下dAb的氨基酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％氨基酸序列同一性TAR15-1(SEQ ID NO100)、TAR15-3(SEQ IDNO101)、TAR15-4(SEQ ID NO102)、TAR15-9(SEQ ID NO103)、TAR15-10(SEQ ID NO104)、TAR15-11(SEQ ID NO105)、TAR15-12(SEQ ID NO106)、TAR15-13(SEQ ID NO107)、TAR15-14(SEQ IDNO108)、TAR15-15(SEQ ID NO109)、TAR15-16(SEQ ID NO110)、TAR15-17(SEQ ID NO111)、TAR15-18(SEQ ID NO112)、TAR15-19(SEQ ID NO113)、TAR15-20(SEQ ID NO114)、TAR15-22(SEQ IDNO115)、TAR15-5(SEQ ID NO116)、TAR15-6(SEQ ID NO117)、TAR15-7(SEQ ID NO118)、TAR15-8(SEQ ID NO119)、TAR15-23(SEQ ID NO120)、TAR15-24(SEQ ID NO121)、TAR15-25(SEQ IDNO122)、TAR15-26(SEQ ID NO123)、TAR15-27(SEQ ID NO124)、TAR15-29(SEQ ID NO125)、TAR15-30(SEQ ID NO126)、TAR15-6-500(SEQ ID NO127)、TAR15-6-501(SEQ ID NO128)、TAR15-6-502(SEQ ID NO129)、TAR15-6-503(SEQ ID NO130)、TAR15-6-504(SEQ ID NO131)、TAR15-6-505(SEQ ID NO132)、TAR15-6-506(SEQ ID NO133)、TAR15-6-507(SEQ ID NO134)、TAR15-6-508(SEQ ID NO135)、TAR15-6-509(SEQ ID NO136)、TAR15-6-510(SEQ ID NO137)、TAR15-8-500(SEQ ID NO138)、TAR15-8-501(SEQ ID NO139)、TAR15-8-502(SEQ ID NO140)、TAR15-8-503(SEQ ID NO141)、TAR15-8-505(SEQ ID NO142)、TAR15-8-506(SEQ ID NO143)、TAR15-8-507(SEQ ID NO144)、TAR15-8-508(SEQ ID NO145)、TAR15-8-509(SEQ ID NO146)、TAR15-8-510(SEQ ID NO147)、TAR15-8-511(SEQ ID NO148)、TAR15-26-500(SEQ ID NO149)、TAR15-26-501(SEQ ID NO150)、TAR15-26-502(SEQ ID NO151)、TAR15-26-503(SEQ ID NO152)、TAR15-26-504(SEQ ID NO153)、TAR15-26-505(SEQ ID NO154)、TAR15-26-506(SEQ ID NO155)、TAR15-26-507(SEQ ID NO156)、TAR15-26-508(SEQ ID NO157)、TAR15-26-509(SEQ ID NO158)、TAR15-26-510(SEQ ID NO159)、TAR15-26-511(SEQ ID NO160)、TAR15-26-512(SEQ ID NO161)、TAR15-26-513(SEQ ID NO162)、TAR15-26-514(SEQ ID NO163)、TAR15-26-515(SEQ ID NO164)、TAR15-26-516(SEQ ID NO165)、TAR15-26-517(SEQ ID NO166)、TAR15-26-518(SEQ ID NO167)、TAR15-26-519(SEQ ID NO168)、TAR15-26-520(SEQ ID NO169)、TAR15-26-521(SEQ ID NO170)、TAR15-26-522(SEQ ID NO171)、TAR15-26-523(SEQ ID NO172)、TAR15-26-524(SEQ ID NO173)、TAR15-26-525(SEQ ID NO174)、TAR15-26-526(SEQ ID NO175)、TAR15-26-527(SEQ ID NO176)、TAR15-26-528(SEQ ID NO177)、TAR15-26-529(SEQ ID NO178)、TAR15-26-530(SEQ ID NO179)、TAR15-26-531(SEQ ID NO180)、TAR15-26-532(SEQ ID NO181)、TAR15-26-533(SEQ ID NO182)、TAR15-26-534(SEQ ID NO183)、TAR15-26-535(SEQ ID NO184)、TAR15-26-536(SEQ ID NO185)、TAR15-26-537(SEQ ID NO186)、TAR15-26-538(SEQ ID NO187)、TAR15-26-539(SEQ ID NO188)、TAR15-26-540(SEQ ID NO189)、TAR15-26-541(SEQ ID NO190)、TAR15-26-542(SEQ ID NO191)、TAR15-26-543(SEQ ID NO192)、TAR15-26-544(SEQ ID NO193)、TAR15-26-545(SEQ ID NO194)、TAR15-26-546(SEQ ID NO195)、TAR15-26-547(SEQ ID NO196)、TAR15-26-548(SEQ ID NO197)、TAR15-26-549(SEQ ID NO198)、TAR15-26-550(SEQ ID NO539)和TAR15-26-551(SEQ ID NO540)。
例如，在某些实施方案中，分离和/或重组核酸包含编码本文所述的具有VEGF结合特异性的配体的核苷酸序列，其中所述配体包含的氨基酸序列与SEQ ID NO705(TAR15-26-555)的氨基酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％氨基酸序列同一性。
在其它实施方案中，分离和/或重组核酸包含编码本文所述的具有EGFR结合特异性的配体的核苷酸序列，其中所述配体包含的氨基酸序列与选自以下dAb的氨基酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％氨基酸序列同一性DOM16-17(SEQ ID NO325)、DOM16-18(SEQ IDNO326)、DOM16-19(SEQ ID NO327)、DOM16-20(SEQ ID NO328)、DOM16-21(SEQ ID NO329)、DOM16-22(SEQ ID NO330)、DOM16-23(SEQ ID NO331)、DOM16-24(SEQ ID NO332)、DOM16-25(SEQ ID NO333)、DOM16-26(SEQ ID NO334)、DOM16-27(SEQ ID NO335)、DOM16-28(SEQ ID NO336)、DOM16-29(SEQ ID NO337)、DOM16-30(SEQ ID NO338)、DOM16-31(SEQ ID NO339)、DOM16-32(SEQ ID NO340)、DOM16-33(SEQ ID NO341)、DOM16-35(SEQ ID NO342)、DOM16-37(SEQ ID NO343)、DOM16-38(SEQ ID NO344)、DOM16-39(SEQ ID NO345)、DOM16-40(SEQ ID NO346)、DOM16-41(SEQ ID NO347)、DOM16-42(SEQ ID NO348)、DOM16-43(SEQ ID NO349)、DOM16-44(SEQ ID NO350)、DOM16-45(SEQ ID NO351)、DOM16-46(SEQ ID NO352)、DOM16-47(SEQ ID NO353)、DOM16-48(SEQ ID NO354)、DOM16-49(SEQ ID NO355)、DOM16-50(SEQ ID NO356)、DOM16-59(SEQ ID NO357)、DOM16-60(SEQ ID NO358)、DOM16-61(SEQ ID NO359)、DOM16-62(SEQ ID NO360)、DOM16-63(SEQ ID NO361)、DOM16-64(SEQ ID NO362)、DOM16-65(SEQ ID NO363)、DOM16-66(SEQ ID NO364)、DOM16-67(SEQ ID NO365)、DOM16-68(SEQ ID NO366)、DOM16-69(SEQ ID NO367)、DOM16-70(SEQ ID NO368)、DOM16-71(SEQ ID NO369)、DOM16-72(SEQ ID NO370)、DOM16-73(SEQ ID NO371)、DOM16-74(SEQ ID NO372)、DOM16-75(SEQ ID NO373)、DOM16-76(SEQ ID NO374)、DOM16-77(SEQ ID NO375)、DOM16-78(SEQ ID NO376)、DOM16-79(SEQ ID NO377)、DOM16-80(SEQ ID NO378)、DOM16-81(SEQ ID NO379)、DOM16-82(SEQ ID NO380)、DOM16-83(SEQ ID NO381)、DOM16-84(SEQ ID NO382)、DOM16-85(SEQ ID NO383)、DOM16-87(SEQ ID NO384)、DOM16-88(SEQ ID NO385)、DOM16-89(SEQ ID NO386)、DOM16-90(SEQ ID NO387)、DOM16-91(SEQ ID NO388)、DOM16-92(SEQ ID NO389)、DOM16-94(SEQ ID NO390)、DOM16-95(SEQ ID NO391)、DOM16-96(SEQ ID NO392)、DOM16-97(SEQ ID NO393)、DOM16-98(SEQ ID NO394)、DOM16-99(SEQ ID NO395)、DOM16-100(SEQ ID NO396)、DOM16-101(SEQ ID NO397)、DOM16-102(SEQ ID NO398)、DOM16-103(SEQ ID NO399)、DOM16-104(SEQ ID NO400)、DOM16-105(SEQ ID NO401)、DOM16-106(SEQ ID NO402)、DOM16-107(SEQ ID NO403)、DOM16-108(SEQ ID NO404)、DOM16-109(SEQ ID NO405)、DOM16-110(SEQ ID NO406)、DOM16-111(SEQ ID NO407)、DOM16-112(SEQ ID NO408)、DOM16-113(SEQ ID NO409)、DOM16-114(SEQ ID NO410)、DOM16-115(SEQ ID NO411)、DOM16-116(SEQ ID NO412)、DOM16-117(SEQ ID NO413)、DOM16-118(SEQ ID NO414)、DOM16-119(SEQ ID NO415)、DOM16-39-6(SEQ ID NO416)、DOM16-39-8(SEQ ID NO417)、DOM16-39-34(SEQ ID NO418)、DOM16-39-48(SEQ ID NO419)、DOM16-39-87(SEQ ID NO420)、DOM16-39-90(SEQ ID NO421)、DOM16-39-96(SEQ ID NO422)、DOM16-39-100(SEQ ID NO423)、DOM16-39-101(SEQ ID NO424)、DOM16-39-102(SEQ ID NO425)、DOM16-39-103(SEQ ID NO426)、DOM16-39-104(SEQ ID NO427)、DOM16-39-105(SEQ ID NO428)、DOM16-39-106(SEQ ID NO429)、DOM16-39-107(SEQ ID NO430)、DOM16-39-108(SEQ ID NO431)、DOM16-39-109(SEQ ID NO432)、DOM16-39-110(SEQ ID NO433)、DOM16-39-111(SEQ ID NO434)、DOM16-39-112(SEQ ID NO435)、DOM16-39-113(SEQ ID NO436)、DOM16-39-114(SEQ ID NO437)、DOM16-39-115(SEQ ID NO438)、DOM16-39-116(SEQ ID NO439)、DOM16-39-117(SEQ ID NO440)、DOM16-39-200(SEQ ID NO441)、DOM16-39-201(SEQ ID NO442)、DOM16-39-202(SEQ ID NO443)、DOM16-39-203(SEQ ID NO444)、DOM16-39-204(SEQ ID NO445)、DOM16-39-205(SEQ ID NO446)、DOM16-39-206(SEQ ID NO447)、DOM16-39-207(SEQ ID NO448)、DOM16-39-209(SEQ ID NO449)、DOM16-52(SEQ ID NO450)、NB1(SEQ ID NO451)、NB2(SEQ ID NO452)、NB3(SEQ ID NO453)、NB4(SEQ ID NO454)、NB5(SEQ ID NO455)、NB6(SEQ ID NO456)、NB7(SEQ ID NO457)、NB8(SEQ ID NO458)、NB9(SEQ ID NO459)、NB10(SEQ ID NO460)、NB11(SEQ ID NO461)、NB12(SEQ IDNO462)、NB13(SEQ ID NO463)、NB14(SEQ ID NO464)、NB15(SEQID NO465)、NB16(SEQ ID NO466)、NB17(SEQ ID NO467)、NB18(SEQ ID NO468)、NB19(SEQ ID NO469)、NB20(SEQ ID NO470)、NB21(SEQ ID NO471)和NB22(SEQ ID NO472)。
在其它实施方案中，分离和/或重组核酸包含编码本文所述的具有EGFR结合特异性的配体的核苷酸序列，其中所述配体包含的氨基酸序列与选自SEQ ID NO623-703、727和728的氨基酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％氨基酸序列同一性。
在其它实施方案中，编码本文所述的具有VEGF结合特异性的配体的分离和/或重组核酸包含的核苷酸序列与编码选自以下抗VEGFdAb的核苷酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％核苷酸序列同一性TAR15-1(SEQ ID NO1)、TAR15-3(SEQ ID NO2)、TAR15-4(SEQ IDNO3)、TAR15-9(SEQ ID NO4)、TAR15-10(SEQ ID NO5)、TAR15-11(SEQ ID NO6)、TAR15-12(SEQ ID NO7)、TAR15-13(SEQ ID NO8)、TAR15-14(SEQ ID NO9)、TAR15-15(SEQ ID NO10)、TAR15-16(SEQ ID NO11)、TAR15-17(SEQ ID NO12)、TAR15-18(SEQ IDNO13)、TAR15-19(SEQ ID NO14)、TAR15-20(SEQ ID NO15)、TAR15-22(SEQ ID NO16)、TAR15-5(SEQ ID NO17)、TAR15-6(SEQ IDNO18)、TAR15-7(SEQ ID NO19)、TAR15-8(SEQ ID NO20)、TAR15-23(SEQ ID NO21)、TAR15-24(SEQ ID NO22)、TAR15-25(SEQ ID NO23)、TAR15-26(SEQ ID NO24)、TAR15-27(SEQ IDNO25)、TAR15-29(SEQ ID NO26)、TAR15-30(SEQ ID NO27)、TAR15-6-500(SEQ ID NO28)、TAR15-6-501(SEQ ID NO29)、TAR15-6-502(SEQ ID NO30)、TAR15-6-503(SEQ ID NO31)、TAR15-6-504(SEQ ID NO32)、TAR15-6-505(SEQ ID NO33)、TAR15-6-506(SEQ ID NO34)、TAR15-6-507(SEQ ID NO35)、TAR15-6-508(SEQ ID NO36)、TAR15-6-509(SEQ ID NO37)、TAR15-6-510(SEQ ID NO38)、TAR15-8-500(SEQ ID NO39)、TAR15-8-501(SEQ ID NO40)、TAR15-8-502(SEQ ID NO41)、TAR15-8-503(SEQ ID NO42)、TAR15-8-505(SEQ ID NO43)、TAR15-8-506(SEQ ID NO44)、TAR15-8-507(SEQ ID NO45)、TAR15-8-508(SEQ ID NO46)、TAR15-8-509(SEQ ID NO47)、R15-8-510(SEQ ID NO48)、TAR15-8-511(SEQ ID NO49)、TAR15-26-500(SEQ ID NO50)、TAR15-26-501(SEQ ID NO51)、TAR15-26-502(SEQ ID NO52)、TAR15-26-503(SEQ ID NO53)、TAR15-26-504(SEQ ID NO54)、TAR15-26-505(SEQ ID NO55)、TAR15-26-506(SEQ ID NO56)、TAR15-26-507(SEQ ID NO57)、TAR15-26-508(SEQ ID NO58)、TAR15-26-509(SEQ ID NO59)、TAR15-26-510(SEQ ID NO60)、TAR15-26-511(SEQ ID NO61)、TAR15-26-512(SEQ ID NO62)、TAR15-26-513(SEQ ID NO63)、TAR15-26-514(SEQ ID NO64)、TAR15-26-515(SEQ ID NO65)、TAR15-26-516(SEQ ID NO66)、TAR15-26-517(SEQ ID NO67)、TAR15-26-518(SEQ ID NO68)、TAR15-26-519(SEQ ID NO69)、TAR15-26-520(SEQ ID NO70)、TAR15-26-521(SEQ ID NO71)、TAR15-26-522(SEQ ID NO72)、TAR15-26-523(SEQ ID NO73)、TAR15-26-524(SEQ ID NO74)、TAR15-26-525(SEQ ID NO75)、TAR15-26-526(SEQ ID NO76)、TAR15-26-527(SEQ ID NO77)、TAR15-26-528(SEQ ID NO78)、TAR15-26-529(SEQ ID NO79)、TAR15-26-530(SEQ ID NO80)、TAR15-26-531(SEQ ID NO81)、TAR15-26-532(SEQ ID NO82)、TAR15-26-533(SEQ ID NO83)、TAR15-26-534(SEQ ID NO84)、TAR15-26-535(SEQ ID NO85)、TAR15-26-536(SEQ ID NO86)、TAR15-26-537(SEQ ID NO87)、TAR15-26-538(SEQ ID NO88)、TAR15-26-539(SEQ ID NO89)、TAR15-26-540(SEQ ID NO90)、TAR15-26-541(SEQ ID NO91)、TAR15-26-542(SEQ ID NO92)、TAR15-26-543(SEQ ID NO93)、TAR15-26-544(SEQ ID NO94)、TAR15-26-545(SEQ ID NO95)、TAR15-26-546(SEQ ID NO96)、TAR15-26-547(SEQ ID NO97)、TAR15-26-548(SEQ ID NO98)、TAR15-26-549(SEQ ID NO99)、TAR15-21(SEQ ID NO535)、TAR15-2(SEQ ID NO536)、TAR15-26-550(SEQ ID NO537)和TAR15-26-551(SEQ ID NO538)。优选核苷酸序列同一性是在编码所选抗VEGF dAb的全长核苷酸序列上进行测定的。
在其它实施方案中，编码本文所述的具有VEGF结合特异性的配体的分离和/或重组核酸包含的核苷酸序列与编码TAR15-26-555(SEQ ID NO705)的核苷酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％核苷酸序列同一性。
在其它实施方案中，编码本文所述的具有EGFR结合特异性的配体的分离和/或重组核酸包含的核苷酸序列与编码选自以下的抗VEGF dAb的核苷酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％核苷酸序列同一性DOM16-17(SEQ ID NO199)、DOM16-18(SEQ ID NO200)、DOM16-19(SEQ ID NO201)、DOM16-20(SEQ ID NO202)、DOM16-21(SEQ ID NO203)、DOM16-22(SEQ ID NO204)、DOM16-23(SEQ ID NO205)、DOM16-24(SEQ ID NO206)、DOM16-25(SEQ ID NO207)、DOM16-26(SEQ ID NO208)、DOM16-27(SEQ ID NO209)、DOM16-28(SEQ ID NO210)、DOM16-29(SEQ ID NO211)、DOM16-30(SEQ ID NO212)、DOM16-31(SEQ ID NO213)、DOM16-32(SEQ ID NO214)、DOM16-33(SEQ ID NO215)、DOM16-35(SEQ ID NO216)、DOM16-37(SEQ ID NO217)、DOM16-38(SEQ ID NO218)、DOM16-39(SEQ ID NO219)、DOM16-40(SEQ ID NO220)、DOM16-41(SEQ ID NO221)、DOM16-42(SEQ ID NO222)、DOM16-43(SEQ ID NO223)、DOM16-44(SEQ ID NO224)、DOM16-45(SEQ ID NO225)、DOM16-46(SEQ ID NO226)、DOM16-47(SEQ ID NO227)、DOM16-48(SEQ ID NO228)、DOM16-49(SEQ ID NO229)、DOM16-50(SEQ ID NO230)、DOM16-59(SEQ ID NO231)、DOM16-60(SEQ ID NO232)、DOM16-61(SEQ ID NO233)、DOM16-62(SEQ ID NO234)、DOM16-63(SEQ ID NO235)、DOM16-64(SEQ ID NO236)、DOM16-65(SEQ ID NO237)、DOM16-66(SEQ ID NO238)、DOM16-67(SEQ ID NO239)、DOM16-68(SEQ ID NO240)、DOM16-69(SEQ ID NO241)、DOM16-70(SEQ ID NO242)、DOM16-71(SEQ ID NO243)、DOM16-72(SEQ ID NO244)、DOM16-73(SEQ ID NO245)、DOM16-74(SEQ ID NO246)、DOM16-75(SEQ ID NO247)、DOM16-76(SEQ ID NO248)、DOM16-77(SEQ ID NO249)、DOM16-78(SEQ ID NO250)、DOM16-79(SEQ ID NO251)、DOM16-80(SEQ ID NO252)、DOM16-81(SEQ ID NO253)、DOM16-82(SEQ ID NO254)、DOM16-83(SEQ ID NO255)、DOM16-84(SEQ ID NO256)、DOM16-85(SEQ ID NO257)、DOM16-87(SEQ ID NO258)、DOM16-88(SEQ ID NO259)、DOM16-89(SEQ ID NO260)、DOM16-90(SEQ ID NO261)、DOM16-91(SEQ ID NO262)、DOM16-92(SEQ ID NO263)、DOM16-94(SEQ ID NO264)、DOM16-95(SEQ ID NO265)、DOM16-96(SEQ ID NO266)、DOM16-97(SEQ ID NO267)、DOM16-98(SEQ ID NO268)、DOM16-99(SEQ ID NO269)、DOM16-100(SEQ ID NO270)、DOM16-101(SEQ ID NO271)、DOM16-102(SEQ ID NO272)、DOM16-103(SEQ ID NO273)、DOM16-104(SEQ ID NO274)、DOM16-105(SEQ ID NO275)、DOM16-106(SEQ ID NO276)、DOM16-107(SEQ ID NO277)、DOM16-108(SEQ ID NO278)、DOM16-109(SEQ ID NO279)、DOM16-110(SEQ ID NO280)、DOM16-111(SEQ ID NO281)、DOM16-112(SEQ ID NO282)、DOM16-113(SEQ ID NO283)、DOM16-114(SEQ ID NO284)、DOM16-115(SEQ ID NO285)、DOM16-116(SEQ ID NO286)、DOM16-117(SEQ ID NO287)、DOM16-118(SEQ ID NO288)、DOM16-119(SEQ ID NO289)、DOM16-39-6(SEQ ID NO290)、DOM16-39-8(SEQ ID NO291)、DOM16-39-34(SEQ ID NO292)、DOM16-39-48(SEQ ID NO293)、DOM16-39-87(SEQ ID NO294)、DOM16-39-90(SEQ ID NO295)、DOM16-39-96(SEQ ID NO296)、DOM16-39-100(SEQ ID NO297)、DOM16-39-101(SEQ ID NO298)、DOM16-39-102(SEQ ID NO299)、DOM16-39-103(SEQ ID NO300)、DOM16-39-104(SEQ ID NO301)、DOM16-39-105(SEQ ID NO302)、DOM16-39-106(SEQ ID NO303)、DOM16-39-107(SEQ ID NO304)、DOM16-39-108(SEQ ID NO305)、DOM16-39-109(SEQ ID NO306)、DOM16-39-110(SEQ ID NO307)、DOM16-39-111(SEQ ID NO308)、DOM16-39-112(SEQ ID NO309)、DOM16-39-113(SEQ ID NO310)、DOM16-39-114(SEQ ID NO311)、DOM16-39-115(SEQ ID NO312)、DOM16-39-116(SEQ ID NO313)、DOM16-39-117(SEQ ID NO314)、DOM16-39-200(SEQ ID NO315)、DOM16-39-201(SEQ ID NO316)、DOM16-39-202(SEQ ID NO317)、DOM16-39-203(SEQ ID NO318)、DOM16-39-204(SEQ ID NO319)、DOM16-39-205(SEQ ID NO320)、DOM16-39-206(SEQ ID NO321)、DOM16-39-207(SEQ ID NO322)、DOM16-39-209(SEQ ID NO323)和DOM16-52(SEQ ID NO324)。优选核苷酸序列同一性是在编码所选抗EGFR dAb的全长核苷酸序列上进行测定的。
在其它实施方案中，编码本文所述的具有EGFR结合特异性的配体的分离和/或重组核酸包含的核苷酸序列与编码选自以下的抗EGFRdAb的核苷酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％核苷酸序列同一性SEQ ID NO623-703、727和728。
本发明还提供包含本发明的重组核酸分子的载体。在某些实施方案中，载体是含有一个或多个与本发明的重组核酸有效连接的表达控制元件或序列的表达载体。本发明还提供包含本发明的重组核酸分子或载体的重组宿主细胞。合适的载体(例如质粒、噬菌粒)、表达控制元件、宿主细胞和生产本发明的重组宿主细胞的方法在本领域众所周知，本文进一步描述了实例。
合适的表达载体可包含许多元件，例如复制起点、选择标记基因、一个或多个表达控制元件(例如转录控制元件(例如启动子、增强子、终止子))和/或一个或多个翻译信号、信号序列或前导序列等。表达控制元件和信号序列如果存在的话，则可由载体或其它来源提供。例如，编码抗体链的克隆核酸的转录和/或翻译控制序列可用于指导表达。
可提供用于在所需宿主细胞中表达的启动子。启动子可为组成型的或诱导型的。例如，启动子可与编码抗体、抗体链或其部分的核酸有效连接，使得其指导核酸的转录。可获得多种适于原核宿主的启动子(例如大肠杆菌的lac、tac、T3、T7启动子)和适于真核宿主的启动子(例如猿猴病毒40早期或晚期启动子、劳斯肉瘤病毒长末端重复序列启动子、巨细胞病毒启动子、腺病毒晚期启动子)。
另外，表达载体通常包含用于选择携带载体的宿主细胞的选择标记，就复制型表达载体而言，还包含复制起点。赋予抗生素或药物抗性的基因编码产物是常用的选择标记，可用于原核细胞(例如内酰胺酶基因(氨苄青霉素抗性)、用于四环素抗性的Tet基因)和真核细胞(例如新霉素(G418或遗传霉素)、gpt(霉酚酸)、氨苄青霉素或潮霉素抗性基因)。二氢叶酸还原酶标记基因允许用甲氨蝶呤在多种宿主中进行选择。编码宿主的营养缺陷型标记的基因产物的基因(例如LEU2、URA3、HIS3)经常在酵母中用作选择标记。还考虑了病毒(例如杆状病毒)或噬菌体载体以及能够整合入宿主细胞基因组中的载体(例如逆转录病毒载体)的应用。适于在哺乳动物细胞和原核细胞(大肠杆菌)、昆虫细胞(果蝇Schnieder S2细胞、Sf9)和酵母(甲醇毕赤酵母(P.methanolica)、巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)、酿酒酵母(S.cerevisiae))中表达的表达载体在本领域众所周知。
合适的宿主细胞可为原核细胞，包括细菌细胞，例如大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和/或其它合适的细菌；真核细胞，例如真菌或酵母细胞(例如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、曲霉(Aspergillus sp.)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、粗糙链孢霉(Neurospora crassa))或其它低等真核生物的细胞，以及高等真核生物的细胞，例如昆虫细胞(例如果蝇Schnieder S2细胞、Sf9昆虫细胞(WO 94/26087(O′Connor))、哺乳动物细胞(例如COS细胞，例如COS-1(ATCC保藏号CRL-1650)和COS-7(ATCC保藏号CRL-1651)、CHO(例如ATCC保藏号CRL-9096，CHO DG44(Urlaub，G.和Chasin，LA.，Proc.Natl.Acac.Sci.USA，77(7)4216-4220(1980)))、293(ATCC保藏号CRL-1573)、HeLa(ATCC保藏号CCL-2)、CV1(ATCC保藏号CCL-70)、WOP(Dailey，L.等，J.Virol，54739-749(1985)、3T3、293T(Pear，W.S.等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，908392-8396(1993))、NS0细胞、SP2/0、HuT 78细胞等，或植物细胞(例如烟草细胞)。(参见例如Ausubel，F.M.等编辑，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associatesand John Wiley & Sons Inc.(1993))。在某些实施方案中，宿主细胞为分离的宿主细胞，不是多细胞生物(例如植物或动物)的组成部分。在优选的实施方案中，宿主细胞为非人宿主细胞。
本发明还提供生产本发明配体(例如双特异性配体、多特异性配体)的方法，该方法包括将包含本发明重组核酸的重组宿主细胞在适于表达重组核酸的条件下进行培养，由此表达重组核酸并产生配体。在某些实施方案中，该方法还包括分离出配体。
基于免疫球蛋白的配体的制备 本发明的配体(例如双特异性配体、多特异性配体)可按照抗体工程领域中用于制备scFv、“噬菌体”抗体和其它的工程抗体分子的先前建立的技术来制备。抗体的制备技术例如描述于以下综述及其中所引用的参考文献Winter & Milstein，(1991)Nature 349293-299；Pluckthun(1992)Immunologica lReviews 130151-188；Wright等，(1992)Crit.Rev.Immunol.12125-168；Holliger，P.& Winter，G.(1993)Curr.Opin.Biotechnol.4，446-449；Carter等(1995)J.Hematother.4，463-470；Chester，K.A.& Hawkins，R.E.(1995)Trends Biotechnol.13，294-300；Hoogenboom，H.R.(1997)Nat.Biotechnol.15，125-126；Fearon，D.(1997)Nat.Biotechnol.15，618-619；Plückthun，A.& Pack，P.(1997)Immunotechnology 3，83-105；Carter，P.& Merchant，A.M.(1997)Curr.Opin.Biotechnol.8，449-454；Holliger，P.& Winter，G.(1997)CancerImm unol.Immunother.45，128-130。
适用于选择具有所需特异性的抗体可变区的技术采用本领域已知的文库和选择程序。采用从人B细胞收获的重排V基因的天然文库(Marks等(1991)J.Mol.Biol.，222581；Vaughan等(1996)NatureBiotech.，14309)是本领域技术人员众所周知的。合成文库(Hoogenboom和Winter(1992)J.Mol.Biol.，227381；Barbas等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，894457；Nissim等(1994)EMBO J.，13692；Griffiths等(1994)EMBO J.，133245；De Kruif等(1995)J.Mol.Biol.，24897)通常采用PCR通过克隆免疫球蛋白V基因制备。PCR过程中的错误可导致高度随机化。可单独地(在此情况下直接选择单域结合)或一起选择针对靶抗原或表位的VH和/或VL文库。
文库载体系统 适用于本发明的各种选择系统是本领域已知的。这些系统的实例如下所述。
可以直接筛选噬菌体λ表达系统的噬菌斑或溶原体的菌落，这两者先前都有描述(Huse等(1989)Science，2461275；Caton和Koprowski(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，87；Mullinax等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，878095；Persson等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，882432)，可用于本发明。尽管这样的表达系统可以用于筛选多达106个不同文库成员，但是它们确实不适合筛选更大数量(大于106个成员)。文库构建中特别有用的是选择展示系统，所述系统使所连接的核酸能够表达为多肽。本文所用的选择展示系统是允许通过合适展示方法选择结合通用配体和/或靶配体的各个文库成员的系统。
从大文库中分离出所需成员的选择方案是本领域已知的，以噬菌体展示技术为代表。这些将多样化肽序列展示在丝状噬菌体表面的系统(Scott和Smith(1990)Science，249386)，已经证明可用于产生抗体片段(及编码它们的核苷酸序列)的文库，用于体外选择和扩增结合靶抗原的特异性抗体片段(McCafferty等，WO 92/01047)。编码可变区的核苷酸序列连接到编码前导信号的基因片段上，所述前导信号可指导它们到达大肠杆菌的壁膜间隙，结果所得抗体片段展示在噬菌体表面，通常是与噬菌体外壳蛋白(例如pIII或pVIII)融合。或者，抗体片段向外展示在λ噬菌体衣壳(噬菌体)上。基于噬菌体的展示系统的优势在于因为它们是生物系统，所以可以仅通过将含有所选文库成员的噬菌体在细菌细胞中培养来扩增所选文库成员。此外，因为编码多肽文库成员的核苷酸序列包含在噬菌体或噬菌粒载体上，所以测序、表达和其后的遗传操作相对直接。
噬菌体抗体展示文库和λ噬菌体表达文库的构建方法在本领域众所周知(McCafferty等(1990)Nature，348552；Kang等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，884363；Clackson等(1991)Nature，352624；Lowman等(1991)Biochemistry，3010832；Burton等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，8810134；Hoogenboom等(1991)Nucleic Acids Res.，194133；Chang等(1991)J.Immunol.，1473610；Breitling等(1991)Gene，104147；Marks等(1991)，出处同上；Barbas等(1992)，出处同上；Hawkins和Winter(1992)J.Immunol.，22867；Marks等，1992，J.Biol.Chem.，26716007；Lerner等(1992)Science，2581313，所述文献通过引用结合到本文中)。
一个特别具有优势的方法是使用scFv噬菌体文库(Huston等，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，855879-5883；Chaudhary等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，871066-1070；McCafferty等(1990)，出处同上；Clackson等(1991)Nature，352624；Marks等(1991)J.Mol.Biol.，222581；Chiswell等(1992)Trends Biotechnol.，1080；Marks等(1992)J.Biol.Chem.，267)。在噬菌体外壳蛋白上展示的scFv文库的各种实施方案已有描述。噬菌体展示方法的改进也是已知的，例如参见WO96/06213和WO92/01047(Medical Research Council等)以及WO97/08320(Morphosys)，所述文献通过引用结合到本文中。
产生多肽文库的其它系统包括使用无细胞酶促机制，用于体外合成文库成员。在一个方法中，通过交替多轮的针对靶的选择和PCR扩增来选择RNA分子(Tuerk和Gold(1990)Science，249505；Ellington和Szostak(1990)Nature，346818)。一项类似技术可用于鉴定结合预定的人转录因子的DNA序列(Thiesen和Bach(1990)Nucleic Acids Res.，183203；Beaudry和Joyce(1992)Science，257635；WO92/05258和WO92/14843)。以类似方式，体外翻译可用于合成多肽，这作为产生大文库的方法。这些通常包括稳定的多核糖体复合物的方法进一步描述于WO88/08453、WO90/05785、WO90/07003、WO91/02076、WO91/05058和WO92/02536。并非基于噬菌体的替代展示系统，例如那些公开于WO95/22625和WO95/11922(Affymax)的系统，采用多核糖体来展示多肽，用于选择。
还有一类技术包括对人工区室中的库的选择，这允许将基因与其基因产物联系起来。例如，其中可在由油包水乳剂形成的微囊中选择编码所需基因产物的核酸的选择系统描述于WO99/02671、WO00/40712以及Tawfik和Griffiths(1998)Nature Biotechnol 16(7)，652-6。将编码具有所需活性的基因产物的遗传元件在微囊中区室化，然后在微囊内转录和/或翻译，以产生它们相应的基因产物(RNA或蛋白质)。随后分选产生具有所需活性的基因产物的遗传元件。该方法通过多种手段检测所需活性而选择目标基因产物。
文库构建 用于选择的文库可以采用例如以上提出的本领域已知技术构建，或者可以从商业来源购买。可用于本发明的文库描述于例如WO99/20749。一旦选定载体系统并将一个或多个编码目标多肽的核酸序列克隆到文库载体中，通过在表达前进行诱变，就可以在克隆分子内产生多样性；或者，可以在诱变和另外的多轮选择进行之前如上所述表达并选择所编码的蛋白质。按照标准分子方法，对编码结构优化多肽的核酸序列进行诱变。特别有用的是聚合酶链式反应即PCR(Mullis和Faloona(1987)Methods Enzymol，155335，所述文献通过引用结合到本文中)。PCR是本领域众所周知的，它采用由热稳定的DNA依赖性DNA聚合酶催化的多轮DNA复制，来扩增目标靶序列。各种抗体文库的构建已论述于Winter等(1994)Ann.Rev.Immunology，12，433-55及其中引用的参考文献。
用模板DNA(至少1fg；更有用的为1-1000ng)和至少25pmol寡核苷酸引物进行PCR；当引物库(primer pool)非常不均一时，最好采用较大量引物，因为各序列仅由少量引物库分子作为代表，而且数量在随后的扩增循环中成为限制。通常反应混合物包括2μl DNA、25pmol寡核苷酸引物、2.5μl 10X PCR缓冲液1(Perkin-Elmer，FosterCity，CA)、0.4μl1.25μM dNTP、0.15μl(或2.5单位)Taq DNA聚合酶(Perkin Elmer，Foster City，CA)和去离子水，至总体积为25μl。覆盖矿物油，用可编程热循环仪进行PCR。PCR循环中各步骤的长度和温度以及循环次数，按照实际所需的严格性来调整。退火温度和时间由预计引物与模板退火的效率和可耐受的错配程度这二者而定；显然，当核酸分子同时扩增和诱变时，错配是必需的，至少在合成的第一轮。优化引物退火条件的严格性的能力完全属于本领域中等技术人员的知识范围。采用的退火温度在30℃和72℃之间。模板分子开始变性通常发生在92℃和99℃之间达4分钟，再是20-40次循环，循环由变性(94-99℃15秒至1分钟)、退火(如上所述确定的温度；1-2分钟)和延伸(72℃1-5分钟，取决于扩增产物的长度)组成。最终延伸通常72℃4分钟，可后接于4℃的不确定(0-24小时)步骤。
组合单可变区 本发明所用的结构域，一旦选出就可以通过本领域已知的各种方法组合，包括共价和非共价方法。优选的方法包括采用如上所述的多肽接头，例如连接scFv分子(Bird等(1988)Science 242423-426)。有关合适接头的讨论参见Bird等，Science 242，423-426；Hudson等，Journal Immunol Methods 231(1999)177-189；Hudson等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，85，5879-5883。接头优选是柔性的，允许两个单域相互作用。一个接头的实例是(Gly4Ser)n接头，其中n＝1-8，例如2、3、4、5或7。也可采用双链抗体中使用的接头(其柔性较差)(Holliger等(1993)Proc Nat Acad Sci USA 906444-6448)。在一个实施方案中，所用的接头不是免疫球蛋白铰链区。
可变区可采用不用接头的方法而组合。例如，可以开发二硫桥的用途(所述二硫桥是通过天然存在的或改造的半胱氨酸残基而提供的)，以便稳定VH-VH、VL-VL或VH-VL二聚体(Reiter等(1994)ProteinEng.，7697-704)，或者通过可变区之间界面的重构以改善“适合性(fit)”，因而改善相互作用的稳定性(Ridgeway等(1996)Protein Eng.7617-621；Zhu等(1997)Protein Science 6781-788)。如果适当的话，可以使用用于连接或稳定免疫球蛋白可变区、尤其是抗体VH区的其它技术。
配体特征 双特异性配体与细胞的结合或者每个结合域与每个特异性靶的结合可以用本领域技术人员熟知的方法来测定，该方法包括ELISA。在本发明的一个优选的实施方案中，采用单克隆噬菌体ELISA来测定结合。可以按照任何合适方法进行噬菌体ELISA示例性方案如下。
可以通过ELISA筛选每轮选择中产生的、与所选抗原或表位结合的噬菌体群体，以鉴定“多克隆”噬菌体抗体。然后可通过ELISA筛选来自这些群体中单个受感染细菌菌落的噬菌体，以鉴定“单克隆”噬菌体抗体。还需要筛选结合抗原或表位的可溶性抗体片段，这也可通过ELISA、采用例如针对C-端或N-端标记的试剂来进行(参见例如Winter等(1994)Ann.Rev.Immunology 12，433-55及其中引用的参考文献。
可以通过PCR产物的凝胶电泳(Marks等1991，出处同上；Nissim等1994，出处同上)、探测(Tomlinson等，1992)J.Mol.Biol.227，776)或通过载体DNA测序，来评价所选噬菌体单克隆抗体的多样性。
配体结构 在例如采用本文所述的噬菌体展示技术从V基因库中选出每个可变区的情况下，这些可变区包含通用构架区，使得它们可以被本文定义的特异性通用双特异性配体所识别。通用构架、通用配体等的用途描述于WO 99/20749。
当使用V基因库时，多肽序列中的变异优选位于可变区结构环内。各可变区的多肽序列可以通过DNA改组或通过突变而改变，以便增强各可变区与其互补对的相互作用。DNA改组是本领域已知的，参见例如Stemmer，1994，Nature 370389-391和美国专利号6,297,053，所述文献都通过引用结合到本文中。其它诱变方法也是本领域技术人员众所周知的。
一般而言，可以按照标准实验室手册(例如Sambrook等(1989)Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，USA)的陈述，构建并操作用于选择、制备和形成双特异性配体所需的核酸分子和载体构建体。
本发明所用的核酸的操作通常在重组载体中进行。本文所用的载体是指这样的分离元件所述元件用于将异源DNA引入用于其表达和/或复制的细胞中。选择或构建以及随后使用所述载体的方法是本领域普通技术人员众所周知的。大量载体是公众可得的，包括细菌质粒、噬菌体、人工染色体和附加型载体。这类载体可用于简单的克隆和诱变；或者采用基因表达载体。可以选择本发明所用的载体，以适应所需大小的多肽编码序列，长度通常为0.25千碱基对(kb)至40kb或更大。体外克隆操作后，用载体转化合适的宿主细胞。各载体含有不同的功能性组件，通常包括克隆(或“多接头”)位点、复制起点和至少一个选择标记基因。如果给定的载体是表达载体，它还可具有一个或多个以下元件增强子元件、启动子、转录终止序列和信号序列，每个都位于克隆位点附近，使得它们与编码本发明的双特异性配体的基因有效连接。
克隆载体和表达载体一般都含有使载体在一种或多种所选宿主细胞中能复制的核酸序列。通常在克隆载体中，该序列使载体独立于宿主染色体DNA而复制，并且包含复制起点或自主复制序列。这类序列众所周知可用于多种多样的细菌、酵母和病毒。质粒pBR322的复制起点适合于大多数革兰氏阴性细菌，2μ质粒起点适合于酵母，而各种病毒起点(例如SV40、腺病毒)可用于哺乳动物细胞中的克隆载体。通常，复制起点对哺乳动物表达载体而言是不需要的，除非这些起点用于能高水平复制DNA的哺乳动物细胞，例如COS细胞。
最好克隆载体或表达载体可含有选择基因，也称为选择标记。该基因编码在选择培养基中培养的转化宿主细胞存活或生长所必需的蛋白质。因此，没有被含有选择基因的载体转化的宿主细胞将不能在培养基中存活。典型的选择基因编码的蛋白质赋予抗生素抗性和其它毒素抗性，例如氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四环素抗性，补充营养缺陷，或提供生长培养基中所没有的关键营养物。
因为编码本发明的双特异性配体的载体的复制在大肠杆菌中最便利进行，所以采用大肠杆菌选择标记，例如赋予抗生素氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因。这些选择标记可以得自大肠杆菌质粒，例如pBR322或pUC质粒，例如pUC18或pUC19。
表达载体通常含有宿主生物可识别的启动子，并且该启动子与目标编码序列有效连接。这样的启动子可以是诱导型或组成型的。术语“有效连接”是指并置方式使所述组件的关系允许它们以既定方式起作用。控制序列与编码序列“有效连接”是指连接方式使得在与控制序列相容的条件下可实现编码序列的表达。
适用于原核宿主的启动子包括例如β-内酰胺酶和乳糖启动子系统、碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子系统和杂合启动子(例如tac启动子)。用于细菌系统的启动子一般还含有与编码序列有效连接的SD序列(Shine-Delgarno sequence)。
优选的载体是能表达对应于多肽文库成员的核苷酸序列的表达载体。因此，可以通过表达多肽文库成员的单个克隆的单独增殖和表达或者通过使用任何选择展示系统，用第一和/或第二抗原或表位进行选择。如上所述，优选的选择展示系统是噬菌体展示。因此，可以使用噬菌体或噬菌粒载体，例如pIT1或pIT2。用于本发明的前导序列包括pelB、stII、ompA、phoA、bla和pelA。一个实例是具有大肠杆菌复制起点(用于双链复制)以及噬菌体复制起点(用于产生单链DNA)的噬菌粒载体。这类载体的操作和表达是本领域众所周知的(Hoogenboom和Winter(1992)，出处同上；Nissim等(1994)，出处同上)。简而言之，该载体含有β-内酰胺酶基因(以便赋予噬菌粒选择性)和表达盒上游的lac启动子，后者由以下部分组成(N端至C端)pelB前导序列(将表达多肽引导到壁膜间隙)、多克隆位点(用于克隆核苷酸形式的文库成员)、任选一个或多个肽标记(用于检测)、任选一个或多个TAG终止密码子和噬菌体蛋白pIII。因此，使用大肠杆菌的不同抑制菌株和非抑制菌株，并且添加葡萄糖、异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)或辅助噬菌体(例如VCS M13)，载体能够作为质粒进行复制，但却不表达，仅产生大量多肽文库成员或产生噬菌体，它们中的一些在其表面含有至少一个拷贝的多肽-pIII融合体。
编码本发明的双特异性配体的载体的构建采用常规连接技术。分离的载体或DNA片段被切割、修饰并重新连接成产生所需载体需要的形式。如有需要，可以用已知方式进行分析，以证实所构建的载体中存在正确序列。适于构建表达载体、制备体外转录物、将DNA引入宿主细胞以及进行评价表达和功能的分析的方法是本领域技术人员已知的。通过常规方法，例如DNA或RNA印迹分析、蛋白质印迹、DNA、RNA或蛋白质的斑点印迹、原位杂交、免疫细胞化学或者核酸或蛋白质分子的测序分析，检测样品中存在的基因序列，或定量其扩增和/或表达。如有需要，本领域技术人员会容易地知道如何改进这些方法。
骨架 骨架可以基于免疫球蛋白分子，或者可以是如上所述来源的非免疫球蛋白。双特异性配体的每个区都可以为不同骨架。如本文定义的优选免疫球蛋白骨架包括任何一个或多个选自以下的骨架至少包含以下部分的免疫球蛋白分子(i)抗体的CL(κ或λ亚类)区；或(ii)抗体重链的CH1区；包含抗体重链CH1区和CH2区的免疫球蛋白分子；包含抗体重链CH1区、CH2区和CH3区的免疫球蛋白分子；或任何(ii)亚类以及抗体的CL(κ或λ亚类)区。也可以包含铰链区域。这样的各区组合可以例如模拟天然抗体，例如IgG或IgM或其片段，例如Fv、scFv、Fab或F(ab’)2分子。本领域技术人员知道，该名单并非是详尽而无遗漏的。
蛋白质支架 各结合域包含蛋白质支架和一个或多个CDR，它们参与结构域与一个或多个表位的特异性相互作用。最好本发明的表位结合域包含3个CDR。合适的蛋白质支架包括选自以下的任何支架基于免疫球蛋白结构域的支架、基于纤连蛋白的支架、基于亲和体的支架、基于CTLA4的支架、基于伴侣分子例如GroEL的支架、基于脂质运载蛋白的支架和基于细菌Fc受体SpA和SpD的支架。本领域技术人员可以理解，该名单并非是详尽而无遗漏的 用于构建配体的支架 主链构象的选择 免疫球蛋白超家族成员都共享其多肽链的类似折叠。例如，尽管抗体在其一级序列上具有高度多样性，但是序列比较和晶体学结构已揭示，与预期相反，抗体的6个抗原结合环中有5个(H1、H2、L1、L2、L3)采用数目有限的主链构象或正则结构(Chothia和Lesk(1987)J.Mol.Biol.，196901；Chothia等(1989)Nature，342877)。因此，分析环长度和关键残基能够预测在大多数人抗体中存在的H1、H2、L1、L2和L3的主链构象(Chothia等(1992)J.Mol.Biol.，227799；Tomlinson等(1995)EMBO J.，144628；Williams等(1996)J.Mol.Biol.，264220)。尽管H3区在序列、长度和结构上更具多样性(因为使用D区段)，但是它也构成数目有限的短环长度的主链构象，这取决于环及抗体构架的关键位置上特定残基的长度和存在与否或残基种类(Martin等(1996)J.Mol.Biol.，263800；Shirai等(1996)FEBS Letters，3991)。
可设计配体和/或结构域文库，其中已选择出某些环长度和关键残基，以保证各成员的主链构象是已知的。如上所述，最好这些是天然存在的免疫球蛋白超家族分子的真实构象，以将它们是非功能性的机会降至最低。种系V基因区段用作一个合适的基本构架，用于构建抗体或T细胞受体文库；也可使用其它序列。可以低频率发生变异，使得少量功能性成员可具有改变的主链构象，这样的改变并不影响其功能。
正则结构理论也用于评价配体所编码的不同主链构象的数目，以预测基于双特异性配体序列的主链构象并选择不影响正则结构的用于多样化的残基。已经知道，在人Vκ区中，L1环可采用4种正则结构之一，L2环具有一种正则结构，而且90％的人Vκ区的L3环采用4或5种正则结构之一(Tomlinson等(1995)，出处同上)；因此，仅在Vκ区，不同正则结构就可组合产生一系列不同的主链构象。假定Vλ区为L1、L2和L3环编码不同系列的正则结构，且Vκ区和Vλ区可与任何VH区(其可为H1和H2环编码几种正则结构)配对，则这5个环所观察到的正则结构组合数量将会非常庞大。这表明主链构象多样性的产生对产生广泛范围的结合特异性来说可能是必不可少的。然而，通过构建基于一种已知主链构象的抗体文库，已经发现，与预期相反，主链构象的多样性并非是产生足以靶向几乎所有抗原的多样性所必需的。甚至更令人吃惊的是，该单一主链构象不一定是共有结构，共有结构是可以用作整个文库基础的一种天然构象。因此，在优选方面，本发明的配体具有一种已知主链构象。
所选的一种主链构象优选在所述免疫球蛋白超家族类型的分子中是常见的。当观察到大量天然存在的分子采用某种构象时，该构象是常见的。因此，在本发明的优选方面，单独考虑免疫球蛋白结构域的各结合环的不同主链构象的天然发生率，然后选择具有不同环的主链构象所需组合的天然存在的可变区。如果没有可用的，则可选择最接近的等同物。优选不同环的主链构象的所需组合是由所选种系基因区段(其编码所需主链构象)产生的。更优选所选种系基因区段在自然界频繁表达，最优选它们在所有天然种系基因区段中是最频繁表达的。
在设计配体(例如ds-dAb)或其文库时，可以单独考虑6个抗原结合环中每一个的不同主链构象的发生率。对于H1、H2、L1、L2和L3，选择被20％至100％的天然分子抗原结合环所采用的给定构象。通常观察到发生率在35％以上(即介于35％和100％之间)、理想地在50％以上乃至65％以上。因为绝大多数H3环没有正则结构，所以优先选择在确实展示正则结构的环中常见的主链构象。因此，对于每个环来说，选择天然库中最常观察到的构象。在人抗体中，各环最常见的正则结构(CS)如下H1-CS 1(表达库的79％)、H2-CS 3(46％)、L1-Vκ的CS 2(39％)、L2-CS 1(100％)、L3-Vκ的CS 1(36％)(计算假定κ:λ的比例为70:30，Hood等(1967)Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.，48133)。对于具有正则结构的H3环而言，具有从残基94到残基101的盐桥的7个残基的CDR3长度(Kabat等(1991)Sequences of proteins of immunological interest，美国健康和人类服务部)看来是最常见的。EMBL数据文库中至少有16个人类抗体序列具有构成该构象所需的H3长度和关键残基，并且在蛋白质数据库中至少有两个晶体结构可用作抗体建模的基础(2cgr和1tet)。最常表达的种系基因区段的正则结构组合是VH区段3-23(DP-47)、JH区段JH4b、Vκ区段O2/O12(DPK9)和Jκ区段Jκ1。VH区段DP45和DP38也是合适的。因此，这些区段可用于组合，作为构建具有所需单一主链构象的文库的基础。
或者，并非根据分离的各结合环的不同主链构象的天然发生率来选择单一主链构象，而是采用主链构象组合的天然发生率作为选择单一主链构象的基础。就抗体而言，例如，可以确定任何2、3、4、5或所有6个抗原结合环的正则结构组合的天然发生率。在此，优选所选构象在天然存在的抗体中是常见的，最优选它是天然库中最常观察到的。因此，在人抗体中，例如当考虑H1、H2、L1、L2和L3五个抗原结合环的天然组合时，确定最常见的正则结构的组合，然后结合最常见的H3环构象，作为选择单一主链构象的基础。
正则序列的多样化 如果具有所选几种已知的主链构象或者优选单一已知主链构象，可以通过改变分子的每个结合位点，构建本发明的双特异性配体(例如ds-dAb)或本发明所用的文库，以便产生具有结构和/或功能多样性的库。这表明，产生变异体，使得它们在其结构和/或功能上具有足够的多样性，使得它们能够提供一系列活性。
所需多样性通常是通过在一个或多个位置上改变所选分子而产生的。可以随机或优选选择要改变的位置。然后，可以如下达到变异通过随机化(其间残余氨基酸被任何氨基酸或其类似物(天然或合成的)所取代)，产生数量非常大的变异体；或者通过用一个或多个氨基酸的限定亚类来取代残余氨基酸，产生数目更有限的变异体。
已经报道了多种用于引入这样的多样性的方法。易错PCR(Hawkins等(1992)J.Mol.Biol.，226889)、化学诱变(Deng等(1994)J.Biol.Chem.，2699533)或细菌突变菌株(Low等(1996)J.Mol.Biol.，260359)可用于将随机突变引入编码分子的基因内。使所选位置发生突变的方法也是本领域众所周知的，包括使用错配寡核苷酸或简并寡核苷酸，使用或不使用PCR。例如，通过抗原结合环的定向突变，已经产生了一些合成抗体文库。使结合人破伤风类毒素的Fab的H3区随机化，以便产生一系列新的结合特异性(Barbas等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，894457)。随机或半随机H3和L3区已经附加到种系V基因区段上，产生具有未突变构架区的大文库(Hoogenboom和Winter(1992)J.Mol.Biol.，227381；Barbas等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，894457；Nissim等(1994)EMBOJ.，13692；Griffiths等(1994)EMBO J.，133245；De Kruif等(1995)J.Mol.Biol.，24897)。这样的多样化已延伸至包括某些或所有其它抗原结合环(Crameri等(1996)Nature Med.，2100；Riechmann等(1995)Bio/Technology，13475；Morphosys，WO97/08320，出处同上)。
因为环随机化仅对H3就具有产生约超过1015种结构的潜力，而对其它5个环也具有产生类似的大数量变异体的潜力，所以不能通过使用现有的转化技术乃至使用无细胞系统来产生代表所有可能组合的文库。例如，在迄今为止所构建的最大文库之一中，产生6 x 1010个不同抗体，这仅仅是该设计文库的潜在多样性的一部分(Griffiths等(1994)，出处同上)。
优选地，只有直接参与产生或修饰双特异性配体分子的每个结构域所需功能的残基，才被多样化。对于许多分子而言，每个结构域的功能是要结合靶标的，因此，多样性应该集中在靶结合位点中，而避免改变对分子总体包装或保持所选主链构象来说必不可少的残基。正则序列在用于抗体域时的多样化 就基于抗体的配体(例如ds-dAb)而言，每个靶的结合位点都是最常见的抗原结合位点。因此，优选只有在抗原结合位点的那些残基才改变。在人抗体库中，这些残基极端多样性，已知让其接触高分辨率抗体/抗原复合物。例如，在L2中，已知位置50和53在天然存在的抗体中是不同的，并且观察到它们与抗原接触。相比之下，常规方法应当已经使相应互补决定区(CDR1)(如Kabat等(1991，出处同上)定义)中的所有残基多样化，与本发明所用的文库中多样化的两个相比有约七个残基。这显示了产生一系列抗原结合特异性所需的功能多样性的显著改善。
在自然界，抗体多样性是两个过程的结果种系V、D和J基因区段的体细胞重组，产生幼稚(naive)初级库(所谓的种系和连接多样性)；以及所得重排V基因的体细胞高变。人类抗体序列的分析已表明，初级库中的多样性集中在抗原结合位点的中心，而体细胞高变则将多样性扩散到抗原结合位点周围的区域，而这些区域在初级库中是高度保守的(参见Tomlinson等(1996)J.Mol.Biol.，256813)。此互补性可能逐渐成为检索序列空间的有效策略，而且，尽管显然是抗体所特有的，但是它也可容易地用于其它多肽库。改变的残基是构成靶的结合位点的残基的亚类。如有需要，在选择期间的不同时期，改变靶结合位点中残基的不同(包括重叠)亚类。
就抗体库而言，可产生起始“幼稚”库(initial“naive”repertoire)，其中抗原结合位点的某些而不是全部的残基出现多样化。在这种情况下，本文所用的术语“幼稚(naive)”是指没有预定靶标的抗体分子。这些分子类似于没有经历免疫多样化的个体(胎儿和新生儿个体就是这种情况)的免疫球蛋白基因所编码的那些分子，所述个体的免疫系统尚未受到各种抗原性刺激的攻击。然后，针对一系列抗原或表位来选择该库。如有必要，还可在起始库中被多样化的区域之外引入其它多样性。可以选择具有修饰功能、特异性或亲和力的这种成熟的库。
用于构建其中抗原结合位点中的某些或所有残基都已改变的双特异性配体的结合域幼稚库是本领域已知的。(参见WO 2004/058821、WO 2004/003019和WO 03/002609)。“初级”文库模拟天然初级库，其多样性限于抗原结合位点中心的残基，它们在种系V基因区段中具有多样性(种系多样性)，或者在重组过程中被赋予多样性(连接多样性)。这些多样化的残基包括但不限于H50、H52、H52a、H53、H55、H56、H58、H95、H96、H97、H98、L50、L53、L91、L92、L93、L94和L96。在“体细胞”文库中，多样性局限于重组过程中多样化的残基(连接多样性)或者是高度体细胞突变的。这些多样化的残基包括但不限于H31、H33、H35、H95、H96、H97、H98、L30、L31、L32、L34和L96。已知适于这些文库多样性的以上列出的所有残基都接触一个或多个抗体-抗原复合物。因为在这两种文库中，抗原结合位点中并非所有残基都改变，在选择当中，通过改变剩余残基而掺入另外的多样性，如果需要这样做的话。对本领域技术人员显而易见的是，任何这些残基(或者包括抗原结合位点的其它残基)的任何亚类都可以用于抗原结合位点的起始和/或后来的多样化。
在用于本发明的文库构建中，所选位置的多样化通常是在核酸水平上进行，即通过改变指定多肽序列的编码序列，使得许多可能的氨基酸(所有20种或其亚类)可以在该位置掺入。采用IUPAC命名法，最通用的密码子是NNK，它编码所有氨基酸以及TAG终止密码子。优选使用NNK密码子，以便引入所需多样性。也可以使用达到相同末端的其它密码子，包括NNN密码子，该密码子导致产生另外的终止密码子TGA和TAA。
人抗体的抗原结合位点中侧链多样性的特征明显对某些氨基酸残基有偏倚。如果统计每个VH、Vκ和Vλ区中的10个最多变的位置的氨基酸组成，则超过76％的侧链多样性来自仅7个不同残基，它们是丝氨酸(24％)、酪氨酸(14％)、天冬酰胺(11％)、甘氨酸(9％)、丙氨酸(7％)、天冬氨酸(6％)和苏氨酸(6％)。这种针对可提供主链柔性的亲水性残基和小残基的偏倚可能反映了倾向于结合广泛范围的抗原或表位的表面进化，并且可能有助于解释初级库中所需的抗体混杂。
因为优选模拟这样的氨基酸分布，所以在有待改变位置上的氨基酸分布优选模拟在抗体的抗原结合位点所见到的那些。这种允许针对一系列靶抗原选择某些多肽(不仅是抗体多肽)的氨基酸取代中的偏倚，易于用于任何多肽库。有多种方法用于在有待改变的位置上使氨基酸分布发生偏倚(包括使用三核苷酸诱变，参见WO97/08320)，其中优选的方法因易于合成而采用常规简并密码子。通过比较由简并密码子所有组合所编码的氨基酸分布型(在各位置上具有等比例的单、双、三和四重简并性)与天然氨基酸的使用，可以计算出最具代表性的密码子。密码子(AGT)(AGC)T、(AGT)(AGC)C和(AGT)(AGC)(CT)，即使用IUPAC命名法分别为DVT、DVC和DVY，就是最接近所需氨基酸分布型的密码子它们编码22％的丝氨酸以及11％的酪氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、苏氨酸和半胱氨酸。因此，优选的文库是在各多样化位置上用DVT、DVC或DVY密码子构建的。
治疗和诊断组合物及其用途 本发明提供包含本发明的配体和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的组合物，以及使用本发明配体或组合物的治疗和诊断方法。本发明方法的配体可用于体内治疗和预防用途、体内诊断用途等。
本发明配体的治疗和预防用途包括将本发明配体给予受体哺乳动物，例如人。这样的配体以高亲和力和/或亲合力结合靶。在某些实施方案中，例如IgG样配体，配体可通过例如抗体依赖性细胞毒性，允许细胞毒性细胞募集以介导对肿瘤细胞系的杀伤。
优选将至少90-95％同质性(homogeneity)的大致纯的配体给予哺乳动物，最优选98-99％以上同质性供药用，尤其是当哺乳动物是人时。一旦部分纯化或纯化至所需同质性，配体就可用于诊断或治疗(包括离体)或用于开发和实施测定方法、免疫荧光染色等(Lefkovite和Pernis，(1979和1981)Immunological Methods，第I和II卷，Academic Press，NY)。
例如，本发明的配体通常可用于预防、抑制或治疗疾病状态。例如，可以给予配体，以治疗、抑制或预防慢性炎性疾病、变应性超敏反应、癌症、细菌性或病毒性感染、自身免疫性疾病(包括但不限于I型糖尿病、哮喘、多发性硬化、类风湿性关节炎、青少年类风湿性关节炎、银屑病性关节炎、脊椎关节病(spondylarthropathy)(例如强直性脊柱炎)、系统性红斑狼疮、炎性肠病(例如克罗恩病(Crohn’s disease)、溃疡性结肠炎)、重症肌无力和贝赫切特综合征(Behcet’s syndrome))、银屑病、子宫内膜异位症和腹部粘连(例如腹部手术后)。
配体可用于治疗这样的感染性疾病其中被感染因子感染的细胞包含的细胞表面EGFR水平要比未感染细胞的高，或者包含的一个或多个细胞表面靶标在未感染细胞上并不存在，例如由感染因子(例如细菌、病毒)编码的蛋白质。
能够结合EGFR的本发明配体可被表达EGFR的细胞内化(例如胞吞)，并可在胞内递送治疗剂(例如毒素)(例如递送结合胞内靶的dAb)。另外，配体提供了每个能够特异性结合胞内靶的结合域(例如dAb单体)可递送到胞内环境的手段。该策略需要例如具有能使其保留在细胞内的功能的物理性质的结合域。或者，如果最终目的地胞内区室正在氧化，则良好折叠的配体可能不一定是无二硫化物的。
在本申请中，术语“预防”包括在诱发疾病之前给予保护性组合物。“抑制”指在诱发事件后但在疾病有临床表现前给予组合物。“治疗”包括在疾病症状出现后给予保护性组合物。治疗包括改善与疾病相关的症状，还预防或延迟疾病的发作，以及减轻疾病症状的严重性或减少频率。
术语“癌症”是指哺乳动物中通常以不受调节的细胞增殖或存活为特征的病理状态。癌症的实例包括但不限于癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病以及淋巴系统恶性肿瘤。更具体地说，癌症的实例包括鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)、肺癌(例如小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(包括胃肠癌)、胰腺癌、成胶质细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、胆囊癌、肝细胞瘤、乳癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、多发性骨髓瘤、慢性髓细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌、头颈部癌等。以在癌细胞表面表达EGFR为特征的癌症(表达EGFR的癌症)包括例如膀胱癌、卵巢癌、结肠直肠癌、乳癌、肺癌(例如非小细胞肺癌)、胃癌、胰腺癌、前列腺癌、头颈部癌、肾癌和胆囊癌。
可用于评价本发明配体预防、治疗或抑制疾病(例如癌症)的功效的动物模型系统是可获得的。合适的癌症模型包括例如人类癌症在动物模型中的异种移植和原位移植模型，例如SCID-hu骨髓瘤模型(Epstein J.和Yaccoby，S.，Methods Mol.Med.113183-90(2005)，Tassone P等，Clin Cancer Res.11(11)4251-8(2005))、人肺癌的小鼠模型(例如Meuwissen R和Berns A，Genes Dev.19(6)643-64(2005))，以及转移癌的小鼠模型(例如Kubota T.，J Cell Biochem.56(1)4-8(1994))。
通常，纯化形式的本发明配体可与药理上合适的载体一起使用。通常，这些载体包括水性或醇/水溶液剂、乳剂或混悬剂，包括盐水和/或缓冲介质。胃肠外溶媒包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠以及乳酸化林格液。如果需要在混悬剂中维持多肽复合物的话，则可以从增稠剂中选出合适的生理上可接受的辅料，这些增稠剂例如为羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、明胶和藻酸盐。
静脉内溶媒包括液体和营养补充剂和电解质补充剂，例如基于林格氏葡萄糖的那些。也可含有防腐剂和其它添加剂，例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体(Mack(1982)Remington′s PharmaceuticalSciences，第16版)。各种合适制剂都可采用，包括延长释放的制剂。
可以单独给予的组合物形式或者与其它药物一起使用本发明的配体。配体可与一种或多种其它治疗药或活性剂一起给予和/或配制。当配体与其它治疗药一起给予时，配体可以在给予其它药物之前、同时或之后给予。通常，配体和其它药物的给予方式能提供重叠疗效。可给予本发明配体或与本发明配体一起配制的其它药物包括例如各种免疫治疗药物，例如环孢菌素、甲氨蝶呤、阿霉素或顺铂、抗生素、抗真菌药、抗病毒药和免疫毒素。例如，当给予拮抗剂以预防、抑制或治疗肺部炎症或呼吸疾病时，其可协同给予磷酸二酯酶抑制剂(例如磷酸二酯酶4抑制剂)、支气管扩张药(例如β2-激动剂、抗胆碱能药、茶碱)、短效β-激动剂(例如舒喘灵(albuterol)、沙丁胺醇(salbutamol)、班布特罗、非诺特罗、异他林(isoetherine)、异丙肾上腺素、左沙丁胺醇、奥西那林、吡布特罗、特布他林和甲磺酸比托特罗吸入剂(tornlate))、长效β-激动剂(例如福莫特罗和沙美特罗)、短效抗胆碱能药(例如异丙托溴铵和氧托溴铵)、长效抗胆碱能药(例如噻托品)、茶碱(例如短效剂型、长效剂型)、吸入类固醇(例如倍可松(beclomethasone)、倍氯米松(beclometasone)、布地奈德、氟尼缩松、丙酸氟替卡松和曲安西龙)、口服类固醇(例如甲泼尼龙、泼尼松龙、强的松龙(prednisolon)和泼尼松)、短效β-激动剂和抗胆碱能药的组合(例如舒喘灵/沙丁胺醇/异丙阿托品(ipratopium)和非诺特罗/异丙阿托品)、长效β-激动剂和吸入类固醇的组合(例如沙美特罗/氟替卡松和福莫特罗/布地奈德)以及粘液溶解药(例如厄多司坦、乙酰半胱氨酸、溴己新(bromheksin)、羧甲司坦、愈创甘油醚(guiafenesin)和碘化甘油)一起给予。
本发明的配体可与各种各样合适的共治疗剂一起给予(例如治疗癌症、炎性疾病或其它疾病)，所述共治疗剂包括细胞因子、止痛药/退热药、止吐药和化疗药。其它合适的共治疗药包括免疫抑制药，选自环孢菌素、硫唑嘌呤、麦考酚酸、麦考酚酸吗乙酯、皮质类固醇、甲氨蝶呤、金盐、柳氮磺吡啶、抗疟药、布喹那、来氟米特、咪唑立宾、15-脱氧精胍菌素、6-巯基嘌呤、环磷酰胺、雷帕霉素、他克莫司(FK-506)、OKT3和抗胸腺细胞球蛋白；抗炎药，选自阿司匹林、其它水杨酸盐、甾体类药物、NSAID(非甾体类抗炎药)、Cox-2抑制剂和DMARD(疾病缓解抗风湿药)；抗银屑病药，选自煤焦油、维生素A、地蒽酚、卡泊三烯(calcipotrien)、tarazotene、皮质类固醇、甲氨蝶呤、类视色素、环孢菌素、依那西普、阿来西普、依法珠单抗(efaluzimab)、6-硫鸟嘌呤、麦考酚酸吗乙酯、他克莫司(FK-506)和羟基脲。
细胞因子包括但不限于淋巴因子、肿瘤坏死因子、肿瘤坏死因子样细胞因子、淋巴毒素、干扰素、巨噬细胞炎性蛋白、粒细胞单核细胞集落刺激因子、白介素(包括但不限于白介素-1、白介素-2、白介素-6、白介素-12、白介素-15、白介素-18)、生长因子(包括但不限于例如生长激素、胰岛素样生长因子1和2(IGF-1和IGF-2)、粒细胞集落刺激因子(GCSF)、血小板衍生生长因子(PGDF)、表皮生长因子(EGF))和用于刺激红细胞生成的药物，例如重组人促红细胞生成素(Epoetinalfa)、EPO、激素激动剂、激素拮抗剂(例如氟他胺、他莫昔芬、醋酸亮丙瑞林(LUPRON))和类固醇药(例如地塞米松、类视色素、倍他米松、氢化可的松、可的松、泼尼松、去氢睾酮、糖皮质激素、盐皮质激素、雌激素、睾酮、孕酮)。
镇痛药/退热药可包括但不限于阿司匹林、对乙酰氨基酚、布洛芬、萘普生钠、盐酸丁丙诺啡、盐酸丙氧芬、萘磺酸丙氧芬、盐酸度冷丁、氢吗啡酮、硫酸吗啡、盐酸羟考酮、磷酸可待因、双氢可待因酒石酸氢盐、盐酸喷他佐辛、氢可酮酒石酸氢盐、酒石酸左啡诺、二氟尼柳、水杨酸三乙醇胺、盐酸纳布啡、甲芬那酸、酒石酸布托啡诺、水杨酸胆碱、布他比妥、柠檬酸苯托沙敏、柠檬酸苯海拉明、左美丙嗪、盐酸桂美君、甲丙氨酯等。
还可以共给予止吐药，以预防或治疗恶心和呕吐，例如合适的止吐药包括盐酸美克洛嗪、大麻隆、丙氯拉嗪、茶苯海明、盐酸异丙嗪、硫乙拉嗪、东莨菪碱等。
化疗药在本文中作为术语使用时包括但不限于例如抗微管药物，例如泰素(紫杉醇)、泰索帝(多西他赛)；烷化剂，例如环磷酰胺、卡莫司汀、洛莫司汀和苯丁酸氮芥；细胞毒性类抗生素，例如放线菌素D、多柔比星、丝裂霉素C和博来霉素；抗代谢药，例如阿糖胞苷、吉西他滨、甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶；抗有丝分裂药，例如长春花属生物碱，例如依托泊苷、长春碱和长春新碱；以及其它化疗药，例如顺铂、达卡巴嗪、丙卡巴肼和羟基脲，以及它们的组合。
本发明的配体可连同其它治疗剂一起用于治疗癌症。例如，本发明的配体可连同化疗药或包含(至少一种)化疗药的抗肿瘤组合物一起给予。在这样的治疗方案中，最好可以减少为达到有效而必需给予的化疗药的量。因此，本发明提供治疗癌症的方法，包括给予有需要的患者治疗有效量的本发明配体和化疗药，其中化疗药以低剂量给予。一般来说，与本发明配体合用的化疗药的量是正常给予患者的化疗药单用剂量的约80％、或约70％、或约60％、或约50％、或约40％、或约30％、或约20％、或约10％以下。因此，在化疗药引起有害的或不需要的副作用(在较低剂量时可被降低或消除)时联合疗法尤其有用。
药物组合物可包括多种细胞毒性剂或其它药物连同本发明配体乃至具有不同特异性的本发明配体组合(例如使用不同靶抗原或表位选择的配体)的“合剂”，无论它们是否在给予前混合。
本发明药物组合物的给药途径可以为任何合适途径，例如本领域普通技术人员公知的任何途径。对于治疗(包括但不限于免疫治疗)来说，可以采用标准技术，将本发明配体给予任何患者。可通过任何合适方式给予，包括胃肠外、静脉内、肌内、腹膜内、经皮、鞘内、关节内、通过肺部途径，或者还合适地直接输注(例如用导管)。给药剂量和频次将取决于患者年龄、性别和状况、同时给予的其它药物、禁忌和临床医生要考虑的其它参数。按照指示，可以局部给药(例如通过肺部给药(例如鼻内给药)局部给予至肺部，或者局部直接注射入肿瘤中)或系统给药。
可将本发明配体冻干后贮存备用，使用前重配在合适载体中。已表明该技术对常规免疫球蛋白来说是有效的，可以采用本领域已知的冻干和重配技术。本领域技术人员可以理解，冻干和重配可导致不同程度的抗体活性丧失(例如对于常规免疫球蛋白，IgM抗体要比IgG抗体活性损失更高)，可能需要调高使用水平以便补偿。
可以给予含有配体的组合物，用于预防性和/或治疗性治疗。在某些治疗应用中，足以达到至少部分抑制、遏制、调节、杀伤或某些其它可检测参数的所选细胞群体的用量，定义为“治疗有效量”。尽管达到该剂量所需的用量将取决于疾病严重程度和患者的一般健康状况，但是通常范围为0.005-5.0mg配体/kg体重，更常用的剂量为0.05-2.0mg/kg/剂。对于预防应用而言，也可以类似或稍低剂量给予含有本发明配体或其合剂的组合物，以预防、抑制或延迟疾病发作(例如维持缓解或静止状态，或者预防急性期)。熟练的临床医生能够确定合适的给药间隔，以便治疗、抑制或预防疾病。当给予配体治疗、抑制或预防疾病时，可以例如约10μg/kg至约80mg/kg、约100μg/kg至约80mg/kg、约1mg/kg至约80mg/kg、约1mg/kg至约70mg/kg、约1mg/kg至约60mg/kg、约1mg/kg至约50mg/kg、约1mg/kg至约40mg/kg、约1mg/kg至约30mg/kg、约1mg/kg至约20mg/kg、约1mg/kg至约10mg/kg、约10μg/kg至约10mg/kg、约10μg/kg至约5mg/kg、约10μg/kg至约2.5mg/kg、约1mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约6mg/kg、约7mg/kg、约8mg/kg、约9mg/kg或约10mg/kg的剂量最多给予每天4次、每周两次、每周一次、每两周一次、每月一次或每两月一次。在具体的实施方案中，以约10μg/kg至约10mg/kg(例如约10μg/kg、约100μg/kg、约1mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约6mg/kg、约7mg/kg、约8mg/kg、约9mg/kg或约10mg/kg)的剂量每两周一次或每月一次给予双特异性配体，以治疗、抑制或预防慢性炎性疾病。
在具体的实施方案中，本发明的配体以提供体内饱和EGFR或所需血清浓度的剂量给药。熟练医师可确定达到饱和的合适给药，例如通过滴定配体和监测表达EGFR的细胞上的自由结合位点的数量或配体的血清浓度。包括给予治疗剂以实现目标饱和或所需的药物血清浓度的治疗方案是本领域常见的，尤其是在肿瘤学领域。
用本文所述的组合物进行的治疗被视为“有效”的条件是一种或多种症状相对于治疗前存在的所述症状或者相对于未用所述组合物或其它合适对照治疗的个体(人或模型动物)中的所述症状被减轻(例如达至少10％或在临床评价量表中达至少一个点)。尽管症状随所针对的疾病或障碍而明显不同，但是可以由一般熟练的临床医生或技术人员进行测定。这些症状例如可如下测定监测疾病或障碍的一种或多种生化指标水平(例如与疾病相关的酶或代谢物水平，受累细胞数量等)、监测身体表现(例如炎症、肿瘤大小等)或者可接受的临床评价量表，例如扩展残疾状态量表(Expanded Disability Status Scale)(用于多发性硬化)、Irvine炎性肠病问卷调查表(32点评价表，评价有关肠功能、全身症状、社交功能和情感状态的生活质量—评分范围为32-224，评分越高表明生活质量越好)、类风湿性关节炎生活质量量表或本领域已知的其它可接受的临床评价量表。疾病或障碍症状持续(例如一天以上，优选超过一天)下降达至少10％或者在给定临床量表上下降达一个点或多个点，就表明是“有效”治疗。同样，如果一种或多种症状的发作或严重程度相对于未经本文所述的组合物治疗的类似个体(人或动物模型)的所述症状被延迟、减少或消除，则用所述组合物进行预防就是“有效”的。
含有本发明配体的组合物可用于预防和治疗装置，以帮助改变、失活、杀伤或去除哺乳动物体内的所选靶细胞群体。另外，本文所述的配体和所选多肽库可用于离体或体外选择性杀伤、耗尽靶细胞群体或从异质细胞群体中有效去除靶细胞群体。可以按照标准技术，将来自哺乳动物的血在离体情况下与配体(例如抗体、细胞表面受体或其结合蛋白)混合，由此杀伤或从血液中除去不想要的细胞，再回输到哺乳动物体内。
在一个实施方案中，本发明涉及将抗血管生成治疗(抗VEGF治疗)递送到含有表达或过量表达EGFR细胞的部位的方法，该方法包括给予需要的患者有效量的具有VEGF和EGFR结合特异性的配体。
本发明也涉及具有VEGF和EGFR结合特异性的配体在将抗血管生成治疗(抗VEGF治疗)递送到含有表达或过量表达EGFR细胞的部位的用途。本发明也涉及具有VEGF和EGFR结合特异性的配体在制备用于将抗血管生成治疗(抗VEGF治疗)递送到含有表达或过量表达EGFR细胞的部位的药物中的用途，或者制备在含有过量表达EGFR的细胞的部位抑制血管生成的药物中的用途。
在具体实施方案中，本发明涉及治疗癌症的方法，该方法包括给予有需要的患者治疗有效量的本文所述的配体，其具有VEGF和EGFR结合特异性。在具体实施方案中，患者患有表达EGFR的癌症，例如膀胱癌、卵巢癌、结肠直肠癌、乳癌、肺癌(例如非小细胞肺癌)、胃癌、胰腺癌、前列腺癌、头颈部癌、肾癌和胆囊癌。
在其它实施方案中，本发明涉及治疗癌症的方法，该方法包括给予有需要的患者治疗有效量的本文所述的配体(例如具有VEGF结合特异性的配体、具有EGFR结合特异性的配体、具有VEGF和EGFR结合特异性的配体)和抗肿瘤组合物，其中所述抗肿瘤组合物包含至少一种选自以下的化疗药烷化剂、抗代谢药、叶酸类似物、嘧啶类似物、嘌呤类似物和相关抑制剂、长春花属生物碱、表鬼臼毒素、抗生素、L-天冬酰胺酶、拓扑异构酶抑制剂、干扰素、铂配位络合物、蒽二酮取代脲、甲基肼衍生物、肾上腺皮质抑制剂、肾上腺皮质类固醇、孕酮、雌激素、抗雌激素药、雄激素、抗雄激素药和促性腺激素释放激素类似物。在某些实施方案中，化疗药选自顺铂、地卡巴嗪(dicarbazine)、放线菌素D、氮芥、链佐星、环磷酰胺、卡培他滨、卡莫司汀、洛莫司汀、多柔比星、柔红霉素、丙卡巴肼、丝裂霉素、阿糖胞苷、依托泊苷、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、长春碱(vinbiastine)、长春新碱、博来霉素、紫杉醇、多西他赛、doxetaxe、阿地白介素、天冬酰胺酶、白消安、卡铂、克拉曲滨、达卡巴嗪、氟尿苷、氟达拉滨、羟基脲、异环磷酰胺、干扰素α、伊立替康、亮丙立德、亚叶酸、甲地孕酮、美法仑、巯基嘌呤、奥沙利铂、普卡霉素、米托坦、培门冬酶、喷司他丁、哌泊溴烷、普卡霉素、链佐星、他莫昔芬、替尼泊苷、睾内酯、硫鸟嘌呤、塞替派、乌拉莫司汀、长春瑞滨、苯丁酸氮芥、泰素、其它生长因子受体拮抗剂和任何上述药物的组合。
用于评价配体的测定 可使用任何合适的体外或体内测定，对本发明的配体进行测定。例如，使用本文所述的受体结合测定或生物测定。
VEGF活性的生物测定 该生物测定是检测配体(例如dAb)中和VEGF诱导的HUVE(人血管内皮)细胞增殖的能力。将接种在96孔板中的HUVE细胞与预先平衡的VEGF和dAb蛋白一起孵育72小时。然后用细胞活力染料测定细胞数目。
该测定进行如下。从亚汇合的175cm2瓶上将HUVE细胞用胰蛋白酶水解。吸出培养基，细胞用5ml胰蛋白酶洗涤，再在室温下与2ml胰蛋白酶一起孵育5分钟。用手叩瓶，让细胞从瓶底轻轻脱落。将8ml诱导培养基加入到瓶内，吸打细胞以分散任何团块。活细胞用锥虫蓝染色计数。
离心细胞，在诱导培养基中洗涤2次，离心细胞，每次洗涤后都吸出原培养基。最后一次吸出后，将细胞稀释至105细胞/ml(在诱导培养基中)并以100μl/孔接种到96孔板中(10,000细胞/孔)。将该板在37℃孵育>2小时，让细胞贴壁。
将含有40ng/ml VEGF165(终浓度为10ng/ml)的60μl dAb蛋白和60μl诱导培养基加入到V形底96孔板中，用膜封口。然后dAb/VEGF混合物在37℃孵育0.5-1小时。
从培养箱中取出dAb/VEGF板，将100μl溶液加入到含有HUVEC板的各孔(终体积为200μl)。该板再放回37℃培养箱达至少72小时。
对照孔包括以下含细胞、但没有VEGF的孔；含细胞、阳性对照中和抗VEGF抗体和VEGF的孔；和只含细胞和VEGF的对照孔。
细胞活力测定如下加入20μl/孔Celltiter96试剂，将该板在37℃孵育2-4小时，直到显现褐色。加入20μl/孔10％(w/v)SDS，终止反应。用Wallac微量板读数器在490nm处读取吸光度。
所有其它值减去无VEGF对照孔的值得出吸光度。吸光度与细胞数目成比例。含对照抗VEGF抗体的对照孔也应当表现出最少细胞增殖。仅含VEGF的孔应当表现出最大细胞增殖。
实施例 实施例1.VEGF受体结合测定 VEGF是内皮细胞在体外的特异性促分裂原和体内强效血管生成因子，在各类肿瘤中高水平表达的蛋白质。它是45kDa糖蛋白，其同型二聚体具有活性。已经描述了若干同种型，其通过mRNA可变剪接而发生。在这些同种型中，看来VEGF-121和VEGF-165是最丰富的。
VEGF对内皮细胞的特异性作用主要受到两类受体酪氨酸激酶(RTK)即VEGF R1(Flt-1)和VEGF R2(KDR/Flk-1)的调节。然而，看来VEGF活性(例如促分裂原活性、趋化性和对形态变化的诱导)是由VEGF R2介导，虽然这两类受体一旦结合VEGF都会经历磷酸化。
VEGF受体2结合测定 该方法介绍了VEGF受体结合测定，用于测定配体(例如dAb)阻止VEGF-165与VEGF受体2结合的能力。重组人VEGF R2/Fc嵌合体用于该项测定，其包括与人IgG1Fc区融合的人VEGF R2胞外结构域。简而言之，受体捕获到ELISA板上，将该板封闭以防非特异性结合。加入VEGF-165和配体的混合物，洗板后，用生物素化抗VEGF抗体和辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗生物素抗体，测定结合受体的VEGF-165。用发色底物让该板显色，在450nm处读取OD。如果dAb阻止VEGF与受体结合，则检测不到颜色。
测定进行如下。96孔Nunc Maxisorp测定板的各孔用浓度为0.5μg/ml的100μl重组人VEGF R2/Fc(R&D Systems，目录号357-KD-050)的碳酸盐缓冲液在4℃包被过夜。各孔用0.05％吐温/PBS洗涤3次，再用PBS洗涤3次。加入200μl/孔2％ BSA的PBS，封闭该板，将该板在室温下孵育至少1小时。
洗涤各孔(同上)，将50μl/孔的配体加入各孔中。将浓度为6ng/ml的50μl VEGF的稀释液(终浓度为3ng/ml)加入各孔中，将板子在室温下孵育2小时(对于上清液的测定；80μl上清液加入各孔中，然后是浓度为15ng/ml的20μl VEGF)。
以下对照包括0ng/ml VEGF(仅有稀释液)；3ng/ml VEGF(R&DSystems，目录号293-VE-050)；3ng/ml VEGF和0.1μg/ml抗VEGF中和抗体(R&D Systems cat#MAB293)。
洗涤该板(同上)，加入0.5μg/ml100μl生物素化抗VEGF抗体(R&D Systems，目录号BAF293)的稀释液，在室温下孵育2小时。
洗涤各孔(同上)，加入100μl HRP缀合的抗生物素抗体(1:5000在稀释液中稀释；Stratech，目录号200-032-096)。将该板在室温下孵育1小时。
洗涤该板(同上)，确保任何痕量吐温20都被除去，以限制后续过氧化物酶测定的背景并有助于防止测定板各孔中的气泡(这会造成不正确的OD读数)。
将100μl SureBlue 1-Component TMB MicroWell过氧化物酶溶液加入到各孔中，让该板在室温下放置至多20分钟。当结合HRP标记的缀合物与底物反应时，显现深蓝色可溶性产物。加入100μl 1M盐酸终止反应(蓝色变为黄色)。在96孔板读数器中，在加酸30分钟之内，读取该板在450nm处的OD。OD450nm与结合的链霉抗生物素-HRP缀合物成比例。
对于某些测定，加入蛋白L。蛋白L交联两个dAb单体。
对照的预期结果如下0ng/ml VEGF应当得到<0.15 OD的低信号；3ng/ml VEGF应当得到>0.5 OD的信号；而3ng/ml VEGF与0.1μg/ml中和抗体预孵育应当得到<0.2 OD的信号。
VEGF受体1结合测定 该测定检测了VEGF-165与VEGF R1的结合以及配体封闭该相互作用的能力。重组人VEGF R1/Fc嵌合体用于该项测定，其包括与人IgG1Fc区融合的人VEGF R1胞外结构域。受体捕获到ELISA板上，将该板封闭以防非特异性结合。加入VEGF-165和配体的混合物，洗板后，用生物素化抗VEGF抗体和HRP缀合的抗生物素抗体，测定结合受体的VEGF-165。用发色底物让该板显色，在450nm处读取OD。
测定进行如下。96孔Nunc Maxisorp测定板的各孔用浓度为0.1μg/ml的100μl重组人VEGF R1/Fc(R&D Systems，目录号321-FL-050)的碳酸盐缓冲液在4℃包被过夜。各孔用0.05％吐温/PBS洗涤3次，再用PBS洗涤3次。
加入200μl/孔的2％ BSA的PBS，封闭该板，将该板在室温下最少孵育1小时。
洗涤各孔(同上)，将50μl/孔的纯化dAb蛋白加入各孔中。将浓度为1ng/ml的50μl VEGF的稀释液(终浓度为500pg/ml)加入各孔中，将该板在室温下孵育1小时(对于上清液的测定；80μl上清液加入各孔中，然后是20μl VEGF@2.5ng/ml)。
以下对照包括0ng/ml VEGF(仅有稀释液)；500pg/ml VEGF；和500pg/mlVEGF和0.1μg/ml抗VEGF的抗体(R&D Systemscat#MAB293)。
洗涤各孔(同上)，加入50ng/ml 100μl生物素化抗VEGF抗体的稀释液，在室温下孵育1小时。
洗涤各孔(同上)，加入100μl HRP缀合的抗生物素抗体(1:5000在稀释液中稀释)。将该板在室温下孵育1小时。
洗涤该板(同上)，确保任何痕量吐温20都被除去，以限制后续过氧化物酶测定的背景并有助于防止测定板各孔中的气泡(这会造成不正确的OD读数)。
向各孔中加入100μl SureBlue 1-Component TMB Micro Well过氧化物酶溶液，让该板在室温下最多放置20分钟。当结合HRP标记的缀合物与底物反应时，呈现深蓝色可溶性产物。加入100μl 1M盐酸终止反应。在96孔板读数器中，在加酸30分钟之内，读取该板在450nm处的OD。OD450nm与结合的链霉抗生物素-HRP缀合物成比例。
对照的预期结果如下0ng/ml VEGF应当得到<0.15 OD的低信号；500pg/ml VEGF应当得到>0.8OD的信号；而500pg/ml VEGF与0.1μg/ml中和抗体预孵育应当得到<0.3OD的信号。
表1 当用不同浓度在低密度BIAcore芯片上测定时，TAR15-1的Kd为50-80nM。在一个浓度(50nM)时，其它VK dAb在低密度芯片上被忽略。不同dAb表现出不同的结合动力学。
表2 *dAb是在50nM时测定的 在一个浓度(50nM)时，VH dAb在低密度VEGF芯片上被忽略。不同dAb表现出不同的结合动力学。
实施例2.EGFR结合 EGFR结合测定 将25ul配体(例如dAb)接种到96孔板上，然后加入25ul链霉抗生物素-Alexa Fluor(lug/ml)(Molecular Probes)和25ul A431细胞(ATCC No.CRL-1555)(8 x 105/ml)。所有试剂都用PBS/1％ BSA配制。该板在室温下孵育30分钟。
不要扰动细胞，将40ng/ml 25ul生物素化EGF(Invitrogen)加入到各孔，将该板在室温下孵育3小时。用AB8200 Cellular DetectionSystems(Applied Biosystems)检测荧光。
抑制生物素化EGF与A431细胞上表达的EGFR的结合的配体(例如dAb)，导致较低的荧光计数。没有配体的各孔提供最大荧光的参考值(即生物素化EGF结合)，而没有配体或生物素化EGF的各孔提供背景荧光水平的参考值。这些对照包括在所有测定中。
用某些抗EGFR dAb，在该测定中得到的结果见下表3。
EGFR激酶测定 在96孔板中，将5 x 104 A431细胞(ATCC No.CRL-1555)接种到补充了10％胎牛血清的RPMI-1640各孔中。将该板在37℃/5％ CO2孵育过夜，让细胞贴壁，然后原培养基更换为RPMI-1640。该板在37℃/5％ CO2孵育4小时。将配体(在RPMI-1640中制备)加入到各孔中，该板在37℃/5％ CO2孵育45分钟。将EGF(Invitrogen)加入到各孔中，终浓度为100ng/ml，再将该板在室温下孵育10分钟。用冰冷PBS洗涤各孔2次。加入冷的裂解缓冲液(1％ NP-40、20mM Tris、137mMNaCl、10％甘油、2mM EDTA、1mM原钒酸钠、10ug/ml抑肽酶、10ug/ml亮肽素)，将该板在冰上孵育10分钟。
将上清液转移至ELISA板上，该板已经用浓度为1ug/ml的抗EGFR抗体(R&D Systems)的碳酸缓冲液包被过夜。ELISA板在室温下孵育2小时。该板用PBS/0.05％吐温20洗涤3次。加入1ug/ml与辣根过氧化物酶(Upstate Biotechnology)缀合的抗磷酸酪氨酸抗体，将该板在室温下孵育1小时。用PBS/吐温洗板3次，再用PBS洗板3次。反应物用SureBlue TMB 1-Component Micro Well过氧化物酶底物(KPL)显色，25分钟后用1M HCl终止反应。用Wallac读板器读取吸光度。
用某些抗EGFR dAb，在该项测定中得到的结果见下表3。
表3 *所示数据是所得到的最小值到最大值和(平均值)。
实施例3.具有VEGF和EGFR结合特异性的IgG样形式 载体 pBudCE4.1骨架(Invitrogen)用于克隆免疫球蛋白恒定区，例如IgG1重链恒定区和轻链κ恒定区(有关概述参见

图16)。采用Ig κ链前导序列，有利于所表达蛋白质的分泌。Ig恒定区(人IgG1和CK)由GeneArt(Germany)生产。
将重链恒定区和信号肽作为Hind III/BglII片段克隆到pBudCE4.1的HindIII/BamH I限制位点上。
将轻链恒定区和信号肽作为NotI/MluI片段克隆到pBudCE4.1上。dAb克隆到IgG载体上并产生IgG样形式 将VK dAb(对VEGF或EGFR具有特异性)作为SalI/BsiWI片段克隆到IgG载体上。将VH dAb(对VEGF或EGFR具有特异性)作为BamHI/XhoI片段克隆到IgG载体上。
再将质粒转染HEK293T细胞(ATCC CRL-11268)，IgG瞬时表达5天。用层流(Streamline)蛋白A纯化所产生的IgG。
在还原性和非还原性SDS凝胶上检查纯化IgG，观察预期大小的条带。
将结合VEGF或EGFR的若干dAb精制成具有VEGF和EGFR结合特异性的IgG样形式。通过产生编码IgG重链(其中VH是dAb)和κ轻链(其中VK是dAb)的构建体，制备IgG样形式。所制备的IgG样形式见下表4，测定中得到的某些IgG样形式的结果见下表5。(Dummy VH和Dummy VK是不能结合VEGF或EGFR的种系序列)。


表5 实施例4.双特异性流线状(Inline)形式 将能结合VEGF或EGFR的域抗体掺入到融合多肽中，其中，在一条多肽链内含有抗VEGFR dAb和抗EGFR dAb。一些融合多肽也包含抗体Fc区(人IgG1的-CH2-CH3)。克隆并表达的融合多肽的具体实例包括与DOM16-39-206和与Fc融合的TAR15-10(SEQ IDNO715)；与TAR15-10和与Fc融合的DOM16-39-206(SEQ IDNO716)；与TAR15-26-501和与Fc融合的DOM16-39-206(SEQ IDNO717)；与DOM16-39-206和与Fc融合的TAR15-26-501(SEQ IDNO718)；与DOM16-39-206融合的TAR15-10(SEQ ID NO719)；与TAR15-10融合的DOM16-39-206(SEQ ID NO720)；与TAR15-26-501融合的DOM16-39-206(SEQ ID NO721)；和与DOM16-39-206融合的TAR15-26-501(SEQ ID NO722)。按照它们在融合蛋白中从氨基端到羧基端的排列，列出上述融合体的位置。
用标准方法，将编码dAb的DNA经PCR扩增并克隆到表达载体上。通过在毕赤酵母中表达表达载体(不含Fc区的融合体)或在HEK293T细胞中表达表达载体(含Fc区的融合体)，产生线状融合多肽。分别对于HEK 293T细胞表达的构建体(Fc-标记)和毕赤酵母表达的构建体而言，将线状融合体分批结合，并在层流蛋白A和层流蛋白L树脂上进行亲和纯化。
下表6列出一些含Fc的融合体部分，按其在融合蛋白中从氨基端到羧基端的排列。因此，可以通过从左到右阅读该表，来评价融合蛋白的结构。表6所示的第一融合蛋白的结构，从氨基端到羧基端为DOM15-10—接头1—DOM16-39-206—接头2—Fc。用实施例2所述的EGFR结合测定和实施例1所述的VEGF受体2结合测定，评价融合体的结合活性。
让线状融合体经历胰蛋白酶水解，测定其对降解的一般稳定性和抵抗力。制备双特异性配体和胰蛋白酶(1/25(w/w)胰蛋白酶对配体)溶液，在30℃孵育。在0分钟(即加入胰蛋白酶之前)、60分钟、180分钟和24小时取样。在给定时间点，通过加入2X终浓度的完全蛋白酶抑制剂混合物(Roche code11 836 145 001)和PAGE上样染料，再在液氮中快速冷冻样品，终止反应。样品经SDS-PAGE分析，目测蛋白质条带，揭示了融合体经蛋白酶降解的时间进程。
这些实验表明，含有Vk的羧基端氨基酸和Ck的氨基端氨基酸的具有“天然”接头(KVEIKRTVAAPS(SEQ ID NO706)的线状融合体，对快速蛋白酶解敏感，降解明显在10分钟时间点。SDS-PAGE分析表明，降解发生在dAb间的接头上以及dAb与Fc间的接头上。
设计了新接头，其含有更少Lys和Arg残基，这是胰蛋白酶的切割点，并且在天然接头中很丰富。含有工程接头(LVTVSSAST(SEQ IDNO707))或(LVTVSSGGGGSGGGS(SEQ ID NO708))的融合体显示出对胰蛋白酶水解的抗性提高很多。
进行了另外的结合测定，评价含工程接头的线状融合体的效力。结果表明，工程接头在效力上没有任何实质上的副反应。
表6.含Fc的融合多肽 实施例5.另外的工程接头 将一些设计的突变引入在IgG样形式的轻链上表达的Vk dAb的C-端区，以降低蛋白酶敏感性。“天然接头”是GQGTKVEIKRTVAAPS(SEQ ID NO709，其含有Vk的羧基端氨基酸和Ck的氨基端氨基酸)。设计具有氨基酸取代的变异接头1-3，其采用在生理pH下不带正电荷的最保守取代，取代了天然接头上的一些或全部带正电荷的残基。可能天然接头中的精氨酸残基较少地经历改变，因为CL区内形成的离子相互作用。
变异接头1(GQGTNVEINRTVAAPS(SEQ ID NO710))用天冬酰胺取代了天然接头中的两个赖氨酸。将变异接头1和变异接头2(GQGTNVEINQTVAAPS(SEQ ID NO711)，其另外地将天然接头中的精氨酸变为谷氨酰胺)，引入接头的N-糖基化位点(NxT)。对含变异接头1或变异接头2的IgG样形式进行SDS-PAGE分析表明，轻链具有更高分子量，与N-糖基化事件一致。变异接头3(GQGTNVEIQRTVAAPS(SEQ ID NO712)除去N-糖基化位点，而天然接头内的精氨酸仍保留在原位。变异接头4(GQGTLVTVSSTVAAPS(SEQ ID NO713))用来自VH区的相应残基取代了Vk区的6个C-端氨基酸，并且也缺乏正电荷。
含变异接头1-4的IgG样形式的蛋白酶抗性(按照实施例4评价的胰蛋白酶抗性)表明，含有工程变异接头的IgG样形式比含天然接头的IgG样形式具有更强的蛋白酶抗性。
实施例6.DOM16 dAb-抗血清白蛋白dAb融合体 设计了DOM16 dAb-抗血清白蛋白dAb融合体，其表达为抗EGFR dAb与抗血清白蛋白dAb(一种DOM7 dAb)的融合体。按其在融合蛋白中从氨基端到羧基端的排列，将融合体部分列于下表7。因此，可以通过从左到右阅读该表，来评价融合蛋白的结构。表7所示的第一融合蛋白的结构，从氨基端到羧基端为DOM16-39-618(S12P)—接头—DOM7h-14。
DOM16-39-618在位置12上含有从丝氨酸到脯氨酸的突变，其终止与蛋白L的结合并阻止轻链聚集。iDOM7 dAb是突变的，使其不能结合白蛋白，因而是失活的。
表7 实施例7.EGFR表位作图 在竞争性结合测定中，采用抗EGFR dAb、EGF和ERBITUX(西妥昔单抗；Imclone Systems)，来进行表位作图。用BIAcore生物传感器进行结合研究。在该项研究中，DOM16-39-200用作参考。DOM16-39-200和称为DOM-16-39-x的其它dAb，是DOM16-39的亲和力成熟变异体。因此，DOM-16-39系列中的所有dAb将会具有基本相同的表位特异性，因为亲和力成熟产生具有更高结合亲和力的dAb，但不改变dAb的特异性。
上述结果表明，DOM16-72、DOM16-79和DOM16-112与DOM16-39-200竞争性结合EGFR，表明这些dAb结合重叠表位。然而，DOM16-32、DOM16-52和DOM16-80表现出与不同表位的结合。已知ERBITUX(西妥昔单抗；Imclone Systems)能抑制EGF与EGFR结合(西妥昔单抗和EGF结合EGFR上的重叠表位)。该项研究结果也表明，DOM16-39-200和西妥昔单抗竞争性结合EGFR，这表明DOM16-39-200表位与西妥昔单抗表位重叠，并且具有EGF的结合位点。
尽管参考本发明的优选实施方案具体说明和描述了本发明，但是本领域技术人员应该理解，在不偏离所附权利要求限定的本发明范围的情况下，可以对本发明在形式上和细节上实施各种修改。
序列表
<110>杜门蒂斯有限公司(Domantis Limited)
Ignatovich，Olga
Holmes，Steve
Beckmann，Roland
Liu，Haiqun
de Wildt，Rudolf M.T.
Jespers，Laurent S.
Steward，Michael
<120>具有表皮生长因子受体和/或血管内皮生长因子结合特异性的配体及其使用方法
<130>3440.1007002
<150>60/758,355
<151>2006-01-11
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<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
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权利要求
1.一种具有血管内皮生长因子(VEGF)和表皮生长因子受体(EGFR)结合特异性的配体，所述配体包含至少一个具有VEGF结合特异性结合位点的蛋白质部分和至少一个具有EGFR结合特异性结合位点的蛋白质部分。
2.权利要求1的配体，其中每个所述具有EGFR结合特异性结合位点的蛋白质部分与选自以下的抗EGFR域抗体(dAb)竞争性结合EGFRDOM16-39(SEQ ID NO345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO420)、DOM16-39-100(SEQ ID NO423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO430)、DOM16-39-109(SEQ ID NO432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO438)和DOM16-39-200(SEQ ID NO441)。
3.权利要求1的配体，其中每个所述具有EGFR结合特异性结合位点的蛋白质部分与选自以下的抗EGFR域抗体(dAb)竞争性结合EGFRDOM16-39-521(SEQ ID NO577)、DOM16-39-541(SEQ IDNO585)、DOM16-39-542(SEQ ID NO586)、DOM16-39-551(SEQ IDNO591)、DOM16-39-601(SEQ ID NO608)、DOM16-39-604(SEQ IDNO611)、DOM16-39-618(SEQ ID NO621)和DOM16-39-619(SEQ IDNO622)。
4.权利要求1的配体，其中每个所述具有VEGF结合特异性结合位点的蛋白质部分与选自以下的抗VEGF域抗体(dAb)竞争性结合VEGFTAR15-6(SEQ ID NO117)、TAR15-8(SEQ ID NO119)和TAR15-26(SEQ ID NO123)；而且其中每个所述具有EGFR结合特异性结合位点的蛋白质部分与选自以下的抗EGFR域抗体(dAb)竞争性结合EGFRDOM16-39(SEQ ID NO345)、DOM16-39-87(SEQ IDNO420)、DOM16-39-100(SEQ ID NO423)、DOM16-39-107(SEQ IDNO430)、DOM16-39-109(SEQ ID NO432)、DOM16-39-115(SEQ IDNO438)和DOM16-39-200(SEQ ID NO441)。
5.权利要求1的配体，其中每个所述具有VEGF结合特异性结合位点的蛋白质部分与选自以下的抗VEGF域抗体(dAb)竞争性结合VEGFTAR15-6(SEQ ID NO117)、TAR15-8(SEQ ID NO119)和TAR15-26(SEQ ID NO123)；而且其中每个所述具有EGFR结合特异性结合位点的蛋白质部分与选自以下的抗EGFR域抗体(dAb)竞争性结合EGFRDOM16-39-521(SEQ ID NO577)、DOM16-39-541(SEQID NO585)、DOM16-39-542(SEQ ID NO586)、DOM16-39-551(SEQID NO591)、DOM16-39-601(SEQ ID NO608)、DOM16-39-604(SEQID NO611)、DOM16-39-618(SEQ ID NO621)和DOM16-39-619(SEQID NO622)。
6.权利要求1的配体，其中每个所述具有VEGF结合特异性结合位点的蛋白质部分与贝伐单抗竞争性结合VEGF。
7.权利要求1或4的配体，其中每个所述具有EGFR结合特异性结合位点的蛋白质部分与西妥昔单抗竞争性结合EGFR。
8.权利要求1-7中任一项的配体，其中每个所述具有VEGF结合特异性结合位点的蛋白质部分与贝伐单抗竞争性结合VEGF；而且其中每个所述具有EGFR结合特异性结合位点的蛋白质部分与西妥昔单抗竞争性结合EGFR。
9.权利要求1-8中任一项的配体，其中每个所述具有VEGF结合特异性结合位点的蛋白质部分和每个所述具有EGFR结合特异性结合位点的蛋白质部分是由抗体片段提供的。
10.权利要求9的配体，其中所述抗体片段是免疫球蛋白单可变区。
11.一种具有血管内皮生长因子(VEGF)和表皮生长因子受体(EGFR)结合特异性的配体，所述配体包含至少一个具有VEGF结合特异性的免疫球蛋白单可变区和至少一个具有EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区，其中每个所述具有EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区与选自以下的抗EGFR域抗体(dAb)竞争性结合EGFRDOM16-39(SEQ ID NO345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO420)、DOM16-39-100(SEQ ID NO423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO430)、DOM16-39-109(SEQ ID NO432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO438)和DOM16-39-200(SEQ ID NO441)。
12.一种具有血管内皮生长因子(VEGF)和表皮生长因子受体(EGFR)结合特异性的配体，所述配体包含至少一个具有VEGF结合特异性的免疫球蛋白单可变区和至少一个具有EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区，其中每个所述具有EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区与选自以下的抗EGFR域抗体(dAb)竞争性结合EGFRDOM16-39-521(SEQ ID NO577)、DOM16-39-541(SEQ ID NO585)、DOM16-39-542(SEQ ID NO586)、DOM16-39-551(SEQ ID NO591)、DOM16-39-601(SEQ ID NO608)、DOM16-39-604(SEQ ID NO611)、DOM16-39-618(SEQ ID NO621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO622)。
13.权利要求11或12的配体，其中每个所述具有EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区与抗体Fc区融合。
14.权利要求11或12的配体，其中每个所述具有VEGF结合特异性的免疫球蛋白单可变区与抗体Fc区融合。
15.权利要求11的配体，其中每个所述具有EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区包含的氨基酸序列与选自以下dAb的氨基酸序列具有至少约85％氨基酸序列同一性DOM16-39(SEQ ID NO345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO420)、DOM16-39-100(SEQ ID NO423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO430)、DOM16-39-109(SEQ ID NO432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO438)和DOM16-39-200(SEQ ID NO441)。
16.权利要求12的配体，其中每个所述具有EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区包含的氨基酸序列与选自以下dAb的氨基酸序列具有至少约85％氨基酸序列同一性DOM16-39-521(SEQ IDNO577)、DOM16-39-541(SEQ ID NO585)、DOM16-39-542(SEQ IDNO586)、DOM16-39-551(SEQ ID NO591)、DOM16-39-601(SEQ IDNO608)、DOM16-39-604(SEQ ID NO611)、DOM16-39-618(SEQ IDNO621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO622)。
17.一种具有血管内皮生长因子(VEGF)和表皮生长因子受体(EGFR)结合特异性的配体，所述配体包含至少一个具有VEGF结合特异性的免疫球蛋白单可变区和至少一个具有EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区，其中
每个所述具有VEGF结合特异性的免疫球蛋白单可变区与选自以下的抗VEGF域抗体(dAb)竞争性结合VEGFTAR15-6(SEQ IDNO117)、TAR15-8(SEQ ID NO119)和TAR15-26(SEQ ID NO123)；和
每个所述具有EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区与选自以下的抗EGFR域抗体(dAb)竞争性结合EGFRDOM16-39(SEQ IDNO345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO420)、DOM16-39-100(SEQ IDNO423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO430)、DOM16-39-109(SEQ IDNO432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO438)和DOM16-39-200(SEQ IDNO441)。
18.一种具有血管内皮生长因子(VEGF)和表皮生长因子受体(EGFR)结合特异性的配体，所述配体包含至少一个具有VEGF结合特异性的免疫球蛋白单可变区和至少一个具有EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区，其中
每个所述具有VEGF结合特异性的免疫球蛋白单可变区与选自以下的抗VEGF域抗体(dAb)竞争性结合VEGFTAR15-6(SEQ IDNO117)、TAR15-8(SEQ ID NO119)和TAR15-26(SEQ ID NO123)；和
每个所述具有EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区与选自以下的抗EGFR域抗体(dAb)竞争性结合EGFRDOM16-39-521(SEQ IDNO577)、DOM16-39-541(SEQ ID NO585)、DOM16-39-542(SEQ IDNO586)、DOM16-39-551(SEQ ID NO591)、DOM16-39-601(SEQ IDNO608)、DOM16-39-604(SEQ ID NO611)、DOM16-39-618(SEQ IDNO621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO622)。
19.权利要求17的配体，其中每个所述具有VEGF结合特异性的免疫球蛋白单可变区包含的氨基酸序列与选自以下dAb的氨基酸序列具有至少约85％氨基酸序列同一性TAR15-6(SEQ ID NO117)、TAR15-8(SEQ ID NO119)和TAR15-26(SEQ ID NO123)；和
每个所述具有EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区与选自以下的抗EGFR域抗体(dAb)竞争性结合EGFRDOM16-39(SEQ IDNO345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO420)、DOM16-39-100(SEQ IDNO423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO430)、DOM16-39-109(SEQ IDNO432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO438)和DOM16-39-200(SEQ IDNO441)。
20.权利要求18的配体，其中每个所述具有VEGF结合特异性的免疫球蛋白单可变区包含的氨基酸序列与选自以下dAb的氨基酸序列具有至少约85％氨基酸序列同一性TAR15-6(SEQ ID NO117)、TAR15-8(SEQ ID NO119)和TAR15-26(SEQ ID NO123)；和
每个所述具有EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区与选自以下的抗EGFR域抗体(dAb)竞争性结合EGFRDOM16-39-521(SEQ IDNO577)、DOM16-39-541(SEQ ID NO585)、DOM16-39-542(SEQ IDNO586)、DOM16-39-551(SEQ ID NO591)、DOM16-39-601(SEQ IDNO608)、DOM16-39-604(SEQ ID NO611)、DOM16-39-618(SEQ IDNO621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO622)。
21.权利要求1-19中任一项的配体，其中所述配体抑制表皮生长因子(EGF)和/或转化生长因子α(TGFα)与EGFR结合。
22.权利要求1-19中任一项的配体，其中所述配体抑制EGFR的活性。
23.权利要求1-19中任一项的配体，其中所述配体抑制EGFR的活性，而基本上不抑制表皮生长因子(EGF)和/或转化生长因子α(TGFα)与EGFR结合。
24.权利要求1-23中任一项的配体，其中所述配体抑制VEGF与血管内皮生长因子受体1(VEGFR1)和/或血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)结合。
25.权利要求1-23中任一项的配体，其中所述配体抑制VEGF的活性。
26.权利要求1-23中任一项的配体，其中所述配体抑制VEGF的活性，而基本上不抑制VEGF与血管内皮生长因子受体1(VEGFR1)和/或血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)结合。
27.权利要求10-26中任一项的配体，其中经表面等离子共振测定，每个所述具有VEGF结合特异性的免疫球蛋白单可变区与VEGF结合的亲和力(KD)介于约100nM至约1pM之间。
28.权利要求10-26中任一项的配体，其中经表面等离子共振测定，每个所述具有EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区与EGFR结合的亲和力(KD)介于约100nM至约1pM之间。
29.权利要求28的配体，其中经表面等离子共振测定，每个所述具有EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区与EGFR结合的亲和力(KD)介于约10nM至约100pM之间。
30.权利要求10-26中任一项的配体，其中经表面等离子共振测定，所述配体与VEGF结合的亲和力(KD)介于约100nM至约1pM之间。
31.权利要求10-26和30中任一项的配体，其中经表面等离子共振测定，所述配体与EGFR结合的亲和力(KD)介于约100nM至约1pM之间。
32.权利要求31的配体，其中经表面等离子共振测定，所述配体与EGFR结合的亲和力(KD)介于约10nM至约100pM之间。
33.权利要求10-32中任一项的配体，其中所述配体包含作为VHH的具有VEGF结合特异性的免疫球蛋白单可变区和/或作为VHH的具有EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区。
34.权利要求10-32中任一项的配体，其中每个所述具有VEGF结合特异性的免疫球蛋白单可变区和每个所述具有EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区独立选自人VH和人VL。
35.权利要求1-34中任一项的配体，其中所述配体是包含两个具有VEGF结合特异性的免疫球蛋白单可变区和两个具有EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区的IgG样形式。
36.权利要求1-35中任一项的配体，其中所述配体包含抗体Fc区。
37.一种具有血管内皮生长因子(VEGF)和表皮生长因子受体(EGFR)结合特异性的配体，所述配体包含至少一个具有VEGF结合特异性的免疫球蛋白单可变区和至少一个具有EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区，其中
每个所述具有VEGF结合特异性的免疫球蛋白单可变区与选自以下的抗VEGF域抗体(dAb)竞争性结合VEGFTAR15-6(SEQ IDNO117)、TAR15-8(SEQ ID NO119)和TAR15-26(SEQ ID NO123)；和
每个所述具有EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区与西妥昔单抗竞争性结合EGFR。
38.权利要求37的配体，其中每个所述具有VEGF结合特异性的免疫球蛋白单可变区包含的氨基酸序列与选自以下dAb的氨基酸序列具有至少约85％氨基酸序列同一性TAR15-6(SEQ ID NO117)、TAR15-8(SEQ ID NO119)和TAR15-26(SEQ ID NO123)。
39.一种具有血管内皮生长因子(VEGF)和表皮生长因子受体(EGFR)结合特异性的配体，所述配体包含至少一个具有VEGF结合特异性的免疫球蛋白单可变区和至少一个具有EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区，其中
每个所述具有VEGF结合特异性的免疫球蛋白单可变区与贝伐单抗竞争性结合VEGF；和
每个所述具有EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区与选自以下的抗EGFR域抗体(dAb)竞争性结合EGFRDOM16-39(SEQ IDNO345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO420)、DOM16-39-100(SEQ IDNO423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO430)、DOM16-39-109(SEQ IDNO432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO438)和DOM16-39-200(SEQ IDNO441)。
40.一种具有血管内皮生长因子(VEGF)和表皮生长因子受体(EGFR)结合特异性的配体，所述配体包含至少一个具有VEGF结合特异性的免疫球蛋白单可变区和至少一个具有EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区，其中
每个所述具有VEGF结合特异性的免疫球蛋白单可变区与贝伐单抗竞争性结合VEGF；和
每个所述具有EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区与选自以下的抗EGFR域抗体(dAb)竞争性结合EGFRDOM16-39-521(SEQ IDNO577)、DOM16-39-541(SEQ ID NO585)、DOM16-39-542(SEQ IDNO586)、DOM16-39-551(SEQ ID NO591)、DOM16-39-601(SEQ IDNO608)、DOM16-39-604(SEQ ID NO611)、DOM16-39-618(SEQ IDNO621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO622)。
41.权利要求39的配体，其中每个所述具有EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区包含的氨基酸序列与选自以下dAb的氨基酸序列具有至少约85％氨基酸序列同一性DOM16-39(SEQ ID NO345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO420)、DOM16-39-100(SEQ ID NO423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO430)、DOM16-39-109(SEQ ID NO432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO438)和DOM16-39-200(SEQ ID NO441)。
42.权利要求40的配体，其中每个所述具有EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区包含的氨基酸序列与选自以下dAb的氨基酸序列具有至少约85％氨基酸序列同一性DOM16-39-521(SEQ IDNO577)、DOM16-39-541(SEQ ID NO585)、DOM16-39-542(SEQ IDNO586)、DOM16-39-551(SEQ ID NO591)、DOM16-39-601(SEQ IDNO608)、DOM16-39-604(SEQ ID NO611)、DOM16-39-618(SEQ IDNO621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO622)。
43.一种具有血管内皮生长因子(VEGF)和表皮生长因子受体(EGFR)结合特异性的配体，所述配体包含具有VEGF结合特异性的第一免疫球蛋白单可变区和具有EGFR结合特异性的第二免疫球蛋白单可变区，其中
所述第一免疫球蛋白单可变区与贝伐单抗竞争性结合VEGF；和
所述第二免疫球蛋白单可变区与西妥昔单抗竞争性结合EGFR。
44.权利要求37-43中任一项的配体，其中所述配体抑制表皮生长因子(EGF)和/或转化生长因子α(TGFα)与EGFR结合。
45.权利要求37-43中任一项的配体，其中所述配体抑制EGFR的活性。
46.权利要求37-43中任一项的配体，其中所述配体抑制EGFR的活性，而基本上不抑制表皮生长因子(EGF)和/或转化生长因子α(TGFα)与EGFR结合。
47.权利要求37-46中任一项的配体，其中所述配体抑制VEGF与血管内皮生长因子受体1(VEGFR1)和/或血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)结合。
48.权利要求37-46中任一项的配体，其中所述配体抑制VEGF的活性。
49.权利要求37-46中任一项的配体，其中所述配体抑制VEGF的活性，而基本上不抑制VEGF与血管内皮生长因子受体1(VEGFR1)和/或血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)结合。
50.权利要求37-49中任一项的配体，其中经表面等离子共振测定，每个所述具有VEGF结合特异性的免疫球蛋白单可变区与VEGF结合的亲和力(KD)介于约100nM至约1pM之间。
51.权利要求37-50中任一项的配体，其中经表面等离子共振测定，每个所述具有EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区与EGFR结合的亲和力(KD)介于约100nM至约1pM之间。
52.权利要求51的配体，其中经表面等离子共振测定，每个所述具有EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区与EGFR结合的亲和力(KD)介于约10nM至约100pM之间。
53.权利要求37-49中任一项的配体，其中经表面等离子共振测定，所述配体与VEGF结合的亲和力(KD)介于约100nM至约1pM之间。
54.权利要求37-49和53中任一项的配体，其中经表面等离子共振测定，所述配体与EGFR结合的亲和力(KD)介于约100nM至约1pM之间。
55.权利要求54的配体，其中经表面等离子共振测定，所述配体与EGFR结合的亲和力(KD)介于约10nM至约100pM之间。
56.权利要求37-55中任一项的配体，其中所述配体包含作为VHH的具有VEGF结合特异性的免疫球蛋白单可变区和/或作为VHH的具有EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区。
57.权利要求37-55中任一项的配体，其中每个所述具有VEGF结合特异性的免疫球蛋白单可变区和每个所述具有EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区选自人VH和人VL。
58.权利要求37-57中任一项的配体，其中所述配体是包含两个具有VEGF结合特异性的免疫球蛋白单可变区和两个具有EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区的IgG样形式。
59.权利要求37-58中任一项的配体，其中所述配体包含抗体Fc区。
60.一种具有表皮生长因子受体(EGFR)结合特异性的配体，所述配体包含至少一个具有EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区，其中每个所述具有EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区与选自以下的抗EGFR域抗体(dAb)竞争性结合EGFRDOM16-39(SEQ IDNO345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO420)、DOM16-39-100(SEQ IDNO423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO430)、DOM16-39-109(SEQ IDNO432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO438)和DOM16-39-200(SEQ IDNO441)。
61.一种具有表皮生长因子受体(EGFR)结合特异性的配体，所述配体包含至少一个具有EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区，其中每个所述具有EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区与选自以下的抗EGFR域抗体(dAb)竞争性结合EGFRDOM16-39-521(SEQ IDNO577)、DOM16-39-541(SEQ ID NO585)、DOM16-39-542(SEQ IDNO586)、DOM16-39-551(SEQ ID NO591)、DOM16-39-601(SEQ IDNO608)、DOM16-39-604(SEQ ID NO611)、DOM16-39-618(SEQ IDNO621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO622)。
62.权利要求60或61的配体，其中所述配体抑制表皮生长因子(EGF)和/或转化生长因子α(TGFα)与EGFR结合。
63.权利要求60或61的配体，其中所述配体抑制EGFR的活性。
64.权利要求60或61的配体，其中所述配体抑制EGFR的活性，而基本上不抑制表皮生长因子(EGF)和/或转化生长因子α(TGFα)与EGFR结合。
65.权利要求60-64中任一项的配体，其中经表面等离子共振测定，每个所述具有EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区与EGFR结合的亲和力(KD)介于约100nM至约1pM之间。
66.权利要求65的配体，其中经表面等离子共振测定，每个所述具有EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区与EGFR结合的亲和力(KD)介于约10nM至约100pM之间。
67.权利要求60-64中任一项的配体，其中经表面等离子共振测定，所述配体与EGFR结合的亲和力(KD)介于约100nM至约1pM之间。
68.权利要求67的配体，其中经表面等离子共振测定，所述配体与EGFR结合的亲和力(KD)介于约10nM至约100pM之间。
69.权利要求60-68中任一项的配体，其中所述配体包含作为VHH的具有EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区。
70.权利要求60-68中任一项的配体，其中每个所述具有EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区独立选自人VH和人VL。
71.权利要求1-70中任一项的配体，其中所述配体还包含毒素。
72.权利要求71的配体，其中所述毒素是表面活性毒素。
73.权利要求72的配体，其中所述表面活性毒素包括自由基产生物或放射性核素。
74.权利要求73的配体，其中所述毒素是细胞毒素、自由基产生物、抗代谢药、蛋白质、多肽、肽、光敏剂、反义化合物、化疗药、放射性核素或胞内抗体。
75.权利要求1-74中任一项的配体，其中所述配体还包含半衰期延长部分。
76.权利要求75的配体，其中所述半衰期延长部分是聚亚烷基二醇部分、血清白蛋白或其片段、转铁蛋白受体或其转铁蛋白结合部分或包含能延长体内半衰期的多肽结合位点的部分。
77.权利要求76的配体，其中所述半衰期延长部分是包含延长体内半衰期的多肽结合位点的部分，选自亲和体、SpA区、LDL受体A类区、EGF区和高亲和性多聚体。
78.权利要求76的配体，其中所述半衰期延长部分是聚乙二醇部分。
79.权利要求76的配体，其中所述半衰期延长部分是包含血清白蛋白或新生动物Fc受体结合位点的抗体或抗体片段。
80.权利要求79的配体，其中所述包含血清白蛋白或新生动物Fc受体结合位点的抗体或抗体片段是抗体片段，而且所述抗体片段是包含血清白蛋白结合位点的免疫球蛋白单可变区。
81.权利要求80的配体，其中所述包含血清白蛋白结合位点的免疫球蛋白单可变区与选自以下的dAb竞争性结合人血清白蛋白DOM7m-16(SEQ ID NO473)、DOM7m-12(SEQ ID NO474)、DOM7m-26(SEQ ID NO475)、DOM7r-1(SEQ ID NO476)、DOM7r-3(SEQ ID NO477)、DOM7r-4(SEQ ID NO478)、DOM7r-5(SEQ ID NO479)、DOM7r-7(SEQ ID NO480)、DOM7r-8(SEQ IDNO481)、DOM7h-2(SEQ ID NO482)、DOM7h-3(SEQ ID NO483)、DOM7h-4(SEQ ID NO484)、DOM7h-6(SEQ ID NO485)、DOM7h-1(SEQ ID NO486)、DOM7h-7(SEQ ID NO487)、DOM7h-22(SEQ ID NO489)、DOM7h-23(SEQ ID NO490)、DOM7h-24(SEQ ID NO491)、DOM7h-25(SEQ ID NO492)、DOM7h-26(SEQ ID NO493)、DOM7h-21(SEQ ID NO494)、DOM7h-27(SEQ ID NO495)、DOM7h-8(SEQ ID NO496)、DOM7r-13(SEQ ID NO497)、DOM7r-14(SEQ ID NO498)、DOM7r-15(SEQ ID NO499)、DOM7r-16(SEQ ID NO500)、DOM7r-17(SEQ ID NO501)、DOM7r-18(SEQ ID NO502)、DOM7r-19(SEQ ID NO503)、DOM7r-20(SEQ ID NO504)、DOM7r-21(SEQ ID NO505)、DOM7r-22(SEQ ID NO506)、DOM7r-23(SEQ ID NO507)、DOM7r-24(SEQ ID NO508)、DOM7r-25(SEQ ID NO509)、DOM7r-26(SEQ ID NO510)、DOM7r-27(SEQ ID NO511)、DOM7r-28(SEQ ID NO512)、DOM7r-29(SEQ ID NO513)、DOM7r-30(SEQ ID NO514)、DOM7r-31(SEQ ID NO515)、DOM7r-32(SEQ ID NO516)和DOM7r-33(SEQ ID NO517)。
82.权利要求80的配体，其中所述包含血清白蛋白结合位点的免疫球蛋白单可变区含有的氨基酸序列与选自以下dAb的氨基酸序列具有至少85％氨基酸序列同一性DOM7m-16(SEQ ID NO473)、DOM7m-12(SEQ ID NO474)、DOM7m-26(SEQ ID NO475)、DOM7r-1(SEQ ID NO476)、DOM7r-3(SEQ ID NO477)、DOM7r-4(SEQ ID NO478)、DOM7r-5(SEQ ID NO479)、DOM7r-7(SEQ IDNO480)、DOM7r-8(SEQ ID NO481)、DOM7h-2(SEQ ID NO482)、DOM7h-3(SEQ ID NO483)、DOM7h-4(SEQ ID NO484)、DOM7h-6(SEQ ID NO485)、DOM7h-1(SEQ ID NO486)、DOM7h-7(SEQ ID NO487)、DOM7h-22(SEQ ID NO489)、DOM7h-23(SEQ ID NO490)、DOM7h-24(SEQ ID NO491)、DOM7h-25(SEQ ID NO492)、DOM7h-26(SEQ ID NO493)、DOM7h-21(SEQ ID NO494)、DOM7h-27(SEQ ID NO495)、DOM7h-8(SEQ ID NO496)、DOM7r-13(SEQ ID NO497)、DOM7r-14(SEQ ID NO498)、DOM7r-15(SEQ ID NO499)、DOM7r-16(SEQ ID NO500)、DOM7r-17(SEQ ID NO501)、DOM7r-18(SEQ ID NO502)、DOM7r-19(SEQ ID NO503)、DOM7r-20(SEQ ID NO504)、DOM7r-21(SEQ ID NO505)、DOM7r-22(SEQ ID NO506)、DOM7r-23(SEQ ID NO507)、DOM7r-24(SEQ ID NO508)、DOM7r-25(SEQ ID NO509)、DOM7r-26(SEQ ID NO510)、DOM7r-27(SEQ ID NO511)、DOM7r-28(SEQ ID NO512)、DOM7r-29(SEQ ID NO513)、DOM7r-30(SEQ ID NO514)、DOM7r-31(SEQ ID NO515)、DOM7r-32(SEQ ID NO516)和DOM7r-33(SEQ ID NO517)。
83.用于治疗或诊断的权利要求1-70中任一项的配体。
84.用于治疗癌症的权利要求1-70中任一项的配体。
85.用于治疗过量表达EGFR和/或VEGF的癌细胞的权利要求1-70中任一项的配体。
86.权利要求1-70中任一项的配体在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
87.权利要求1-70中任一项的配体在制备用于治疗过量表达EGFR和/或VEGF的癌细胞的药物中的用途。
88.一种治疗癌症的方法，所述方法包括给予有需要的患者治疗有效量的权利要求1-70中任一项的配体。
89.一种治疗癌症的方法，所述方法包括给予有需要的患者治疗有效量的权利要求1-70中任一项的配体和化疗药。
90.一种治疗癌症的方法，所述方法包括给予有需要的患者治疗有效量的权利要求1-70中任一项的配体和抗肿瘤组合物，其中所述抗肿瘤组合物包含至少一种化疗药，选自烷化剂、抗代谢药、叶酸类似物、嘧啶类似物、嘌呤类似物和相关抑制剂、长春花属生物碱、表鬼臼毒素、抗生素、L-天冬酰胺酶、拓扑异构酶抑制剂、干扰素、铂配位络合物、蒽二酮取代脲、甲基肼衍生物、肾上腺皮质抑制剂、肾上腺皮质类固醇、孕酮、雌激素、抗雌激素药、雄激素、抗雄激素药和促性腺激素释放激素类似物。
91.权利要求90的方法，其中所述化疗药选自顺铂、地卡巴嗪、放线菌素D、氮芥、链佐星、环磷酰胺、卡培他滨、卡莫司汀、洛莫司汀、多柔比星、柔红霉素、丙卡巴肼、丝裂霉素、阿糖胞苷、依托泊苷、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、长春碱、长春新碱、博来霉素、紫杉醇、多西他赛、doxetaxe、阿地白介素、天冬酰胺酶、白消安、卡铂、克拉曲滨、达卡巴嗪、氟尿苷、氟达拉滨、羟基脲、异环磷酰胺、干扰素α、伊立替康、亮丙立德、亚叶酸、甲地孕酮、美法仑、巯基嘌呤、奥沙利铂、普卡霉素、米托坦、培门冬酶、喷司他丁、哌泊溴烷、普卡霉素、链佐星、他莫昔芬、替尼泊苷、睾内酯、硫鸟嘌呤、塞替派、乌拉莫司汀、长春瑞滨、苯丁酸氮芥、泰素、另外的生长因子受体拮抗剂和任何上述药物的组合。
92.权利要求88-91中任一项的方法，其中所述癌症是膀胱癌、卵巢癌、结肠直肠癌、乳癌、肺癌、胃癌、胰腺癌、前列腺癌、头颈部癌、肾癌和胆囊癌。
93.权利要求88-91中任一项的方法，其中所述癌症是非小细胞肺癌或结肠直肠癌。
94.一种给予患者抗VEGF治疗和抗EGFR治疗的方法，所述方法包括通过给予所述患者治疗有效量的权利要求1-59中任一项的配体而同时给予抗VEGF治疗和抗EGFR治疗。
95.一种包含权利要求1-70中任一项的配体和生理上可接受的载体的组合物。
96.权利要求95的组合物，其中所述组合物包括用于静脉内、肌内、腹膜内、动脉内、鞘内、关节内或皮下给药的溶媒。
97.权利要求95的组合物，其中所述组合物包括用于肺部、鼻内、阴道或直肠给药的溶媒。
98.一种递药装置，所述装置包含权利要求95的组合物。
99.一种用于同时给予患者抗VEGF治疗和抗EGFR治疗的递药装置，所述装置包含权利要求1-59中任一项的配体。
100.权利要求98或99的递药装置，所述装置包含多个治疗有效量的配体。
权利要求98-100中任一项的递药装置，其中所述递药装置选自胃肠外递药装置、静脉内递药装置、肌内递药装置、腹膜内递药装置、经皮递药装置、肺部递药装置、动脉内递药装置、鞘内递药装置、关节内递药装置、皮下递药装置、鼻内递药装置、阴道递药装置和直肠递药装置。
权利要求101的递药装置，其中所述装置选自注射器、经皮递药装置、胶囊剂、片剂、喷雾器、吸入器、雾化器、烟雾器、气雾器、干粉吸入器、计量吸入器、计量喷雾器、计量气雾器、计量雾化器、导管。
权利要求1-70中任一项的配体在制备用于选择性杀伤癌细胞、而不是正常细胞的药物中的用途。
权利要求1-70中任一项的配体在制备用于杀伤细胞的药物中的用途。
权利要求104的用途，其中所述配体包含抗体Fc区。
一种分离或重组核酸，所述核酸编码权利要求1-70中任一项的配体。
一种载体，所述载体包含权利要求106的重组核酸。
一种宿主细胞，所述细胞包含权利要求106的重组核酸或权利要求107的载体。
一种生产配体的方法，所述方法包括将权利要求108的宿主细胞在适合表达所述核酸或载体的条件下进行培养，从而产生配体。
110.权利要求109的方法，所述方法还包括分离出所述配体。
111.一种包含单域抗体多肽构建体的组合物，其拮抗人EGFR与受体结合，其中所述单域抗体多肽构建体包含的CDR3序列与选自以下dAb的CDR3序列相同DOM16-39(SEQ ID NO345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO420)、DOM16-39-100(SEQ ID NO423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO430)、DOM16-39-109(SEQ ID NO432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO438)和DOM16-39-200(SEQ ID NO441)。
112.一种包含单域抗体多肽构建体的组合物，其拮抗人EGFR与受体结合，其中所述单域抗体多肽构建体包含的CDR3序列与选自以下dAb的CDR3序列相同DOM16-39-521(SEQ ID NO577)、DOM16-39-541(SEQ ID NO585)、DOM16-39-542(SEQ ID NO586)、DOM16-39-551(SEQ ID NO591)、DOM16-39-601(SEQ ID NO608)、DOM16-39-604(SEQ ID NO611)、DOM16-39-618(SEQ ID NO621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO622)。
113.一种包含单域抗体多肽构建体的组合物，其拮抗人EGFR与受体结合，其中所述单域抗体多肽构建体包含选自以下的氨基酸序列DOM16-39(SEQ ID NO345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO420)、DOM16-39-100(SEQ ID NO423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO430)、DOM16-39-109(SEQ ID NO432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO438)、DOM16-39-200(SEQ ID NO441)和与上述任一序列具有至少85％同一性的序列。
114.一种包含单域抗体多肽构建体的组合物，其拮抗人EGFR与受体结合，其中所述单域抗体多肽构建体包含选自以下的氨基酸序列DOM16-39-521(SEQ ID NO577)、DOM16-39-541(SEQ IDNO585)、DOM16-39-542(SEQ ID NO586)、DOM16-39-551(SEQ IDNO591)、DOM16-39-601(SEQ ID NO608)、DOM16-39-604(SEQ IDNO611)、DOM16-39-618(SEQ ID NO621)、DOM16-39-619(SEQ IDNO622)和与上述任一序列具有至少85％同一性的序列。
115.一种包含单域抗体多肽构建体的组合物，其拮抗人EGFR与受体结合，其中所述单域抗体多肽构建体包含选自以下的氨基酸序列DOM16-39(SEQ ID NO345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO420)、DOM16-39-100(SEQ ID NO423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO430)、DOM16-39-109(SEQ ID NO432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO438)、DOM16-39-200(SEQ ID NO441)和与上述任一序列具有至少85％同一性的序列。
116.一种包含单域抗体多肽构建体的组合物，其拮抗人EGFR与受体结合，其中所述单域抗体多肽构建体包含选自以下的氨基酸序列DOM16-39-521(SEQ ID NO577)、DOM16-39-541(SEQ IDNO585)、DOM16-39-542(SEQ ID NO586)、DOM16-39-551(SEQ IDNO591)、DOM16-39-601(SEQ ID NO608)、DOM16-39-604(SEQ IDNO611)、DOM16-39-618(SEQ ID NO621)、DOM16-39-619(SEQ IDNO622)和与上述任一序列具有至少85％同一性的序列。
117.一种包含单域抗体多肽构建体的组合物，其拮抗人EGFR与受体结合，其中所述单域抗体多肽构建体包含选自以下的氨基酸序列DOM16-39(SEQ ID NO345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO420)、DOM16-39-100(SEQ ID NO423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO430)、DOM16-39-109(SEQ ID NO432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO438)、DOM16-39-200(SEQ ID NO441)和与上述任一序列具有至少92％同一性的序列。
118.一种包含单域抗体多肽构建体的组合物，其拮抗人EGFR与受体结合，其中所述单域抗体多肽构建体包含选自以下的氨基酸序列DOM16-39-521(SEQ ID NO577)、DOM16-39-541(SEQ IDNO585)、DOM16-39-542(SEQ ID NO586)、DOM16-39-551(SEQ IDNO591)、DOM16-39-601(SEQ ID NO608)、DOM16-39-604(SEQ IDNO611)、DOM16-39-618(SEQ ID NO621)、DOM16-39-619(SEQ IDNO622)和与上述任一序列具有至少92％同一性的序列。
119.一种包含单域抗体多肽构建体的组合物，其拮抗人EGFR与受体结合，其中所述单域抗体多肽构建体包含选自以下的氨基酸序列DOM16-39(SEQ ID NO345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO420)、DOM16-39-100(SEQ ID NO423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO430)、DOM16-39-109(SEQ ID NO432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO438)、DOM16-39-200(SEQ ID NO441)和与上述任一序列具有至少94％同一性的序列。
120.一种包含单域抗体多肽构建体的组合物，其拮抗人EGFR与受体结合，其中所述单域抗体多肽构建体包含选自以下的氨基酸序列DOM16-39-521(SEQ ID NO577)、DOM16-39-541(SEQ IDNO585)、DOM16-39-542(SEQ ID NO586)、DOM16-39-551(SEQ IDNO591)、DOM16-39-601(SEQ ID NO608)、DOM16-39-604(SEQ IDNO611)、DOM16-39-618(SEQ ID NO621)、DOM16-39-619(SEQ IDNO622)和与上述任一序列具有至少94％同一性的序列。
121.一种包含单域抗体多肽构建体的组合物，其拮抗人EGFR与受体结合，其中所述单域抗体多肽构建体包含选自以下的氨基酸序列DOM16-39(SEQ ID NO345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO420)、DOM16-39-100(SEQ ID NO423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO430)、DOM16-39-109(SEQ ID NO432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO438)、DOM16-39-200(SEQ ID NO441)和与上述任一序列具有至少96％同一性的序列。
122.一种包含单域抗体多肽构建体的组合物，其拮抗人EGFR与受体结合，其中所述单域抗体多肽构建体包含选自以下的氨基酸序列DOM16-39-521(SEQ ID NO577)、DOM16-39-541(SEQ IDNO585)、DOM16-39-542(SEQ ID NO586)、DOM16-39-551(SEQ IDNO591)、DOM16-39-601(SEQ ID NO608)、DOM16-39-604(SEQ IDNO611)、DOM16-39-618(SEQ ID NO621)、DOM16-39-619(SEQ IDNO622)和与上述任一序列具有至少96％同一性的序列。
123.一种包含单域抗体多肽构建体的组合物，其拮抗人EGFR与受体结合，其中所述单域抗体多肽构建体包含选自以下的氨基酸序列DOM16-39(SEQ ID NO345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO420)、DOM16-39-100(SEQ ID NO423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO430)、DOM16-39-109(SEQ ID NO432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO438)、DOM16-39-200(SEQ ID NO441)和与上述任一序列具有至少98％同一性的序列。
124.一种包含单域抗体多肽构建体的组合物，其拮抗人EGFR与受体结合，其中所述单域抗体多肽构建体包含选自以下的氨基酸序列DOM16-39-521(SEQ ID NO577)、DOM16-39-541(SEQ IDNO585)、DOM16-39-542(SEQ ID NO586)、DOM16-39-551(SEQ IDNO591)、DOM16-39-601(SEQ ID NO608)、DOM16-39-604(SEQ IDNO611)、DOM16-39-618(SEQ ID NO621)、DOM16-39-619(SEQ IDNO622)和与上述任一序列具有至少98％同一性的序列。
125.一种包含单域抗体多肽构建体的组合物，其拮抗人EGFR与受体结合，其中所述单域抗体多肽构建体包含选自以下的氨基酸序列DOM16-39(SEQ ID NO345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO420)、DOM16-39-100(SEQ ID NO423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO430)、DOM16-39-109(SEQ ID NO432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO438)、DOM16-39-200(SEQ ID NO441)和与上述任一序列具有至少99％同一性的序列。
126.一种包含单域抗体多肽构建体的组合物，其拮抗人EGFR与受体结合，其中所述单域抗体多肽构建体包含选自以下的氨基酸序列DOM16-39-521(SEQ ID NO577)、DOM16-39-541(SEQ IDNO585)、DOM16-39-542(SEQ ID NO586)、DOM16-39-551(SEQ IDNO591)、DOM16-39-601(SEQ ID NO608)、DOM16-39-604(SEQ IDNO611)、DOM16-39-618(SEQ ID NO621)、DOM16-39-619(SEQ IDNO622)和与上述任一序列具有至少99％同一性的序列。
127.权利要求111-125中任一项的组合物，其中所述单域抗体多肽构建体包含四价、双特异性抗体多肽构建体，其包含
a)第一拷贝的第一融合蛋白，含有能结合第一表位的单域抗体多肽，与IgG重链恒定区融合；
b)第二拷贝的所述第一融合蛋白；
c)第一拷贝的第二融合蛋白，含有能结合第二表位的单域抗体多肽，与轻链恒定区融合；
d)第二拷贝的所述第二融合蛋白；
其中所述第一和所述第二拷贝的所述第一融合蛋白是通过其各自IgG重链恒定区以二硫键彼此结合，和
其中所述第一拷贝的所述第二融合蛋白的所述轻链恒定区与所述第一拷贝的所述第一融合蛋白的IgG重链恒定区以二硫键结合，和
其中所述第二拷贝的第二融合蛋白的所述轻链恒定区与所述第二拷贝的所述第一融合蛋白的IgG重链恒定区以二硫键结合，和
其中所述多肽构建体与所述第一和所述第二表位结合。
128.权利要求111的组合物，其中所述第一和/或所述第二表位是EGFR表位。
129.一种能结合EGFR的免疫球蛋白单可变区多肽，其中所述多肽的氨基酸序列与以下的氨基酸序列相同DOM16-39(SEQ IDNO345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO420)、DOM16-39-100(SEQ IDNO423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO430)、DOM16-39-109(SEQ IDNO432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO438)和DOM16-39-200(SEQ IDNO441)，或者与以下的氨基酸序列在不超过25个氨基酸位置上不同DOM16-39(SEQ ID NO345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO420)、DOM16-39-100(SEQ ID NO423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO430)、DOM16-39-109(SEQ ID NO432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO438)和DOM16-39-200(SEQ ID NO441)，并且其CDR1序列与DOM16-39(SEQ ID NO345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO420)、DOM16-39-100(SEQ ID NO423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO430)、DOM16-39-109(SEQ ID NO432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO438)和DOM16-39-200(SEQ ID NO441)的CDR1序列具有至少50％同一性。
130.一种能结合EGFR的免疫球蛋白单可变区多肽，其中所述多肽的氨基酸序列与以下的氨基酸序列相同DOM16-39-521(SEQ IDNO577)、DOM16-39-541(SEQ ID NO585)、DOM16-39-542(SEQ IDNO586)、DOM16-39-551(SEQ ID NO591)、DOM16-39-601(SEQ IDNO608)、DOM16-39-604(SEQ ID NO611)、DOM16-39-618(SEQ IDNO621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO622)，或者与以下的氨基酸序列在不超过25个氨基酸位置上不同DOM16-39-521(SEQ IDNO577)、DOM16-39-541(SEQ ID NO585)、DOM16-39-542(SEQ IDNO586)、DOM16-39-551(SEQ ID NO591)、DOM16-39-601(SEQ IDNO608)、DOM16-39-604(SEQ ID NO611)、DOM16-39-618(SEQ IDNO621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO622)，并且其CDR1序列与DOM16-39-521(SEQ ID NO577)、DOM16-39-541(SEQ ID NO585)、DOM16-39-542(SEQ ID NO586)、DOM16-39-551(SEQ ID NO591)、DOM16-39-601(SEQ ID NO608)、DOM16-39-604(SEQ ID NO611)、DOM16-39-618(SEQ ID NO621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO622)的CDR1序列具有至少50％同一性。
131.一种能结合EGFR的免疫球蛋白单可变区多肽，其中所述多肽的氨基酸序列与以下的氨基酸序列相同DOM16-39(SEQ IDNO345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO420)、DOM16-39-100(SEQ IDNO423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO430)、DOM16-39-109(SEQ IDNO432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO438)和DOM16-39-200(SEQ IDNO441)，或者与以下的氨基酸序列在不超过25个氨基酸位置上不同DOM16-39(SEQ ID NO345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO420)、DOM16-39-100(SEQ ID NO423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO430)、DOM16-39-109(SEQ ID NO432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO438)和DOM16-39-200(SEQ ID NO441)，并且其CDR2序列与DOM16-39(SEQ ID NO345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO420)、DOM16-39-100(SEQ ID NO423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO430)、DOM16-39-109(SEQ ID NO432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO438)和DOM16-39-200(SEQ ID NO441)的CDR2序列具有至少50％同一性。
132.一种能结合EGFR的免疫球蛋白单可变区多肽，其中所述多肽的氨基酸序列与以下的氨基酸序列相同DOM16-39-521(SEQ IDNO577)、DOM16-39-541(SEQ ID NO585)、DOM16-39-542(SEQ IDNO586)、DOM16-39-551(SEQ ID NO591)、DOM16-39-601(SEQ IDNO608)、DOM16-39-604(SEQ ID NO611)、DOM16-39-618(SEQ IDNO621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO622)，或者与以下的氨基酸序列在不超过25个氨基酸位置上不同DOM16-39-521(SEQ IDNO577)、DOM16-39-541(SEQ ID NO585)、DOM16-39-542(SEQ IDNO586)、DOM16-39-551(SEQ ID NO591)、DOM16-39-601(SEQ IDNO608)、DOM16-39-604(SEQ ID NO611)、DOM16-39-618(SEQ IDNO621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO622)，并且其CDR2序列与DOM16-39-521(SEQ ID NO577)、DOM16-39-541(SEQ ID NO585)、DOM16-39-542(SEQ ID NO586)、DOM16-39-551(SEQ ID NO591)、DOM16-39-601(SEQ ID NO608)、DOM16-39-604(SEQ ID NO611)、DOM16-39-618(SEQ ID NO621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO622)的CDR2序列具有至少50％同一性。
133.一种能结合EGFR的免疫球蛋白单可变区多肽，其中所述多肽的氨基酸序列与以下的氨基酸序列相同DOM16-39(SEQ IDNO345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO420)、DOM16-39-100(SEQ IDNO423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO430)、DOM16-39-109(SEQ IDNO432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO438)和DOM16-39-200(SEQ IDNO441)，或者与以下的氨基酸序列在不超过25个氨基酸位置上不同DOM16-39(SEQ ID NO345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO420)、DOM16-39-100(SEQ ID NO423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO430)、DOM16-39-109(SEQ ID NO432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO438)和DOM16-39-200(SEQ ID NO441)，并且其CDR3序列与DOM16-39(SEQ ID NO345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO420)、DOM16-39-100(SEQ ID NO423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO430)、DOM16-39-109(SEQ ID NO432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO438)和DOM16-39-200(SEQ ID NO441)的CDR3序列具有至少50％同一性。
134.一种能结合EGFR的免疫球蛋白单可变区多肽，其中所述多肽的氨基酸序列与以下的氨基酸序列相同DOM16-39-521(SEQ IDNO577)、DOM16-39-541(SEQ ID NO585)、DOM16-39-542(SEQ IDNO586)、DOM16-39-551(SEQ ID NO591)、DOM16-39-601(SEQ IDNO608)、DOM16-39-604(SEQ ID NO611)、DOM16-39-618(SEQ IDNO621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO622)，或者与以下的氨基酸序列在不超过25个氨基酸位置上不同DOM16-39-521(SEQ IDNO577)、DOM16-39-541(SEQ ID NO585)、DOM16-39-542(SEQ IDNO586)、DOM16-39-551(SEQ ID NO591)、DOM16-39-601(SEQ IDNO608)、DOM16-39-604(SEQ ID NO611)、DOM16-39-618(SEQ IDNO621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO622)，并且其CDR3序列与DOM16-39-521(SEQ ID NO577)、DOM16-39-541(SEQ ID NO585)、DOM16-39-542(SEQ ID NO586)、DOM16-39-551(SEQ ID NO591)、DOM16-39-601(SEQ ID NO608)、DOM16-39-604(SEQ ID NO611)、DOM16-39-618(SEQ ID NO621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO622)的CDR3序列具有至少50％同一性。
135.一种能结合EGFR的免疫球蛋白单可变区多肽，其中所述多肽的氨基酸序列与以下的氨基酸序列相同DOM16-39(SEQ IDNO345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO420)、DOM16-39-100(SEQ IDNO423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO430)、DOM16-39-109(SEQ IDNO432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO438)和DOM16-39-200(SEQ IDNO441)，或者与以下的氨基酸序列在不超过25个氨基酸位置上不同DOM16-39(SEQ ID NO345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO420)、DOM16-39-100(SEQ ID NO423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO430)、DOM16-39-109(SEQ ID NO432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO438)和DOM16-39-200(SEQ ID NO441)，并且其CDR1序列与DOM16-39(SEQ ID NO345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO420)、DOM16-39-100(SEQ ID NO423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO430)、DOM16-39-109(SEQ ID NO432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO438)和DOM16-39-200(SEQ ID NO441)的CDR1序列具有至少50％同一性，其CDR2序列与DOM16-39(SEQ ID NO345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO420)、DOM16-39-100(SEQ ID NO423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO430)、DOM16-39-109(SEQ ID NO432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO438)和DOM16-39-200(SEQ ID NO441)的CDR2序列具有至少50％同一性。
136.一种能结合EGFR的免疫球蛋白单可变区多肽，其中所述多肽的氨基酸序列与以下的氨基酸序列相同DOM16-39-521(SEQ IDNO577)、DOM16-39-541(SEQ ID NO585)、DOM16-39-542(SEQ IDNO586)、DOM16-39-551(SEQ ID NO591)、DOM16-39-601(SEQ IDNO608)、DOM16-39-604(SEQ ID NO611)、DOM16-39-618(SEQ IDNO621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO622)，或者与以下的氨基酸序列在不超过25个氨基酸位置上不同DOM16-39-521(SEQ IDNO577)、DOM16-39-541(SEQ ID NO585)、DOM16-39-542(SEQ IDNO586)、DOM16-39-551(SEQ ID NO591)、DOM16-39-601(SEQ IDNO608)、DOM16-39-604(SEQ ID NO611)、DOM16-39-618(SEQ IDNO621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO622)，并且其CDR1序列与DOM16-39-521(SEQ ID NO577)、DOM16-39-541(SEQ ID NO585)、DOM16-39-542(SEQ ID NO586)、DOM16-39-551(SEQ ID NO591)、DOM16-39-601(SEQ ID NO608)、DOM16-39-604(SEQ ID NO611)、DOM16-39-618(SEQ ID NO621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO622)的CDR1序列具有至少50％同一性，其CDR2序列与DOM16-39-521(SEQ ID NO577)、DOM16-39-541(SEQ ID NO585)、DOM16-39-542(SEQ ID NO586)、DOM16-39-551(SEQ ID NO591)、DOM16-39-601(SEQ ID NO608)、DOM16-39-604(SEQ ID NO611)、DOM16-39-618(SEQ ID NO621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO622)的CDR2序列具有至少50％同一性。
137.一种能结合EGFR的免疫球蛋白单可变区多肽，其中所述多肽的氨基酸序列与以下的氨基酸序列相同DOM16-39(SEQ IDNO345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO420)、DOM16-39-100(SEQ IDNO423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO430)、DOM16-39-109(SEQ IDNO432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO438)和DOM16-39-200(SEQ IDNO441)，或者与以下的氨基酸序列在不超过25个氨基酸位置上不同DOM16-39(SEQ ID NO345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO420)、DOM16-39-100(SEQ ID NO423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO430)、DOM16-39-109(SEQ ID NO432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO438)和DOM16-39-200(SEQ ID NO441)，并且其CDR2序列与DOM16-39(SEQ ID NO345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO420)、DOM16-39-100(SEQ ID NO423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO430)、DOM16-39-109(SEQ ID NO432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO438)和DOM16-39-200(SEQ ID NO441)的CDR2序列具有至少50％同一性，其CDR3序列与DOM16-39(SEQ ID NO345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO420)、DOM16-39-100(SEQ ID NO423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO430)、DOM16-39-109(SEQ ID NO432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO438)和DOM16-39-200(SEQ ID NO441)的CDR3序列具有至少50％同一性。
138.一种能结合EGFR的免疫球蛋白单可变区多肽，其中所述多肽的氨基酸序列与以下的氨基酸序列相同DOM16-39-521(SEQ IDNO577)、DOM16-39-541(SEQ ID NO585)、DOM16-39-542(SEQ IDNO586)、DOM16-39-551(SEQ ID NO591)、DOM16-39-601(SEQ IDNO608)、DOM16-39-604(SEQ ID NO611)、DOM16-39-618(SEQ IDNO621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO622)，或者与以下的氨基酸序列在不超过25个氨基酸位置上不同DOM16-39-521(SEQ IDNO577)、DOM16-39-541(SEQ ID NO585)、DOM16-39-542(SEQ IDNO586)、DOM16-39-551(SEQ ID NO591)、DOM16-39-601(SEQ IDNO608)、DOM16-39-604(SEQ ID NO611)、DOM16-39-618(SEQ IDNO621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO622)，并且其CDR2序列与DOM16-39-521(SEQ ID NO577)、DOM16-39-541(SEQ ID NO585)、DOM16-39-542(SEQ ID NO586)、DOM16-39-551(SEQ ID NO591)、DOM16-39-601(SEQ ID NO608)、DOM16-39-604(SEQ ID NO611)、DOM16-39-618(SEQ ID NO621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO622)的CDR2序列具有至少50％同一性，其CDR3序列与DOM16-39-521(SEQ ID NO577)、DOM16-39-541(SEQ ID NO585)、DOM16-39-542(SEQ ID NO586)、DOM16-39-551(SEQ ID NO591)、DOM16-39-601(SEQ ID NO608)、DOM16-39-604(SEQ ID NO611)、DOM16-39-618(SEQ ID NO621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO622)的CDR3序列具有至少50％同一性。
139.一种能结合EGFR的免疫球蛋白单可变区多肽，其中所述多肽的氨基酸序列与以下的氨基酸序列相同DOM16-39(SEQ IDNO345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO420)、DOM16-39-100(SEQ IDNO423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO430)、DOM16-39-109(SEQ IDNO432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO438)和DOM16-39-200(SEQ IDNO441)，或者与以下的氨基酸序列在不超过25个氨基酸位置上不同DOM16-39(SEQ ID NO345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO420)、DOM16-39-100(SEQ ID NO423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO430)、DOM16-39-109(SEQ ID NO432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO438)和DOM16-39-200(SEQ ID NO441)，并且其CDR1序列与DOM16-39(SEQ ID NO345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO420)、DOM16-39-100(SEQ ID NO423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO430)、DOM16-39-109(SEQ ID NO432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO438)和DOM16-39-200(SEQ ID NO441)的CDR1序列具有至少50％同一性，其CDR3序列与DOM16-39(SEQ ID NO345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO420)、DOM16-39-100(SEQ ID NO423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO430)、DOM16-39-109(SEQ ID NO432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO438)和DOM16-39-200(SEQ ID NO441)的CDR3序列具有至少50％同一性。
140.一种能结合EGFR的免疫球蛋白单可变区多肽，其中所述多肽的氨基酸序列与以下的氨基酸序列相同DOM16-39-521(SEQ IDNO577)、DOM16-39-541(SEQ ID NO585)、DOM16-39-542(SEQ IDNO586)、DOM16-39-551(SEQ ID NO591)、DOM16-39-601(SEQ IDNO608)、DOM16-39-604(SEQ ID NO611)、DOM16-39-618(SEQ IDNO621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO622)，或者与以下的氨基酸序列在不超过25个氨基酸位置上不同DOM16-39-521(SEQ IDNO577)、DOM16-39-541(SEQ ID NO585)、DOM16-39-542(SEQ IDNO586)、DOM16-39-551(SEQ ID NO591)、DOM16-39-601(SEQ IDNO608)、DOM16-39-604(SEQ ID NO611)、DOM16-39-618(SEQ IDNO621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO622)，并且其CDR1序列与DOM16-39-521(SEQ ID NO577)、DOM16-39-541(SEQ ID NO585)、DOM16-39-542(SEQ ID NO586)、DOM16-39-551(SEQ ID NO591)、DOM16-39-601(SEQ ID NO608)、DOM16-39-604(SEQ ID NO611)、DOM16-39-618(SEQ ID NO621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO622)的CDR1序列具有至少50％同一性，其CDR3序列与DOM16-39-521(SEQ ID NO577)、DOM16-39-541(SEQ ID NO585)、DOM16-39-542(SEQ ID NO586)、DOM16-39-551(SEQ ID NO591)、DOM16-39-601(SEQ ID NO608)、DOM16-39-604(SEQ ID NO611)、DOM16-39-618(SEQ ID NO621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO622)的CDR3序列具有至少50％同一性。
141.一种能结合EGFR的免疫球蛋白单可变区多肽，其中所述多肽的氨基酸序列与以下的氨基酸序列相同DOM16-39(SEQ IDNO345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO420)、DOM16-39-100(SEQ IDNO423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO430)、DOM16-39-109(SEQ IDNO432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO438)和DOM16-39-200(SEQ IDNO441)，或者与以下的氨基酸序列在不超过25个氨基酸位置上不同DOM16-39(SEQ ID NO345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO420)、DOM16-39-100(SEQ ID NO423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO430)、DOM16-39-109(SEQ ID NO432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO438)和DOM16-39-200(SEQ ID NO441)，并且其CDR1序列与DOM16-39(SEQ ID NO345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO420)、DOM16-39-100(SEQ ID NO423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO430)、DOM16-39-109(SEQ ID NO432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO438)和DOM16-39-200(SEQ ID NO441)的CDR1序列具有至少50％同一性，其CDR2序列与DOM16-39(SEQ ID NO345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO420)、DOM16-39-100(SEQ ID NO423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO430)、DOM16-39-109(SEQ ID NO432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO438)和DOM16-39-200(SEQ ID NO441)的CDR2序列具有至少50％同一性，其CDR3序列与DOM16-39(SEQ ID NO345)、DOM16-39-87(SEQID NO420)、DOM16-39-100(SEQ ID NO423)、DOM16-39-107(SEQID NO430)、DOM16-39-109(SEQ ID NO432)、DOM16-39-115(SEQID NO438)和DOM16-39-200(SEQ ID NO441)的CDR3序列具有至少50％同一性。
142.一种能结合EGFR的免疫球蛋白单可变区多肽，其中所述多肽的氨基酸序列与以下的氨基酸序列相同DOM16-39-521(SEQ IDNO577)、DOM16-39-541(SEQ ID NO585)、DOM16-39-542(SEQ IDNO586)、DOM16-39-551(SEQ ID NO591)、DOM16-39-601(SEQ IDNO608)、DOM16-39-604(SEQ ID NO611)、DOM16-39-618(SEQ IDNO621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO622)，或者与以下的氨基酸序列在不超过25个氨基酸位置上不同DOM16-39-521(SEQ IDNO577)、DOM16-39-541(SEQ ID NO585)、DOM16-39-542(SEQ IDNO586)、DOM16-39-551(SEQ ID NO591)、DOM16-39-601(SEQ IDNO608)、DOM16-39-604(SEQ ID NO611)、DOM16-39-618(SEQ IDNO621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO622)，并且其CDR1序列与DOM16-39-521(SEQ ID NO577)、DOM16-39-541(SEQ ID NO585)、DOM16-39-542(SEQ ID NO586)、DOM16-39-551(SEQ ID NO591)、DOM16-39-601(SEQ ID NO608)、DOM16-39-604(SEQ ID NO611)、DOM16-39-618(SEQ ID NO621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO622)的CDR1序列具有至少50％同一性，其CDR2序列与DOM16-39-521(SEQ ID NO577)、DOM16-39-541(SEQ ID NO585)、DOM16-39-542(SEQ ID NO586)、DOM16-39-551(SEQ ID NO591)、DOM16-39-601(SEQ ID NO608)、DOM16-39-604(SEQ ID NO611)、DOM16-39-618(SEQ ID NO621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO622)的CDR2序列具有至少50％同一性，其CDR3序列与DOM16-39-521(SEQ IDNO577)、DOM16-39-541(SEQ ID NO585)、DOM16-39-542(SEQ IDNO586)、DOM16-39-551(SEQ ID NO591)、DOM16-39-601(SEQ IDNO608)、DOM16-39-604(SEQ ID NO611)、DOM16-39-618(SEQ IDNO621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO622)的CDR3序列具有至少50％同一性。
143.一种EGFR拮抗剂，其CDR1序列与DOM16-39(SEQ IDNO345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO420)、DOM16-39-100(SEQ IDNO423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO430)、DOM16-39-109(SEQ IDNO432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO438)和DOM16-39-200(SEQ IDNO441)的CDR1序列具有至少50％同一性。
144.一种EGFR拮抗剂，其CDR1序列与DOM16-39-521(SEQ IDNO577)、DOM16-39-541(SEQ ID NO585)、DOM16-39-542(SEQ IDNO586)、DOM16-39-551(SEQ ID NO591)、DOM16-39-601(SEQ IDNO608)、DOM16-39-604(SEQ ID NO611)、DOM16-39-618(SEQ IDNO621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO622)的CDR1序列具有至少50％同一性。
145.一种EGFR拮抗剂，其CDR2序列与DOM16-39(SEQ IDNO345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO420)、DOM16-39-100(SEQ IDNO423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO430)、DOM16-39-109(SEQ IDNO432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO438)和DOM16-39-200(SEQ IDNO441)的CDR2序列具有至少50％同一性。
146.一种EGFR拮抗剂，其CDR2序列与DOM16-39-521(SEQ IDNO577)、DOM16-39-541(SEQ ID NO585)、DOM16-39-542(SEQ IDNO586)、DOM16-39-551(SEQ ID NO591)、DOM16-39-601(SEQ IDNO608)、DOM16-39-604(SEQ ID NO611)、DOM16-39-618(SEQ IDNO621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO622)的CDR2序列具有至少50％同一性。
147.一种EGFR拮抗剂，其CDR3序列与DOM16-39(SEQ IDNO345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO420)、DOM16-39-100(SEQ IDNO423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO430)、DOM16-39-109(SEQ IDNO432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO438)和DOM16-39-200(SEQ IDNO441)的CDR3序列具有至少50％同一性。
148.一种EGFR拮抗剂，其CDR3序列与DOM16-39-521(SEQ IDNO577)、DOM16-39-541(SEQ ID NO585)、DOM16-39-542(SEQ IDNO586)、DOM16-39-551(SEQ ID NO591)、DOM16-39-601(SEQ IDNO608)、DOM16-39-604(SEQ ID NO611)、DOM16-39-618(SEQ IDNO621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO622)的CDR3序列具有至少50％同一性。
149.一种EGFR拮抗剂，其CDR1序列与DOM16-39(SEQ IDNO345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO420)、DOM16-39-100(SEQ IDNO423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO430)、DOM16-39-109(SEQ IDNO432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO438)和DOM16-39-200(SEQ IDNO441)的CDR1序列具有至少50％同一性，并且其CDR2序列与DOM16-39(SEQ ID NO345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO420)、DOM16-39-100(SEQ ID NO423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO430)、DOM16-39-109(SEQ ID NO432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO438)和DOM16-39-200(SEQ ID NO441)的CDR2序列具有至少50％同一性。
150.一种EGFR拮抗剂，其CDR1序列与DOM16-39-521(SEQ IDNO577)、DOM16-39-541(SEQ ID NO585)、DOM16-39-542(SEQ IDNO586)、DOM16-39-551(SEQ ID NO591)、DOM16-39-601(SEQ IDNO608)、DOM16-39-604(SEQ ID NO611)、DOM16-39-618(SEQ IDNO621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO622)的CDR1序列具有至少50％同一性，并且其CDR2序列与DOM16-39-521(SEQ ID NO577)、DOM16-39-541(SEQ ID NO585)、DOM16-39-542(SEQ ID NO586)、DOM16-39-551(SEQ ID NO591)、DOM16-39-601(SEQ ID NO608)、DOM16-39-604(SEQ ID NO611)、DOM16-39-618(SEQ ID NO621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO622)的CDR2序列具有至少50％同一性。
151.一种EGFR拮抗剂，其CDR2序列与DOM16-39(SEQ IDNO345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO420)、DOM16-39-100(SEQ IDNO423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO430)、DOM16-39-109(SEQ IDNO432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO438)和DOM16-39-200(SEQ IDNO441)的CDR2序列具有至少50％同一性，并且其CDR3序列与DOM16-39(SEQ ID NO345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO420)、DOM16-39-100(SEQ ID NO423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO430)、DOM16-39-109(SEQ ID NO432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO438)和DOM16-39-200(SEQ ID NO441)的CDR3序列具有至少50％同一性。
152.一种EGFR拮抗剂，其CDR2序列与DOM16-39-521(SEQ IDNO577)、DOM16-39-541(SEQ ID NO585)、DOM16-39-542(SEQ IDNO586)、DOM16-39-551(SEQ ID NO591)、DOM16-39-601(SEQ IDNO608)、DOM16-39-604(SEQ ID NO611)、DOM16-39-618(SEQ IDNO621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO622)的CDR2序列具有至少50％同一性，并且其CDR3序列与DOM16-39-521(SEQ ID NO577)、DOM16-39-541(SEQ ID NO585)、DOM16-39-542(SEQ ID NO586)、DOM16-39-551(SEQ ID NO591)、DOM16-39-601(SEQ ID NO608)、DOM16-39-604(SEQ ID NO611)、DOM16-39-618(SEQ ID NO621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO622)的CDR3序列具有至少50％同一性。
153.一种EGFR拮抗剂，其CDR1序列与DOM16-39(SEQ IDNO345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO420)、DOM16-39-100(SEQ IDNO423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO430)、DOM16-39-109(SEQ IDNO432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO438)和DOM16-39-200(SEQ IDNO441)的CDR1序列具有至少50％同一性，并且其CDR3序列与DOM16-39(SEQ ID NO345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO420)、DOM16-39-100(SEQ ID NO423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO430)、DOM16-39-109(SEQ ID NO432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO438)和DOM16-39-200(SEQ ID NO441)的CDR3序列具有至少50％同一性。
154.一种EGFR拮抗剂，其CDR1序列与DOM16-39-521(SEQ IDNO577)、DOM16-39-541(SEQ ID NO585)、DOM16-39-542(SEQ IDNO586)、DOM16-39-551(SEQ ID NO591)、DOM16-39-601(SEQ IDNO608)、DOM16-39-604(SEQ ID NO611)、DOM16-39-618(SEQ IDNO621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO622)的CDR1序列具有至少50％同一性，并且其CDR3序列与DOM16-39-521(SEQ ID NO577)、DOM16-39-541(SEQ ID NO585)、DOM16-39-542(SEQ ID NO586)、DOM16-39-551(SEQ ID NO591)、DOM16-39-601(SEQ ID NO608)、DOM16-39-604(SEQ ID NO611)、DOM16-39-618(SEQ ID NO621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO622)的CDR3序列具有至少50％同一性。
155.一种EGFR拮抗剂，其CDR1序列与DOM16-39(SEQ IDNO345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO420)、DOM16-39-100(SEQ IDNO423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO430)、DOM16-39-109(SEQ IDNO432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO438)和DOM16-39-200(SEQ IDNO441)的CDR1序列具有至少50％同一性，其CDR2序列与DOM16-39(SEQ ID NO345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO420)、DOM16-39-100(SEQ ID NO423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO430)、DOM16-39-109(SEQ ID NO432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO438)和DOM16-39-200(SEQ ID NO441)的CDR2序列具有至少50％同一性，并且其CDR3序列与DOM16-39(SEQ ID NO345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO420)、DOM16-39-100(SEQ ID NO423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO430)、DOM16-39-109(SEQ ID NO432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO438)和DOM16-39-200(SEQ ID NO441)的CDR3序列具有至少50％同一性。
156.一种EGFR拮抗剂，其CDR1序列与DOM16-39-521(SEQ IDNO577)、DOM16-39-541(SEQ ID NO585)、DOM16-39-542(SEQ IDNO586)、DOM16-39-551(SEQ ID NO591)、DOM16-39-601(SEQ IDNO608)、DOM16-39-604(SEQ ID NO611)、DOM16-39-618(SEQ IDNO621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO622)的CDR1序列具有至少50％同一性，其CDR2序列与DOM16-39-521(SEQ ID NO577)、DOM16-39-541(SEQ ID NO585)、DOM16-39-542(SEQ ID NO586)、DOM16-39-551(SEQ ID NO591)、DOM16-39-601(SEQ ID NO608)、DOM16-39-604(SEQ ID NO611)、DOM16-39-618(SEQ ID NO621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO622)的CDR2序列具有至少50％同一性，并且其CDR3序列与DOM16-39-521(SEQ ID NO577)、DOM16-39-541(SEQ ID NO585)、DOM16-39-542(SEQ ID NO586)、DOM16-39-551(SEQ ID NO591)、DOM16-39-601(SEQ ID NO608)、DOM16-39-604(SEQ ID NO611)、DOM16-39-618(SEQ ID NO621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO622)的CDR3序列具有至少50％同一性。
157.一种具有血管内皮生长因子(VEGF)和表皮生长因子受体(EGFR)结合特异性的配体，所述配体包含至少一个具有VEGF结合特异性结合位点的蛋白质部分、至少一个具有EGFR结合特异性结合位点的蛋白质部分和抗体Fc区。
158.权利要求157的配体，其中所述具有VEGF结合特异性结合位点的蛋白质部分是能结合VEGF的域抗体(dAb)。
159.权利要求158的配体，其中所述能结合VEGF的dAb与选自以下的抗VEGF dAb竞争性结合VEGFTAR15-6(SEQ IDNO117)、TAR15-8(SEQ ID NO119)和TAR15-26(SEQ ID NO123)。
160.权利要求158的配体，其中所述能结合VEGF的dAb与TAR15-26-555(SEQ ID NO704)竞争性结合VEGF。
161.权利要求157-160中任一项的配体，其中所述具有EGFR结合特异性结合位点的蛋白质部分是能结合EGFR的域抗体(dAb)。
162.权利要求161的配体，其中所述能结合EGFR的dAb与选自以下的抗EGFR dAb竞争性结合EGFRDOM16-39(SEQ IDNO345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO420)、DOM16-39-100(SEQ IDNO423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO430)、DOM16-39-109(SEQ IDNO432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO438)和DOM16-39-200(SEQ IDNO441)。
163.权利要求161的配体，其中所述能结合EGFR的dAb与选自以下的抗EGFR dAb竞争性结合EGFRDOM16-39-521(SEQ IDNO577)、DOM16-39-541(SEQ ID NO585)、DOM16-39-542(SEQ IDNO586)、DOM16-39-551(SEQ ID NO591)、DOM16-39-601(SEQ IDNO608)、DOM16-39-604(SEQ ID NO611)、DOM16-39-618(SEQ IDNO621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO622)。
164.一种具有血管内皮生长因子(VEGF)结合特异性的配体，所述配体包含至少一个具有VEGF结合特异性结合位点的蛋白质部分和抗体Fc区。
165.权利要求164的配体，其中所述具有VEGF结合特异性结合位点的蛋白质部分是域抗体(dAb)。
166.权利要求165的配体，其中所述dAb与选自以下的抗VEGFdAb竞争性结合VEGFTAR15-6(SEQ ID NO117)、TAR15-8(SEQ IDNO119)和TAR15-26(SEQ ID NO123)。
167.权利要求165的配体，其中所述dAb与TAR15-26-555(SEQID NO704)竞争性结合VEGF。
168.一种具有表皮生长因子受体(EGFR)结合特异性的配体，所述配体包含至少一个具有EGFR结合特异性结合位点的蛋白质部分和抗体Fc区。
169.权利要求168的配体，其中所述具有EGFR结合特异性结合位点的蛋白质部分是域抗体(dAb)。
170.权利要求169的配体，其中所述dAb与选自以下的抗EGFRdAb竞争性结合EGFRDOM16-39(SEQ ID NO345)、DOM16-39-87(SEQ ID NO420)、DOM16-39-100(SEQ ID NO423)、DOM16-39-107(SEQ ID NO430)、DOM16-39-109(SEQ ID NO432)、DOM16-39-115(SEQ ID NO438)和DOM16-39-200(SEQ ID NO441)。
171.权利要求169的配体，其中所述dAb与选自以下的抗EGFRdAb竞争性结合EGFRDOM16-39-521(SEQ ID NO577)、DOM16-39-541(SEQ ID NO585)、DOM16-39-542(SEQ ID NO586)、DOM16-39-551(SEQ ID NO591)、DOM16-39-601(SEQ ID NO608)、DOM16-39-604(SEQ ID NO611)、DOM16-39-618(SEQ ID NO621)和DOM16-39-619(SEQ ID NO622)。
172.权利要求168的配体，其中所述配体包含至少两个具有EGFR结合特异性结合位点的蛋白质部分和抗体Fc区。
173.一种具有血管内皮生长因子(VEGF)和表皮生长因子受体(EGFR)结合特异性的配体，所述配体包含至少一个具有VEGF结合特异性的免疫球蛋白单可变区、至少一个具有EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区和接头，其中所述具有EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区通过所述接头与所述具有VEGF结合特异性的免疫球蛋白单可变区键合。
174.一种具有血管内皮生长因子(VEGF)和表皮生长因子受体(EGFR)结合特异性的配体，所述配体包含至少一个具有VEGF结合特异性的免疫球蛋白单可变区、至少一个具有EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区，其中所述具有EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区与所述具有VEGF结合特异性的免疫球蛋白单可变区直接融合。
175.权利要求173的配体，其中所述接头选自SEQ ID NO706、SEQ ID NO707、SEQ ID NO708、SEQ ID NO709、SEQ ID NO710、SEQ ID NO711、SEQ ID NO712、SEQ ID NO713、SEQ ID NO714、SEQ ID NO723和SEQ ID NO724。
176.权利要求173或175的配体，其中所述配体还包含抗体Fc区。
177.权利要求176的配体，其中所述配体还包含第二接头，并且其中一个所述免疫球蛋白单可变区通过所述第二接头与所述Fc区键合。
178.权利要求177的配体，其中所述第二接头选自SEQ IDNO706、SEQ ID NO707、SEQ ID NO708、SEQ ID NO709、SEQ IDNO710、SEQ ID NO711、SEQ ID NO712、SEQ ID NO713、SEQ IDNO714、SEQ ID NO723和SEQ ID NO724。
179.权利要求174的配体，其中所述配体还包含接头和抗体Fc区，并且其中一个所述免疫球蛋白单可变区通过所述接头与所述抗体Fc区键合。
180.权利要求179的配体，其中所述接头选自SEQ ID NO706、SEQ ID NO707、SEQ ID NO708、SEQ ID NO709、SEQ ID NO710、SEQ ID NO711、SEQ ID NO712、SEQ ID NO713、SEQ ID NO714、SEQ ID NO723和SEQ ID NO724。
181.权利要求173-180中任一项的配体，其中
a.所述具有VEGF结合特异性的免疫球蛋白单可变区是重链可变区，而所述具有EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区是轻链可变区；
b.所述具有VEGF结合特异性的免疫球蛋白单可变区是轻链可变区，而所述具有EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区是重链可变区；
c.所述具有VEGF结合特异性的免疫球蛋白单可变区是重链可变区，而所述具有EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区是重链可变区；或者
d.所述具有VEGF结合特异性的免疫球蛋白单可变区是轻链可变区，而所述具有EGFR结合特异性的免疫球蛋白单可变区是轻链可变区。
182.权利要求181的配体，其中所述重链可变区是VH或VHH。
183.权利要求181的配体，其中所述重链可变区是人VH。
184.权利要求181的配体，其中所述轻链可变区是VK。
185.一种具有血管内皮生长因子(VEGF)和/或表皮生长因子受体(EGFR)结合特异性的配体，所述配体包含第一免疫球蛋白单可变区、第二免疫球蛋白单可变区和抗体Fc区。
186.权利要求185的配体，其中所述配体从氨基端到羧基端的通式是dAb1-dAb2-Fc，其中dAb1是所述第一免疫球蛋白单可变区，dAb2是所述第二免疫球蛋白单可变区，Fc是所述抗体Fc区，其中dAb1与dAb2直接键合或通过第一接头键合，而dAb2与Fc直接键合或通过第二接头键合。
187.权利要求186的配体，其中dAb1和dAb2相同。
188.权利要求186或187的配体，其中dAb1和dAb2各自为轻链单可变区。
189.权利要求188的配体，其中dAb1和dAb2各自为Vk。
190.权利要求186或187的配体，其中dAb1和dAb2各自为重链单可变区。
191.权利要求185-190中任一项的配体，其中所述第一免疫球蛋白单可变区和所述第二免疫球蛋白单可变区各自具有EGFR结合特异性。
192.权利要求185-190中任一项的配体，其中所述第一免疫球蛋白单可变区和所述第二免疫球蛋白单可变区各自具有VEGF结合特异性。
193.权利要求186和188-190中任一项的配体，其中dAb1具有EGFR结合特异性，dAb2具有VEGF结合特异性。
194.权利要求186和188-190中任一项的配体，其中dAb1具有VEGF结合特异性，dAb2具有EGFR结合特异性。
195.一种配体，其中所述配体是包含第一配体和第二配体的二聚体，其中所述第一配体和所述第二配体各自如权利要求185-194中任一项所定义。
196.权利要求195的配体，其中所述二聚体在所述第一配体和所述第二配体之间包含二硫键。
全文摘要
公开了具有血管内皮生长因子(VEGF)结合特异性的配体、具有表皮生长因子受体(EGFR)结合特异性的配体或同时具有VEGF和EGFR结合特异性的配体。也公开了使用这些配体的方法。具体地讲，描述了这些配体在癌症治疗中的用途。
文档编号C07K16/28GK101426815SQ200680052392
公开日2009年5月6日 申请日期2006年12月5日 优先权日2005年12月6日
发明者O·伊纳托维奇, S·霍尔姆斯, R·贝克曼, 刘海群, R·M·T·德维尔德特, L·S·耶斯佩斯, M·斯图尔特, A·塞普, M·普佩卡 申请人:杜门蒂斯有限公司