一种人表皮生长因子受体的ctl表位多肽及其应用
【专利摘要】本发明涉及一种人表皮生长因子受体的CTL表位多肽，该多肽具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；或该多肽具有在SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列基础上取代、缺失、置换、插入和/或添加一个至几个氨基酸的衍生序列。本发明还提供一种疫苗，包括人表皮生长因子受体的CTL表位多肽和佐剂，所述佐剂为gp96蛋白。通过佐剂和人表皮生长因子受体的CTL表位多肽的配合具有，具有提高免疫力，显著提高治疗肿瘤效果等优点。
【专利说明】
一种人表皮生长因子受体的CTL表位多肽及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种人表皮生长因子受体的CTL表位多肽及 其应用。
【背景技术】
[0002] 肺癌是目前国内乃至世界发病率和死亡率增长最快，对人群健康和生命威胁最大 的恶性肿瘤之一。男性肺癌发病率和死亡率均占所有恶性肿瘤的第一位，女性发病率占第 二位，死亡率占第二位。大量临床资料表明，长期大量吸烟与肺癌的发生密切相关。由于吸 烟导致的被动吸烟者肺癌患病率明显增加。此外，研究发现近年来非吸烟群体的肺癌发病 率明显上升。这可能与大气污染的加重，特别是受可吸入颗粒大规模长时期的影响相关。
[0003] 肺癌常用的治疗方法包括手术治疗、化学治疗、放射治疗、靶向治疗、免疫治疗以 及不同治疗方法的联合治疗。近年来，即使肺癌的治疗方法不断创新改进，但治疗效果仍不 能令人满意，复发转移几率还是较高。
[0004] 目前世界上倾向于将肺癌粗分为小细胞肺癌（SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)，后 者包括除小细胞癌以外的其他上皮癌。小细胞肺癌的生物学行为与其他上皮性癌(鳞癌、腺 癌、腺鳞癌、大细胞癌）显著不同，临床上表现为高度恶性，早期即发生广泛的远处转移，对 化学治疗和放射治疗较敏感，因而治疗原则也不同于其他上皮癌。目前临床上常见的肺癌 病人约80 %为包括鳞癌、腺癌等在内的非小细胞肺癌，这些病人确诊时有85 %左右是中晚 期，约75%的晚期非小细胞肺癌病人失去了手术根治性治疗机会、常规放化疗的临床效果 也不甚理想。
[0005] 分子靶向药物治疗是近年新兴的一种治疗手段，因其具有高度选择性地杀死肿瘤 细胞而不杀伤或仅极少损伤正常细胞的特点，安全性和耐受性较好、毒付作用相对较小，许 多病人都视其为治疗肺癌的一线生机。分子靶向是指在细胞分子水平上，针对已经明确的 致癌位点，来设计相应的治疗药物，药物进入体内会特异地选择致癌位点来相结合发生作 用，使肿瘤细胞特异性死亡，而不会波及肿瘤周围的正常组织细胞。在非小细胞肺癌中，很 多病人都存在着表皮生长因子受体(EGFR)高表达，并且肿瘤的生长依赖着EGFR信号传导通 路。此外，临床研究发现肺癌患者中人体表皮生长因子受体基因突变频率高，突变后的EGFR 对表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂敏感性增加。因此靶向治疗对EGFR基因突变的患者 效果明显，通过阻断致癌信号的传输达到控制癌症的效果。目前肺癌靶向治疗的常用表皮 生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)包括易瑞沙、特罗凯、凯美纳等。研究表明，在 我国非小细胞肺癌患者中，有特定的人群，包括女性、腺癌、不吸烟的患者，对易瑞沙和特罗 凯治疗的有效率高。受体酪氨酸激酶抑制剂药物的问题是价格较贵，在我国属于自费药物， 没有纳入医保报销范围，对有效的病人造成巨大的经济负担。此外，长时间使用靶向药物极 易产生耐药性，导致药物的药效降低。再次，靶向药物对患者具有一定的毒副作用，包括后 期皮疹，皮肤发干，发黑等症状。因此，迫切需要开发新的治疗性疫苗以补充或替代现有的 抗肿瘤治疗方案。
[0006] 研究显示，肿瘤特异性杀伤性T淋巴细胞(Cytolytic T lymph〇Cyte，CTL)在清除 肿瘤中起着至关重要的作用。大部分肿瘤患者T细胞反应低下，如何激活CTL免疫反应成为 焦点。而CTL表位在CTL活化过程中扮演着关键角色，是诱导特异性CTL克隆性增殖、分化和 发挥效应的最重要的激发因素，在机体免疫中发挥着重要的作用。
[0007] 热休克蛋白（Heat shock protein，HSP)是一类在生物进化中高度保守且广泛存 在于原核及真核生物中的蛋白质，加热、缺氧、病毒感染、重金属中毒、氧化剂等刺激因素都 可诱导其表达增加。HSP根据同源程度及分子量大小可分为HSP110、HSP90、HSP70、HSP60、 HSP40、小分子HSP及泛素等多个亚家族。人类热休克蛋白90家族(HSP90)包括HSP90a，HSP90 0，gp96(grp94)和Trap-1四个成员。gp96(GRP94)为内质网HSP90家族的代表，与细胞质 HSP90高度同源，主要生物学功能有:分子伴侣，参与新合成蛋白的折叠与组装;与细胞内的 其他肽类蛋白质尤其是变性蛋白的结合，参与细胞的抗损伤、修复和热耐受过程;参与蛋白 质水解过程;结合抗原肽，加工提呈肿瘤抗原及维持细胞内环境稳定等作用；对细胞的生 长、发育、分化及死亡具有一定的调节作用。gp96是一种遗传单态性分子，其氨基酸(aa)序 列高度保守：小鼠和仓鼠的gp96氨基酸序列有95%以上的同源性，猪源、人源与禽源的gp96 氨基酸序列分别有97%和89%以上的同源性。gp96由于具有显著的生物学活性，特别是在 免疫学方面同时具有刺激特异性杀伤T细胞的作用和抑制调节性T细胞的作用。gp96能结合 细胞中5-25mer的抗原多肽，通过抗原呈递细胞(APC)表面CD91分子进入细胞并将结合的抗 原表位呈递给MHC I类和II类分子从而启动特异性T细胞免疫应。此外，gp96能有效激发天 然免疫。gp96是来源于哺乳动物细胞的天然佐剂，可作用于APC及T细胞等其它免疫细胞，促 进DC成熟，刺激细胞产生免疫因子IL-6、IL-12、TNF等，从而增强机体天然免疫反应。 Srivastava等人首先发现了 gp96在肿瘤免疫应答中的重要作用。从肿瘤中获得的gp96_抗 原肽复合物能够有效地刺激机体产生抗肿瘤免疫应答。同时，由于胎盘中含有大量的癌胚 抗原，将胎盘中的gp96纯化分离后免疫C57BL/6小鼠，也能取得良好的预防和治疗效果。
[0008] 由于组织来源有限，从组织提取的热休克蛋白gp96蛋白产量有限，难以工业化应 用，而且组织提取的gp96蛋白结合组织细胞内的抗原多肽，影响其与外源多肽的结合，从而 影响疫苗的疗效。此外，受伦理道德因素的制约，从组织提取的gp96难以直接作为药物推 广。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的是提供一种表皮生长因子受体的CTL表位多肽以及昆虫细胞分泌表 达的gp96及其联合应用。
[0010] 本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
[0011] 一种人表皮生长因子受体的CTL表位多肽，该多肽具有SEQ ID N0.2所示的氨基酸 序列;或
[0012] 该多肽具有在SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列基础上取代、缺失、置换、插入和/或 添加一个至几个氨基酸的衍生序列。
[0013] 所述衍生序列仍与人表皮生长因子受体的CTL表位相关。
[0014]所述衍生序列与SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列的功能相近或一致，所述功能主 要指结合HLA-A2分子的能力、刺激特异性T细胞产生、抗肿瘤生长的能力等。
[0015] 本发明所述的人表皮生长因子受体的CTL表位多肽具有水溶性好，便于临床应用 等优点。
[0016] 经试验验证，本发明所述的人表皮生长因子受体的CTL表位多肽的溶解度(溶剂可 以为任何水溶液，纯水，生理盐水或磷酸盐缓冲液等等)可以达到至少20mg/mL，且不需要用 有机溶剂溶解。
[0017] 以多肽做为临床药物时，为保证具有足够的效果，需要具备一定的溶解性。但现有 的多肽具有水溶性不好等缺陷，在使用时只能将多肽溶于极性溶剂(例如：油类化合物、乙 醇等）。在临床药物进行主管部门审批时，受极性溶剂的影响，审查周期延长或者不能够审 批通过，影响多肽类药物的进一步应用。为了避免上述缺陷，一般采用多肽修饰的方法来 改善多肽的水溶性，但是存在实验周期长、效果不理想等问题。
[0018] 本发明提供的人表皮生长因子受体的CTL表位多肽具有很好的水溶性，应用前景 好。
[0019] 本发明所述的人表皮生长因子受体的CTL表位与HLA分子还具有很强的结合能力， 经试验证实具有很强大的免疫学功能。
[0020] 对于衍生序列，如果在SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列的基础上加或减一个氨基 酸，得到的序列仍然不影响原多肽序列的功能，那么该衍生序列也在本发明的保护范围内。
[0021] 除该多肽第二位和最后一位不能改变，其余氨基酸可以被其他同性质（例如亲水 氨基酸被亲水氨基酸取代，疏水氨基酸被疏水氨基酸取代)的氨基酸取代。
[0022]在SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列的基础上，出于某种目的的需要（例如：为了便 于纯化、表达、标记等操作)常常会添加一些标签序列或限制性酶切位点以及保护碱基等。 所述标签序列、限制性酶切位点以及保护碱基等均可以根据具体的使用情况进行具体选 择，并无特殊限制。
[0023]优选地，所述人表皮生长因子受体的CTL表位多肽为SEQ ID N0.2所示的氨基酸序 列。
[0024] 本发明还提供一种人表皮生长因子受体的CTL表位多肽的编码基因，通过上述编 码基因来编码上述的人表皮生长因子受体的CTL表位多肽。
[0025] 本发明还提供一种重组载体，所述重组载体克隆、分泌和/或表达上述的人表皮生 长因子受体的CTL表位多肽。
[0026] 所述重组载体可以根据实际的实际的需要选择，与蛋白表达或复制的调控元件， 例如：启动子、终止子、多克隆位点、RBS序列、抗性基因以及其他具有生理性功能的基因等 等。
[0027] 本发明还提供一种转化体，包括上述的重组载体。所述重组载体可以独立复制也 可以整合到细菌的染色体DNA中，随染色体DNA的复制而复制。
[0028] 本发明中，所述的转化子为含有上述的重组载体的细胞。
[0029] 通过上述的重组载体以及转化体，可以在体外实现表达多肽。
[0030] 本发明所述的人表皮生长因子受体的CTL表位多肽在肿瘤治疗中的应用。优选地， 应用于肺癌的治疗中。
[0031] 本发明还一种疫苗，包括上述的人表皮生长因子受体的CTL表位多肽和佐剂。
[0032] 本发明所述的人表皮生长因子受体的CTL表位多肽可以作为疫苗的活性组分，用 于肺癌的治疗，具有水溶性好优点。
[0033]进一步，所述佐剂包括gp96蛋白。
[0034]采用上述进一步方案的有益效果是:通过gp96蛋白与人表皮生长因子受体的CTL 表位多肽的联合使用，具有抑制肿瘤生长的效果好等优点。
[0035] 进一步，所述gp96蛋白为采用昆虫细胞表达系统表达分泌型的gp96蛋白。
[0036] 采用上述进一步方案的有益效果是：
[0037] 发明人在研究过程中，进行对于表达系统的选择进行了筛选，例如:大肠表达系统 和酵母表达系统等。最终意外的发现了采用昆虫细胞表达系统表达分泌型的gp96蛋白最合 适，gp96蛋白产量高并且作为佐剂制备疫苗时效果好。
[0038]发明采用昆虫细胞表达系统表达分泌型的gp96蛋白，表达系统稳定，gp96蛋白的 表达量高，蛋白糖基化更接近于哺乳动物细胞，蛋白稳定，且从细胞上清中提取，纯化简单。 昆虫细胞分泌表达的热休克蛋白gp96不结合抗原多肽，因此可以更好地与外源多肽结合， 从而增强了其免疫学功能。
[0039] 进一步，所述gp96蛋白通过昆虫杆状病毒感染的昆虫细胞分泌表达。
[0040] 采用上述进一步方案的有益效果是:采用昆虫杆状病毒感染的昆虫细胞分泌表达 具有效率尚、易提纯、活性好且安全性尚等优点。
[0041] 进一步，所述gp96蛋白和人表皮生长因子受体的CTL表位多肽的质量比为1: (0.5- 10)，优选地，所述gp96蛋白和人表皮生长因子受体的CTL表位多肽的质量比为1:2.5。
[0042] 采用上述进一步方案的有益效果是:质量比设置为1: (0.5-10)有利于刺激特异性 CTL产生，产生更好的抑制肿瘤的效果，如果比例过高，容易导致抑制机体的免疫系统，产生 免疫耐受问题，如果比例过低容易导致没有效果问题;发明人在研究中发现，当比例设置为 1:2.5时，刺激特异性CTL产生的效果更好。
[0043] 进一步，所述gp96蛋白包括SEQ ID N0.9所示的氨基酸序列；和/或 [0044] 所述gp96蛋白的编码基因包括SEQ ID N0.8所示的核苷酸序列。
[0045] 本发明提供一种gp96蛋白的制备方法，包括以下步骤：利用昆虫细胞分泌表达 gp96蛋白，昆虫细胞培养上清依次进行HiTrap Q HP阴离子交换柱和Superdex 200 10/ 300GL分子筛层析得到的。
[0046] 采用上述进一步方案的有益效果是：纯化简便，特异性强，可以精确控制条件，并 可用于规模化工业生产，在保证蛋白纯度的前提下，既节约了时间，又减少了蛋白的丢失。 [0047]进一步，包括以下具体步骤：
[0048] 1)利用昆虫杆状病毒感染的昆虫细胞分泌表达gp96蛋白：构建含有gp96蛋白的表 达载体和转化子;所述转化子为转染有gp96蛋白的表达载体的细胞；
[0049] 2)将杆状病毒侵染转化子后，进行悬浮培养，培养温度为27 °C，培养时的转速为 100-120rpm/min，培养结束后，收集上清液；
[0050] 3)将上清液进行HiTrap-Q Sepharose离子交换层析，具体包括如下步骤：
[0051] (a)将步骤2)得到的上清液上样于层析柱，流速为lmL/min;
[0052] (b)用5mL PBS缓冲液洗涤步骤(a)的层析柱，流速为lmL/min，所述PBS缓冲液含有 20〇111]\1恥(：1，？85缓冲液的口11为7.5;
[0053] (c)用10mL的PBS缓冲液洗涤步骤(b)的层析柱，流速为lmL/min;所述roS缓冲液含 有30〇111]\1他(：1，？85缓冲液的口11为7.5;
[0054] (d)用3mL的PBS缓冲液洗涤步骤(c)的层析柱，流速为lmL/min，得到的洗脱液即为 含有gp96蛋白的提取物;所述PBS缓冲液含有600mM NaCl，PBS缓冲液的pH为7.5;
[0055] 4)将洗脱液进行Superdex 200 10/300GL分子筛层析，具体包括如下步骤：
[0056] (a)将HiTrap-Q Sepharose离子交换层析所得gp96蛋白提取物通过50Kd超滤管浓 缩，用pH为7.5的PBS换液，浓缩终体积为lmL的浓缩液，所述浓缩液含有gp96蛋白；
[0057] (b)通过上样环将步骤(a)的浓缩液上样于层析柱，流速为0.25mL/min;
[0058] (c)用PBS缓冲液洗涤层析柱，流速为0 ? 25mL/min，收取gp96蛋白；将收集的gp96蛋 白用pH为7.5的PBS缓冲液换液，浓缩，测定gp96蛋白浓度后分装、贝士存。
[0059] 采用上述进一步方案的有益效果是：
[0060] 步骤3)的步骤(b)中200mM NaCl可以将部分杂蛋白洗脱，提高gp96蛋白的纯度；
[0061 ] 步骤3)的步骤(C)中300mM NaCl既可以将杂蛋白洗脱，又能保证gp96仍然结合在 尚子柱上，有利于提尚gp96蛋白的纯度和广量；
[0062] 步骤3)的步骤(d)中600mM NaCl既可以将gp96蛋白完全洗脱，又能避免过高的盐 浓度混入杂蛋白，有利于提尚gp96蛋白的纯度和广量；
[0063]步骤4)中分子层析柱的使用可以提高gp96蛋白的纯度。
【附图说明】
[0064]图1为多肽与T2细胞表面的HLA-A2分子结合能力的实验结果。
[0065]图2为多肽与HLA-A2分子以及分子构成复合物的体外重折叠 (refolding)的实 验结果。
[0066]图3为多肽免疫HLA_2.1/Kb转基因小鼠，其脾细胞中多肽特异性CTL免疫反应的 ELISP0T检测结果。
[0067]图4裸鼠接种肺癌患者原位肿瘤组织，转输经多肽免疫的HLA_2.1/Kb转基因小鼠 的脾脏淋巴细胞后，与对照组相比，其肿瘤的生长情况。肺癌患者血液细胞HLA限制性经流 式细胞仪检测为HLA-2阳性。
【具体实施方式】
[0068] 以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并 非用于限定本发明的范围。
[0069] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试 验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验， 均设置三次重复实验，结果取平均值。ATCC即美国模式培养物集存库（American type culture collection)的简写，网址http: //www.atcc.org/〇
[0070] PBS缓冲液：8g NaCl、0.2g KCl、3.625g Na2HP〇4 ? 12H20、0.24g KH2P04,加水至 1L，调pH7.4。
[0071] 通过在NCBI(National Center for Biotechnology Information)的Protein数 据库中搜索人表皮生长因子受体蛋白的氨基酸序列(Accession: NP_005219.2)，如序列表 的SEQ ID NO. 1所示，以此作为合成多肽的序列来源。
[0072]实施例1、制备EGFR衍生的九肽，该多肽序列在EGFR的前体和成熟体中都存在。 [0073] 该衍生九肽为66?1?599-607多肽片段，其氨基酸序列如5￡〇10勵.2所示，由氮末 端至碳末端方向的氨基酸序列为:Val Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val。
[0074] EGFR599-607多肽片段由吉尔生化(上海)有限公司合成。
[0075]对照多肽：乙肝病毒HBC82-90肽来源于乙肝病毒核心蛋白，非肿瘤抗原，其氨基酸 序列如SEQ ID N0.3所示。
[0076] 实施例2、实验验证EGFR599-607多肽片段与HLA-A2分子的结合力
[0077] 分别通过T2细胞结合实验和体外重折叠实验来检测EGFR599-607多肽片段与HLA- A2分子的结合力。
[0078] -、T2细胞结合实验检测多肽与细胞表面的HLA-A2分子的结合能力
[0079] T2细胞表面表达HLA-A0201分子(HLA-A0 201分子也可以写成HLA-A*0201分子，是 HLA-A2分子的一个分支），且其TAP基因缺陷，所以该细胞不能加工呈递内源性的多肽，故 其细胞表面的HLA-A0201分子处于不稳定且低表达的状态。当有HLA-A0201分子可结合的外 源性抗原多肽存在时，这些多肽与T2细胞表面的HLA-A2分子结合，会大大增加其细胞表面 的HLA-A0201稳定性，很大程度上提高细胞表达HLA-A2的强度，通过荧光标记的MHC抗体标 记和流式检测即可鉴定，采用FI (fluorescence index，FI)值来说明多肽的结合力强弱。FI =(待测多肽的平均荧光强度-不加多肽的平均荧光强度)/不加多肽的平均荧光强度，若FI 2 1，则被认为是与HLA-A2分子结合力高的多肽。具体操作步骤如下：
[0080] 取生长良好的细胞(来自ATCC.〖CRL-1992tm)，用无血清的培养基洗两次，再用少量 无血清培养基悬起，细胞计数，接种到96孔板中，每个孔中接种2 X 105个细胞，加入终浓度 为100yg/mL待测多肽，lyg/mL人fen蛋白（购自sigma)，每个孔的体系为100iiL，37°C条件下 培养16小时。
[00811收集96孔板中的细胞，用PBS缓冲液洗2次，用偶联FITC的抗人一 HLA-A2特异性抗 体BB7.2(abcam公司，货号ab27728)标记细胞，4°C条件下反应30min。收集标记后的细胞，用 PBS缓冲液洗两次，用流式细胞仪测定样品的荧光强度。用FI值来评判待测多肽的结合力强 弱。
[0082] 上述中，实验组加入的多肽为EGFR599-607多肽片段;对照组加入的多肽为乙肝病 毒 HBc82-90肽。
[0083] 实验结果如图1所示，实验组EGFR599-607多肽片段的荧光强度明显比对照组（乙 肝病毒mc82-90肽）的荧光强度要强。EGFR599-607与对照组的FI值分别为43.5、9.03，说明 与对照组相比，EGFR599-607多肽片段与HLA-A2分子有很好的结合力。而能结合HLA分子是 多肽具有免疫学功能的前提，本发明所述EGFR599-607多肽片段与HLA-A2分子的结合能力 更强，可能具有强大的免疫学功能。
[0084]二、体外重折叠(refolding)实验检测多肽与HLA-A0201分子的结合能力 [0085] 在refolding实验中，如果多肽能与HLA-A0201分子结合，那么多肽、HLA-A0201以 及说微球蛋白（fem)就能形成稳定的多肽-HLA-fcm三元复合物，在分子筛层析图谱中出现多 肽-HLA-fem复合物蛋白峰。HLA-A2分子由重链和轻链组成，重链的编码序列如SEQ ID N0.4 所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5显示。轻链的编码序列如SEQ ID NO.6显示，其氨基酸序 列如SEQ ID N0.7所示。
[0086] 1、构建HLA-A0201重链胞外区质粒
[0087] 将编码HLA-A0201 重链胞外区的DNA(GENBANK ACCESSION N0.AY365426 自 5'末端 第73-897位核苷酸）导入pET-28a质粒(Novagen，69864-3CN)，得到重链重组质粒，命名为 HLA-A0201-HC 质粒。
[0088] 2、构建人fen表达质粒
[0089] 将编码人fen的DNA(GENBANK ACCESSION N0.NM_004048 自 5'末端第 121-417位核 苷酸)导入pET-28a质粒，得到轻链重组质粒，命名为质粒。
[0090] 3、原核提取HLA重链和轻链蛋白
[0091] 包涵体清洗液（washing buffer):0 ? 5% (体积分数）Triton-100，50mM Tris pH 8.0,300mM NaCl，10mM EDTA，10mM DTT;
[0092] 包涵体重悬液（resuspension buffer): 50mM Tris pH 8 ? 0，lOOmM NaCl，lOmM EDTA,l〇mM DTT；
[0093] 包涵体溶解液（dissolution Buffer): 6M Gua-HCl (或8M尿素），10 % (体积分数） 甘油，50mM Tris pH8.0,100mM NaCl，10mM EDTA，10mM DTT;
[0094] 复性液（refolding buffer): lOOmM Tris pH 8.0,400mM L_Arg HC1，2mM EDTA， 5mM GSH(还原性谷胱甘肽，溶液预冷后加入），0.5mM GSSG(氧化性谷胱甘肽，溶液预冷后加 入），0.5mM PMSF〇
[0095] LB培养基:胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，加水定容至1L。
[0096] (1)将HLA-A0201-HC质粒与fen质粒分别转入BL21(DE3)感受态细胞中（购自天根 生化科技公司，产品号CB105-02)，从平板上挑取单克隆菌落接种到5mL的LB培养基中，该培 养基中含有l〇〇mg/mL氨节霉素，小量活化，培养10-12h。然后按照1 % (体积比）的接种量接 种到2L LB培养基中大量培养(温度为37°C，转速为200rpm)，培养至0D = 0.4-0.6,在无菌条 件下加入IPTG(终浓度为lmM)，37°C诱导4-6小时，4°C条件下，7000rpm离心10min，收集菌 体。
[0097] (2)用PBS缓冲液将菌体重悬，在冰浴条件下进行超声破碎（超声6s，间隔12s，99 次，250W，多个循环），直至菌体悬液透明。收集超声后的菌液，4°C条件下12000rpm离心 20min。沉淀中呈白色致密块即为包涵体。
[0098] (3)用玻璃棒将包涵体上的菌体残渣刮去，用washing buffer将包涵体悬起，用超 声裂解方法进一步纯化蛋白（超声4s，间隙10s，40次，250w)，离心，收集沉淀（4°C条件， 12000rpm离心20min)。此步骤重复三次。再用resuspension buffer将包涵体沉淀悬起，并 超声裂解一次，离心收集包涵体(4°C条件，12000rpm离心20min)。注:每次超声裂解离心过 后，都需要用玻璃棒将表面的菌体残渣尽量刮去。
[0099] (4)离心收集的包涵体，将上清除去，倒置控干，称重，按30mg的包涵体加入lmL dissolution buffer的比例加入dissolution buffer溶解，4°C条件搅拌溶解过夜。离心收 集上清(4°C条件，12000rpm离心20min)，将上清分装后-20°C冻存。
[0100] 通过上述方法，分别获得了 ft?包涵体蛋白和重链包涵体蛋白。
[0101] 4、包涵体体外复性
[0102] (1)配制refolding buffer，将装有refolding buffer的烧杯放置在磁力搅拌器 上，转子的搅拌速度为1 s转子转一圈较好。用lmL注射器的针头替换5mL或1 OmL注射器的针 头，将替换组合后的注射器固定在烧杯上，在注射器中加入溶解好的包涵体，使其能一滴一 滴地慢速滴入refolding buffer中。按最先轻链包涵体蛋白，其次多肽，再次重链包涵 体蛋白的顺序加入，以重链包涵体蛋白：轻链fern包涵体蛋白：多肽=1:1:3的摩尔比加入。 重链包涵体蛋白最好分三次加入，每次加入的时间间隔8-10h，多肽溶解在100-200微升二 甲亚砜中一次性注入。
[0103] 实验组加入的多肽为EGFR599-607多肽片段；对照组加入的多肽为乙肝病毒 HBc82-90肽。
[0104] (2)将复性结束后的复性液用浓缩杯进行浓缩(在加入浓缩杯之前最好12000rpm， 4°C离心20min，尽量去除沉淀以减小沉淀堵住浓缩膜的可能性），并换液到分子筛缓冲液 (含有20mM Tris，50mM NaCl，pH8.0)，当溶液体积最终小于50mL之后换到浓缩管继续浓缩 至5mL以内，12000rpm，4°C条件离心10min后取上清准备上样。将准备好的复性浓缩液注入 AKTA FPLC，根据Hi load 16/60superdex 200(GE公司，货号为 17-1139-01)分子筛层析的 结果检测复性效果。分子筛层析过程中，收集各个蛋白峰的样品，经变性聚丙烯酰胺凝胶电 泳鉴定。
[0105] 复性结果由图2所示，EGFR599-607多肽片段在目标位置10-15mL处出现了明显的 复合物蛋白峰，而对照组的多肽则没有蛋白复合物峰，说明EGFR599-607多肽片段与HLA-A0201分子具有多肽结合力。
[0106]通过T2细胞结合实验和体外重折叠实验，可以看出本发明所述的EGFR599-607多 肽片段与HLA-A2分子具有很好的多肽结合力。
[0107]实施例3、昆虫杆状病毒表达系统表达热休克蛋白gp96
[0108] p F a s t B a c TM 1空载质粒购自普如汀生物技术（北京）有限公司，产品号 BioVectorl058 19-1〇
[0109] DH10Bac?E.coli(简写为DHlOBac)购自北京原平皓生物技术有限公司，产品号 CL108-01。
[0110] 出1'瓜口-0 56口1^1〇86:层析柱为出1'瓜口0册，购自6￡公司，产品号17-1153-01，层 析柱的内径和柱长是0 ? 7 X 2 ? 5cm。
[0111] Superdex 200 10/300GL:层析柱为Superdex 200 10/300GL，购自GE公司，产品号 17-5175-01，层析柱的内径和柱长是1 ? 0 X 3 ? 0cm。
[0112] 一、构建 pFastBac?l_gp96 质粒
[0113] l、gp96引物的设计与合成：以GenBank中人gp96基因的序列为模板，序列号为NM_ 003299,其基因序列如SEQ ID NO.8所示，其编码氨基酸序列如序列SEQ ID NO.9所示。在 gp96基因5 '端加入EcoR頂每切位点，3 '端加入Xbal酶切位点。用于PCR扩增的正向引物序列 GCTCTAGACTATTACAATTCATCTTTTTC-3'，委托上海生工生物工程技术服务公司合成该引物， 测序验证引物的序列正确无误。
[0114] 2、提取人肺癌细胞 A549 (ATGC?Number: CCL-185?)的总 mRNA，反转录合成 cDNA。
[0115] 3、以步骤1的cDNA为模板，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增目的基因。
[0116] 4、用EcoRI和Xbal双酶切gp96的PCR产物，回收酶切产物。
[0117] 5、用EcoRI和Xbal双酶切pFastBac?l空载质粒，回收酶切产物。
[0118] 6、将步骤4的酶切产物和步骤5的载体骨架连接，得到连接产物。
[0119] 7、将连接产物转化大肠杆菌DHlOBac感受态细胞(购自北京原平皓生物技术有限 公司，产品号CL108-01)，通过挑取单克隆获得重组大肠杆菌的质粒。用PCR验证阳性克隆， 用于PCR验证的pUC/M13正向引物序列为:5'-CCCAGTCACGACGITGTAAAACG-3'，反向引物序列 为:5 ' -AGCGGATAACAATITCACACAGG-3 ' 1CR产生了 一个含有目的序列的4.7-5kb扩增子随后 对其进行测序。测序结果验证正确的为阳性重组质粒。该阳性重组质粒是能表达杆状病毒 的质粒，在由DHlOBac自身含有的的辅助质粒的帮助下发生重组，重组后的质粒可以同时表 达杆状病毒和目的蛋白，通过观察病毒侵染情况可以部分反应目的蛋白的表达情况。
[0120] 二、利用昆虫细胞表达gp96重组蛋白
[0121] 提取阳性重组质粒，利用Cellfectin II reagent(Life technologies,货号： 10362-100)将阳性重组质粒转染到Sf9细胞(购自普如汀生物技术(北京)有限公司，产品号 NTCC411123)中。将转染阳性质粒的Sf9细胞培养72h，通过细胞病变情况表明含有重组的一 代杆状病毒(命名为P1毒)已经释放到培养基中，收取细胞上清获得P1毒。加适量P1毒到Sf9 单层细胞中，控制细胞浓度达到1X10 6细胞/mL，加入的P1量（mL)=M0I(pfu/Cell) X number of cells/titer of viral stock(pfu/mL)，其中M0I (multiplicity of infection)取0.05-0. l，titer of PI viral stock取lxl06-lxl07pfu/mL，之后在27°C条件 下培养72h，4000rpm离心5min，收取上清获得二代毒(命名为P2毒）。将适量P2毒加到lOOmL Sf9的悬浮细胞中，控制细胞浓度达到1.6 X 106细胞/mL，在27°C条件下100_120rpm培养 72h，扩增获得三代毒(命名为P3毒）。将P3毒进行westernblotting杂交，结果表明gp96蛋白 已经在Sf 9细胞中表达。
[0122] 随后，在新鲜的Sf 9细胞（1 ? 5 X 106细胞/mL，300mL)中加入适量P3毒，27 °C条件下 100_120rpm在Insect-XPRESS?Protein-free Insect Cells medium with L-Glutamine培 养基(Catalog N〇:12-730Q)中进行悬浮培养。感染72小时后，将悬浮液在7000rpm转速条件 下离心20分钟得到清澈的上清液，经过0.22mm滤膜滤过后，再经过HiTrap Q HP柱， Superdex 200 10/300GL离子柱纯化后得到较纯的gp96蛋白。gp96蛋白经变性聚丙稀酰胺 凝胶电泳鉴定。将上述收集的穿透用PBS缓冲液换液，浓缩，采用BCA法测定蛋白浓度，最后 将蛋白分装，贮存于-80 °C。
[0123] 上述中，HiTrap Q HP柱，Superdex 200 10/300GL离子柱纯化的具体方法为：
[0124] 1)将感染后收集的上清液进行HiTrap-Q Sepharose离子交换层析，具体包括如下 步骤：
[0125] (a)将上述步骤得到的上清液过滤后上样于层析柱，流速为lmL/min;
[0126] (b)用5mL PBS缓冲液洗涤步骤(a)的层析柱，流速为lmL/min，所述PBS缓冲液含有 20〇111]\1恥(：1，？85缓冲液的口11为7.5 ;
[0127] (c)用10mL的PBS缓冲液洗涤步骤(b)的层析柱，流速为lmL/min;所述roS缓冲液含 有30〇111]\1他(：1，？85缓冲液的口11为7.5 ;
[0128] (d)用3mL的PBS缓冲液洗涤步骤(c)的层析柱，流速为lmL/min，得到的洗脱液即为 含有gp96蛋白的提取物;所述PBS缓冲液含有600mM NaCl，PBS缓冲液的pH为7.5;
[0129] 2)将洗脱液进行Superdex 200 10/300GL分子筛层析，具体包括如下步骤：
[0130] (a)将HiTrap-Q Sepharose离子交换层析所得gp96蛋白提取物通过50Kd超滤管浓 缩，用pH为7.5的PBS换液，浓缩为终体积为lmL的浓缩液，所述浓缩液中含有gp96蛋白；
[0131 ] (b)通过上样环将步骤(a)的浓缩液(含gp96的lmL PBS溶液)上样于层析柱，流速 为0.25mL/min;
[0132] (c)用PBS缓冲液洗涤层析柱，流速为0.25mL/min，收取gp96蛋白；将（c)收集的 gp96蛋白用pH为7 ? 5的PBS缓冲液换液，浓缩，测定gp96蛋白浓度后分装、贮存。
[0133] 实施例4、多肽刺激HLA-2.1/Kb转基因鼠特异性CTL的产生
[0134] 利用实施例3中制备得到的昆虫细胞表达的gp96蛋白进行动物免疫。
[0135] 实施例中用于动物免疫的多肽购自吉尔生化(上海)有限公司，纯度为95%以上。
[0136] 实验组的动物免疫多肽为66?1?599-607多肽片段，其氨基酸序列如3￡〇10勵.2所 示;对照组的动物免疫多肽为乙肝病毒HBc82-90肽，其氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示。
[0137] 一、分组免疫
[0138] HLA-A2 ? 1/Kb转基因小鼠（购自Jackson laboratory)进行分组，每组10只，分别免 疫。
[0139] 第一次免疫多肽EGFR599-607多肽片段(50微克/只）、gp96蛋白（20微克/只）；第二 次免疫多肽EGFR599-607多肽片段（50微克/只）、gp96蛋白（20微克/只）；第三次免疫多肽 EGFR599-607多肽片段(50微克/只）、gp96蛋白（20微克/只）。对照组免疫相同剂量的gp96和 乙肝病毒ffi5c82 -90多妝。
[0140]进行蛋白免疫前，将用于免疫的gp96蛋白在组装体系中进行组装。组装体系的溶 剂为水，溶质及其浓度如下：NaCl 8g/L，KCl 0.2g/L，KH2P〇4〇.24g/L，Na2HP〇4. 12H20 3.63g/L;组装条件为55°C反应lOmin，之后室温放置30分钟。免疫方式为皮下注射，第一次 免疫时间为实验第一周、第二次免疫时间为实验第三周、第三次免疫时间为实验第四周。
[0141] 二、免疫相关因子的分析
[0142] 取小鼠脾细胞进行ELISP0T分析。（ELISP0T检测试剂盒购自BD公司，产品号 551083,操作方法见试剂盒产商说明书），实验结果见图3。与对照组几乎没有特异性IFN-y 分泌相比，实验组EGFR599-607多肽片段能引起很强的特异性IFN-y分泌，说明EGFR599-607多肽片段可以在小鼠体内激起较强的特异性T细胞免疫反应，有利于特异性杀伤肿瘤细 胞。
[0143] 实施例5、多肽免疫的抗肿瘤效果
[0144]对10例肺癌患者进行鉴定。取病人血液并通过BB7.2单克隆抗体(购自Abeam，货号 为ab27728)染色，流式检测，分析其细胞表面HLA-A2分子的表达。选择HLA-A2分子阳性表达 的患者进行追踪。待患者术后，取部分肿瘤组织做石蜡切片，通过免疫组化检测其EGFR表 达水平。选择其中EGFR强阳性的患者肿瘤组织进行裸鼠移植实验。
[0145] 本实施例中用于动物免疫的gp96蛋白是实施例3中制备得到的gp96蛋白。本实施 例中用于动物免疫的多肽均购自吉尔生化(上海)有限公司，纯度为95%以上。实验组的动 物免疫多肽为66?1?599-607多肽片段，其氨基酸序列如3￡〇10勵.2所示;对照组的动物免 疫多肽为乙肝病毒HBc82-90肽，其氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示。本实施例中用于转输的 脾脏淋巴细胞来源于实施例4中免疫后的小鼠。
[0146] 一、人肿瘤组织裸鼠移植
[0147] 取新鲜肿瘤组织置于无菌平皿内（平皿内放置少许生理盐水或细胞培养液），将肿 瘤组织剪成2-3mm的小块，接种于健康裸鼠前腋窝皮下。待移植的肿瘤生长至100-200mm3 时，挑选肿瘤生长均匀的小鼠平均分成两组，每组10只，转输脾脏淋巴细胞。
[0148] 二、免疫小鼠脾脏淋巴细胞的分离
[0149] 无菌环境中取脾脏，将脾脏放于200目筛网上，在10mL无血清1640培养基中用玻璃 研磨棒研磨，将液体转移到15mL离心管中，lOOOrpm条件下离心10分钟；弃上清，加入3mL红 细胞裂解液于室温裂解2-3分钟，加入10mL PBS缓冲液终止反应，颠倒混匀，1500rpm离心 10min;弃上清，用10mL无血清1640培养基(购自Gibco，货号为22400105)洗两遍，lOOOrpm离 心10分钟;弃上清，用5mL含体积分数10%的FBS(购自Hyclone)的无血清1640培养基重悬。 [0150] 三、淋巴细胞转输
[0151] 将细胞计数，并用PBS缓冲液清洗一遍，并用PBS缓冲液按lxl07/200yL的浓度重 悬;将200yL的细胞悬液慢速尾静脉注射至移植肿瘤的裸鼠体内。
[0152] 四、抗肿瘤效果评价
[0153]自初次免疫开始，每隔三天测量一次小鼠肿瘤大小，肿瘤大小按照0.5 X长X宽X 宽计算。
[0154] 实验组与对照组之间的比较结果见图4,与对照组相比，实验组的小鼠肿瘤大小在 转输淋巴细胞一周后开始下降，第3周时，实验组与对照组肿瘤大小对比如下，实验组VS对 照组=246±23 VS 364±37，P<0.01。说明EGFR599-607多肽片段具有显著的抗肿瘤能力。
[0155] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和 原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。 <110〉和泓（厦门）生物技术有限公司 <120〉一种人表皮生长因子受体的CTL表位多肽及其应用 <160>9 <210>1 <211 >1210 <212>PRT <213> 人(Homo sapiens) <220> <221 >人表皮生长因子受体蛋白 <400>1
[0156] Met Arg Pro Ser Gly Thr Ala Gly Ala Ala Leu Leu Ala Leu Leu Ala 1 5 10 15 Ala Leu Cys Pro Ala Ser Arg Ala Leu Glu Giu Lys Lys Val Cys Gin 20 25 30 Gly 丁hr Ser Asn Lys Leu Thr Gin Leu Gly Thr Phe Glu Asp His Phe 35 40 45 Leu Ser Leu Gin Arg Met Phe Asn Asn Cys Glu Val Val Leu Gly Asn 50 q 60 Leu Glu lie Thr Tyr Val Gin Arg Asn Tyr Asp Leu Ser Phe Leu Lys 65 70 75 80 Thr He Gin Glu Val Ala Gly Tyr Val Leu He Ala Leu Asn Thr Val 85 90 95 Gtu Arg lie Pro Leu GIu Asn Leu Gin Tie He Arg Gly Asn Met Tyr 100 105 110 Tyr Glu Asn Ser Tyr Ala Leu Ala Val Leu Ser 八sn TyrAsp 八laAsn ll5 l20 l25 Lys Thr Gly Leu Lys Glu Leu Pro Met Arg Asn Leu Gin Glu He Leu 130 135 HO nis Cily Ala Va丨 Arg Phe Ser Asn Asn Pi'o Ala Leu Cys Asn Val (Tlu 145 150 155 160 Ser He Gin Tip Arg Asp He Val Ser Ser Asp Phe Leu Ser Asn Met 165 170 175 Ser Mel Asp Phe Gin Asn His Leu Gly Ser Cys Gin Lys Cys Asp Pro 180 185 190
[0157] Ser Cys Pro Asn Giy Ser Cys Trp Gly Ala Gly Glu Glu Asn Cys Gin 195 200 205 Lys Leu Thr Lys lie He Cys A!a Gin Gin Cys Ser Gly Arg Cys Arg 210 215 220 Gly Lys Ser Pro Ser Asp Cys Cys His Asn Gin Cys Ala Ala Gly Cys 225 230 235 240 Thr Gly Pro Arg Glu Ser Asp Cys Leu Val Cys Arg Lys Phe Arg Asp 245 250 二M Glu Ala Thr Cys Lys Asp Thr Cys Pro Pro Leu Mel Leu Tyr Asn Pro 260 265 270 Thr Thr Tyr Gin Met Asp Val Asn Pro Glu Gly Lys Tyr Ser Phe Gly 275 2S0 285 Ala Thr Cys Val Lys Lys Cys Pro Arg Asn Tyr Val Val Thr Asp His 290 295 300 Gly Ser Cys Val Arg Ala Cys Gly Aia Asp Ser Tyr Glu Met Glu GIu 305 310 315 320 Asp Gly Val Arg Lvs Cys Lys Lys C'ys Glu Cfly Pro Cys Arg Lys Val 325 330 335 Cys Asn Gly lie Gly lie Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser He Asn 340 345 150 Ala. Thr Asn lie Lys. His'Phe Lys Asn Cys: Thr Ser lie Ser Gly .Asp. 355 360 36^ Leu. His lie: Leu Pro: Val Ala Phe Arg:Gly Asp' S:er .Phe Thr 扭s Tlir 370 375 380 Pro Pro Leu Asp Pro Gin Olu Leu Asp lie Leu lys Thr Val Lys Glu
[0158] 385 糾 0 395 400 lie Thr Gly Phe Leu Leu He Gin Ala Tip Pro Glu Asn Arg Thr Asp 405 410 4 b Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu lie He Arg Gly Arg Thr Lys Gin 420 425 430 His Gly Gin Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn He Thr Ser Leu 435 440 445 Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu lie Ser Asp Gly Asp Val lie lie Ser 450 455 460 Gly Asn Lys Asn Leu Cvs Tyr Ala Asn Thr He Asn Trp L.ys Lvs Leu 465 470 475 480 Phe Gly Thr Ser Gly Gin Lys Thr Lys He He Ser Asn Arg Gly Glu 4S5 490 495 Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gin Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro 500 505 MO Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn 515 520 525 Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly 530 535 540 Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys lie Gin Cys His Pro 545 550 555 560 Glu Cys Leu Pro Gin Ala Mel Asn lie Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro 565 570 575 Asp Asn Cys lie Gin Cys Ala His Tyr [le Asp Gly Pro His Cys Val 580 585 590
[0159] Lys Thr Cys Pro Ala Cily Val Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp 595 600 605 Lys Tyr Ala Asp Ala Gly 1 lis Val Cys I lis Leu Cys 1 lis Pro Asn Cys 610 615 620 Thr Tyr Glv Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly 625 630 635 640 Pro Lys lie Pro Ser lie Ala Thr Gly N4et Val Gly Ala Leu Leu Leu 645 650 655 Leu Leu Val Val Ala Leu Gly lie Gly Leu Phe Met Arg Arg Arg His 660 665 670 lie Val Arg Lys Arg Thr Leu Arg Arg Leu Leu Gin Glu Arg Glu Leu 675 680 685 Val Glu Pro Leu Thr Pro Ser Gly Glu Ala Pro Asn Gin Ala Leu Leu 690 695 700 Arg He Leu Lys Glu Thr Glu Phe Lys Lys lie Lys Val Leu Gly Ser 7:05 710 715 720 Gly Ala Phe Gly Thr Val Tyr L>.s Gly Leu Tip lie Pro Glu Gly Glu 725 730 735 Lys Val Lys lie Pro Val Ala lie Lys Glu Leu Arg Glu Ala Thr Ser 740 745 750 Pro Lys Ala Asn Lys Glu lie Leu Asp Glu Ala Tyi Val Met Ala Ser 75t> 760 765 ￥al Asp Asn Pro His Val Gys Arg Leu Leu Gly lie Cys Leu Thr Ser 770 775 780 Tlvr Val Gin Leu Tie Thr Gin Leu Met Pro Phe Gly Cys Leu Leu Asp [0160] 785 790 795 800 Tyr Val Arg Glu His Lys Asp Asn He Gly Ser Gin Tyr Leu Leu Asn 805 810 815 Trp Cys Val Gin He Ala Lys Gly Met Asn Tyr Leu Glu Asp Arg Arg 820 825 830 Leu Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Val Leu Val Lys Thr Pro 835 840 845 Gin His V^I Lys ile Thr Asp Phe Gly Leu Ala Lys Leu Leu Gly Ala 850 855 8前 Glu Glu Lys Glu Tyr His Ala Glu Gly Gly Lys Val Pro lie Lys Trp 865 870 875 880 Met Ala Leu Glu Ser lie Leu His Arg lie Tyr Thr His Gin Ser Asp S?5 890 895 Val Trp Ser T>r Gly Thr Trp Glu Leu Met 丁hr Phe C% Ser 900 90d 910 Lys Pro Tyr Asp Gly lie Pro Ala Ser Glu lie Ser Ser lie Leu Glu 915 920 925 Lys Gly Glu Arg Leu Pro Gin Pro Pro lie Cys Thr lie Asp Val Tyr 930 935 940 Met fie Met Val L.ys Cys Trp Met lie Asp Ala Asp Ser Arg Pro I.ys 945 950 955 960 Phe Arg Glu Leu lie lie Glu Phe Ser Lys Met Ala Arg Asp Pro Gin 965 970 975 Arg Tyr Leu Val He Gin Gly Asp Glu Arg Mel His Leu Pro Ser Pro 980 985 990
[0161 ] Thr Asp Ser Asn Phe Tyr Arg Ala Leu Met Asp Glu Glu Asp Met Asp 995 1000 1005 Asp Val Val Asp Ala Asp Glu Tyr Leu He Pro G!n Gin Gly Phe 1010 1015 1020 Phe Ser Ser Pro Ser Thr Ser Arg Tlir Pro Leu Leu Ser Ser Leu 1025 1030 1035 S er Ala Thr Ser Asn Asn Ser Thr Val Ala Cys lie A$p Arg Asn 1040 1045 1050 Gly Leu Gin Ser Cys Pro He Lys Glu Asp Ser Phe Leu Gin Arg 105S 1U6U 106; Tyr Ser Ser Asp Pro Thr Gly Ala Leu Thr Glu Asp Ser He Asp 1070 1075 1080 Asp Thr Phe Leu Pro Val Pro Glu Tyr lie Asn Gin Ser Val Pro 10B5 1090 1095 Lys Arg Pro Ala Gly Sei，Val Gin Asn Pro Val Tyi* His Asn Gin 1100 110^ mo Pro Leu Asn Pro Ala Pro Ser Arg Asp FJro His Tyr Gin Asp Pro 1115 1120 1125 His Scr Thr Ala Val Gly Asn Pro Glu Tyr Leu Asn Thr Val Gin 1130 1135 1140 Pro Thr Cys Val Asn S:er 丁hr Phe Asp Ser Pr? Ala His Tip Ala 1145 11 Mi 1155 Gin Lys Gly Ser His Gin He Ser Leu Asp Asn Pro Asp Tyr Gin 1160 1165 1170 Gin Asp Phe Phe Pro Lys Glu Ala Lys Pro Asn Gly He Phe Lys
[0162] 1175 1180 118， Gly Ser Thr Ala Glu Asn Ala Glu Tyr Leu Arg Val Ala Pro Gin 1190 1195 1200 Ser Ser Glu Phe He Gly Ala 1205 1210 <21Q>2 <211>9 <212>PRT 〈213>人工序列 <220> <221>EGFR599-607 多肽片段 <400>2
[0163] Val Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val 9 <210>3 <211>9 <212> PRT <213>人工序列 <220〉 <221 >乙肝病豢HBc82-90肽 <400>3 Arg G-ki Leu Va丄 Val. Ser Tyr Val Asn 9 <210>4 <211>825 <212>DNA <213>人(Homo sapiens) <220> <221〉HLA-A2 的重链 <400>4
[0164]
8:25 <210>5 <211>275 <212>PRT <213>.人（Homo sapiens) <220〉 <221> HLA-A2 的重链 <400>5 Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Phe Thr Ser Val Ser Arg Pro Gly 1 5 10 15 Arg Gly Glu Pro Arg Phe lie Ala Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gin 20 25 30 Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser Gin Arg Met Glu Pro Arg 35 40 45 Ala Pro Trp lie Glu Gin Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Asp Gly Glu Thr 50 .5.5. 60 Arg Lys Vfd Lys Ala His Ser Gin Thr His Arg Val Asp Leu Gly Thi' 65 70 75 80 Leu Arg Gly 7'vr Tyr Asn Gin Ser Glu Ala Gly Ser His Thr Val Gin 85 90 95 Arg Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly Ser Asp Trp Arg Phe Leu Arg Gly 100 105 110 Tyr His Gin Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr lie Ala Leu Lys Glu 115 120 125 Asp LeuArgSer Trp. Thr Ala A-la Asp Met A.]a Ala Gin Thr 丁 hr .Lys 130 135 140 His Lvs Trp Glu Ala Ala His ValAla Glu <31n Leu Arg Ala rT'yr Leu 145 155 160 Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys 165 170 175 Glu Thr I.eu Gin Arg Tlir Asp Ala Pro Lys Thr His Met Thr His His 180 185 190 Ala Val Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Ser Phe 195 200 205 Tyi' Pro Ala Glu lie Thr Leu Thr Trp Gin Arg Asp Gly Glu Asp Gin 210 215 220
[0165] Thr Gin Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr 225 230 235 240 Phe (.iln Lys Trp Ala Al.a. Val Val Val Pro Ser Gly Gin Glu (_Hn Arg 245 250 255 Tyr Thr Cys His Val Ci!n His Glu Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr Leu 260 26^ 270 Arg Trp Glu 275 <210>6 <211>297 <212>DNA <213>A(Homo sapiens) <220>
[0166] <221>HU-A2 的轻链 <400>6
<210>7 <211>100 <212> PRT <213>A (Homo sap i ens) <220> <221〉HLA-A2 的轻链 <4QG>7 Met He Gla Arg Tfer Pro Lys lie Gin Val Tyr Ser Arg His Pro Ala 1 5 10 15 GIu Asn Glv Lys Ser Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Vkl Ser Gly Phe His 20 25 30 FJro Ser Asp Ife Glu Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly GIu Arg He Glu 35 40 45 Lys Val Glu Ilis Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Ti*p Ser Phe Tyr 50 55 60 Leu Leu Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp Glu Tyr Ala 65 70 75 Cys Arg Val Asn ] lis Val Thr Leu Ser Gin Pro Lys lie Val Lys Trp 80 85 90 95
[0167] Asp iVrg Asp Met 100 <210>8 <211>2349 <212>DNA <213>A (Homo sapiens) <220〉 <221〉gp96 蛋白 <400>8
<210>9 <211>803 <212>PRT
[0168] .<21.3>人(Homo .sapiens.) <22Q> <221〉gp96 蛋白 <400>9 Met Arg Ala Leu Trp Val Leu Oly Leu Cys Cys Val Leu Leu Thr Phe 1 5 10 15 Gly Ser Val Arg Ala Asp Asp Glu Val Asp Val Asp Gly Thr Val Glu 20 .25 ^0 Glu Asp Leu Gly Lys Ser Arg Glu Gly Ser Arg Thr Asp Asp Glu Val 35 40 45 ￥al Glu Arg Glu Glu Glu Ala lie Gin Leu Asp Gly Leu Asn Ala Ser 50 55 60 Gin lie Arg Glu Leu Arg Glu Lys Ser Glu Lys Phe Ala Phe Gin Ala 65 70 75 80 Glu Val Asn Arg Met Met Lys Leu lie lie Asn Ser Leu Tyr Lys Asn 85 90 95 Lys Glu He Phe Leu Arg Glu Leu He Ser Asn Ala Ser Asp Ala Leu 100 105 110 Asp Lys lie Arg Leu lie Sei' Le.u Thr Asp Glu Asn Ala Leu S.er Oly 115 120 125 Asn Glu Glu Leu Thr Val Lys lie Lys Cys Asp Lys Glu Lys Asn Leu 130 135 140 Leu His Val Thr Asp Thr Gly Val Gly Met Thr Arg Glu Glu Leu Val 145 150 155 160 Lys Asn Leu Gly Thr lie Al.a Lys Ser Gly Thr .Se-rGlu.. Phe Leu Asn [0169] 165 170 175 Lys Met Thr Glu Ala Gin Glu Asp Gly Gin Ser Thr Ser Glu Leu lie 180 185 190 Gly Gin Phe Gly Val Gly Phe Tyr Ser Ala Phe Leu Val Ala Asp Lys 195 200 205 Val He Val Thr Ser Lys His Asn Asn Asp Thr Gin His He Tip Glu 210 215 220 Ser Asp Ser Asn Glu Phe Ser Val lie Ala 八sp Pro 八rg Gly 八sn Thr 225 230 235 240 l.eu Gly Arg Gly Thr Thr He Thr Leu Val Leu Lys Glu Glu Ala Ser 245 250 255 Asp Tyr Leu Glu Leu Asp Thr lie Lys Asn Leu Val Lys Lys Tyr Ser 2 翻 265 270 Gin Phe He Asn Phe Pro lie Tyi* Val Trp Ser Ser Lys Thr Glu Thr 275 280 2:85 Val Glu Glu Pro Met Glu Olu Glu Glu Ala Ala Lys Glu Glu Lys Glu 290 295 300 Glu Ser Asp Asp Glu Ala Ala Val Glu Glu Glu Glu Glu Glu Lys Lys 305 310 315 320 Pro L.ys Thr Lys Lys Val Glu Lys Thr Val Tip Asp Tip Glu L,eu Met 325 330 335 Asn Asp He Lys Pro lie Trp Gin Arg Pro Ser Lys Glu Val Glu Glu 340 345 350 Asp Glu Tyr Lys Ala Phe Tyr Lys Ser Phe Ser Lys Glu Ser Asp Asp 355 360 365
[0170] Pro Met Ala Tyr He Ilis Phe Thr Ala Glu Gly Glu Val Thr Phe Lys 370 375 380 Ser He Leu Phe Val Pro Thr Ser Ala Pro Arg Gly Leu Phe Asp Glu 385 390 395 400 Tyr Gly Ser Lys Lys Ser Asp Tyr He Lys Leu Tyi' Val Arg Arg Val 405 410 41S Phe lie Thr Asp Asp Phe His Asp Met Met Pro Lys Tyr Leu Asa Phe 420 425 430 Val Lys Gly Val Val Asp Ser Asp Asp Leu Pro Leu Asn Val Ser Arg 435 440 445 Glu Thr Leu Gin Gin His Lys Leu Leu Lys Val lie Arg Lys Lys Leu 450 45S 460 Val Arg Lys Thr Leu Asp Met lie Lys Lys lie Ala Asp Asp Lys Tyr 465 470 475 480 Asn Asp Thr Phe Trp Lys Glu Phe Giy T'hr Asn He Lvs Leu Gly Val 485 490 495 He Glu Asp His Ser Asn Arg Thr Arg Leu Ala Lys Leu Leu Arg FJhe 500 505 510 Gin Ser Scr His His Pro Thr Asp He Thr Ser Leu Asp Gin Tyr Val 515 520 525 Glu Arg Met Lys Glu Lys Gin Asp Lys lie T3T Phe Met Ala Gly Ser ^30 53d 540 Ser 八rg Lys Glu.Ala Glu .S.er Ser Pr.o Phe Val Glu.Arg Leu Leu Lys 545 550 555 560 Lys Gly Tyr Glu V^l He Tyr Leu Thr Glu Pro Val Asp Glu Tyi C> s [0171] 565 570 575 He Gin Ala Leu Pro Glu Phe Asp Gly Lys Arg Phe Gin Asn Val Ala 580 5S5 590 Lys Glu Gly Val Lys Phe Asp Glu Ser Glu Lys Thr Lys Glu Ser Arg 595 600 605 Glu Ala Val Glu Lys Glu Phe Glu Pro Leu Leu Asn Tip Met Lys Asp 610 615 620 Lys Aia Leu Lys Asp Lys lie Glu Lys A!a Val Val Ser Gin Arg Leu 625 630 635 640 Thr Glu Ser Pro Cys Ala Leu Val A1h Ser Gin Tyr Gly Trp Ser Gly 645 650 655 Asn Met G!u Arg lie Met Lys Ala Gin Ala Tyr Gin Thr Gly Lys Asp 660 665 670 lie Ser Thi A,sn Tyr Tyr Ala Ser Gin Lys Lys Thr Phe Glu lie Asn 67) 680 685 Pro Arg His Pro Leu lie Arg Asp Met Leu Arg Arg lie Lys Glu Asp 690 695 WO Glu Asp Asp Lys Thr Val Leu Asp Leu Ala Val Val Leu Phe Glu Thr 705 710 715 720 Ala Thr Leu Arg Ser Glv Tyf Leu Leu Pro Asp Thr Lys Ala Tyr Gly 725 730 735 Asp Arg lie Glu Arg Met Leu Arg Leu Ser Leu Asn He Asp Pro A.sp
[0172] 〇 740 745 750 Ala Lys Val Glu Glu Glu Pro Glu Glu Glu Pro Glu Glu Thr Ala Glu 755 760 765 Asp Thr Thr Glu Asp Thr Glu Gin Asp Glu Asp Glu Glu Met Asp Val 770 775 780 Glv Thr Asp Glu Glu Glu Glu Thr Ala Lvs Glu Ser Thr Ala Glu Lys 785 790 800 Asp Glu Leu 803
【主权项】
1. 一种人表皮生长因子受体的CTL表位多肽，其特征在于，该多肽具有SEQ ID NO. 2所 示的氨基酸序列;或 该多肽具有在SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列基础上取代、缺失、置换、插入和/或添加 一个至几个氨基酸的衍生序列。2. -种人表皮生长因子受体的CTL表位多肽的编码基因，其特征在于，编码权利要求1 所述的人表皮生长因子受体的CTL表位多肽。3. -种重组载体，其特征在于，所述重组载体克隆、分泌和/或表达权利要求1所述的人 表皮生长因子受体的CTL表位多肽。4. 一种转化体，其特征在于，包括权利要求3所述的重组载体。5. -种权利要求1所述的人表皮生长因子受体的CTL表位多肽在肿瘤治疗中的应用。6. -种疫苗，其特征在于，包括权利要求1所述的人表皮生长因子受体的CTL表位多肽 和佐剂。7. 根据权利要求6所述的疫苗，其特征在于，所述佐剂包括gp96蛋白。8. 根据权利要求7所述的疫苗，其特征在于，所述gp96蛋白为采用昆虫细胞表达系统表 达分泌型的gp96蛋白。9. 根据权利要求8所述的疫苗，其特征在于，所述gp96蛋白通过昆虫杆状病毒感染的昆 虫细胞分泌表达。10. 根据权利要求7所述的疫苗，其特征在于，所述gp96蛋白和人表皮生长因子受体的 CTL表位多肽的质量比为1:(0.5-10)。11. 根据权利要求7-10任一项所述的疫苗，其特征在于，所述gp96蛋白包括SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列；和/或所述gp96蛋白的编码基因包括SEQ ID NO.8所示的核苷酸序 列。12. -种权利要求7-11任一项所述gp96蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： 利用昆虫细胞分泌表达gp96蛋白，昆虫细胞培养上清依次进行HiTrap Q HP阴离子交换柱 和Superdex 200 10/300GL分子筛层析得到的。13. 根据权利要求12所述一种gp96蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下具体步骤： 1) 利用昆虫杆状病毒感染的昆虫细胞分泌表达gp96蛋白：构建含有gp96蛋白的表达载 体和转化子;所述转化子为转染有gp96蛋白的表达载体的细胞； 2) 将杆状病毒侵染转化子后，进行悬浮培养，培养温度为27°C，培养时的转速为100-120rpm/min，培养结束后，收集上清液； 3) 将上清液进行HiTrap-Q Sepharose离子交换层析，具体包括如下步骤： (a) 将步骤2)得到的上清液上样于层析柱，流速为lmL/min; (b) 用5mL PBS缓冲液洗涤步骤（a)的层析柱，流速为lmL/min，所述PBS缓冲液含有 20〇111]\1恥(：1，？85缓冲液的口!1为7.5 ; (c) 用10mL的PBS缓冲液洗涤步骤(b)的层析柱，流速为lmL/min;所述PBS缓冲液含有 30〇111]\1恥(：1，？85缓冲液的口!1为7.5 ; (d) 用3mL的PBS缓冲液洗涤步骤(c)的层析柱，流速为lmL/mi n，得到的洗脱液即为含 有gp96蛋白的提取物;所述PBS缓冲液含有600mM NaCl，PBS缓冲液的pH为7.5; 4) 将洗脱液进行Superdex 200 10/300GL分子筛层析，具体包括如下步骤： (a) 将HiTrap-Q Sepharose离子交换层析所得gp96蛋白提取物通过50Kd超滤管浓缩， 用pH为7.5的PBS换液，浓缩终体积为lmL的浓缩液，所述浓缩液含有gp96蛋白； (b) 通过上样环将上述步骤(a)的浓缩液上样于层析柱，流速为0.25mL/min; (c) 用PBS缓冲液洗涤层析柱，流速为0.25mL/min，收取gp96蛋白；将收集的gp96蛋白用 pH为7.5的PBS缓冲液换液，浓缩，测定gp96蛋白浓度后分装、贮存。
【文档编号】C12N15/12GK105820234SQ201610281155
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2016年4月29日
【发明人】孟颂东, 王刚, 李鑫
【申请人】和泓（厦门）生物技术有限公司