一种IbGI蛋白、编码基因、重组载体与应用及其培育转基因植物的方法
【专利摘要】本发明公开了一种IbGI蛋白、编码基因、重组载体与应用及其培育转基因植物的方法。该IbGI蛋白为SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；IbGI蛋白的编码基因是SEQ ID NO：1所示的DNA分子；含有所述编码基因的重组载体为将SEQ ID NO：1所示的DNA分子插入到pGWB5的两个attR位点之间得到的重组载体。本发明的IbGI蛋白及其编码基因和重组载体可调控植物开花过程，将编码IbGI蛋白的DNA分子导入目的植物，可得到提前开花的转基因植物。本发明提供的IbGI蛋白及其编码基因在提高植物开花与结实率方面具有重要的理论意义与应用价值，为转基因植物的培育奠定了基础。
【专利说明】
一种I bG I蛋白、编码基因、重组载体与应用及其培育转基因植 物的方法
技术领域
[0001] 本发明属于基因工程领域，具体涉及一种与植物开花相关蛋白、编码基因、重组载 体与应用，还具体涉及一种培育转基因植物的方法。
【背景技术】
[0002] 虽然植物的生命周期长短不一，但是它们基本上都有着相同的生长阶段，主要包 括胚胎期、营养生长期和生殖生长期。而植物开花则是由营养生长向生殖生长的过度，它是 一个非常重要的时期，决定着植物生长发育进程的快慢，而且对植物生物量的积累和农作 物产量的高低起着至关重要的作用。植物的开花受多种因素的影响，包括植株营养状态、环 境温度和光周期等，而植株正是通过调节体内的一系列基因的表达变化来感知这些因素变 化的影响。因此，认识植物开花调控的分子机制，进而通过遗传改良的方法调控植物的开花 期，已成为当前分子生物学及农业科学家们研究的重点和热点。
[0003] 现今，通过分子生物学技术，开展植物开花相关功能基因的挖掘工作，对我们培育 高产作物新品种具有重要的应用价值。
【发明内容】
[0004] 本发明的第一个目的是提供一种IbGI蛋白。
[0005]为实现上述目的，本发明所提供的IbGI蛋白，来源于甘薯（Ipomoea batatas)，为 如下（1)或(2)的蛋白质：
[0006] (l)SEQ ID N0:2所不的氣基酸序列组成的蛋白质；
[0007] (2)SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨 基酸残基且与植物开花相关的由（1)衍生的蛋白质。
[0008] 序列表中SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列由1166个氨基酸残基组成，所述一个或 几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十个氨基酸残基的取代和/或缺失 和/或添加。
[0009] 本发明的第二个目的是提供编码所述IbGI蛋白的基因。
[0010] 为实现上述目的，本发明所提供的IbGI蛋白的编码基因，是如下（1)-(3)中任何一 种DNA分子：
[0011] (l)SEQ ID N0:1 所示的DNA分子；
[0012] (2)在严格条件下与（1)限定的DNA分子杂交且编码植物开花相关蛋白的DNA分子；
[0013] (3)与（1)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有 85%、至少具有90 %、至少具有95 %、至少具有96 %、至少具有97 %、至少具有98 %或至少具 有99 %同源性且编码植物开花相关蛋白的DNA分子。
[0014] 所述严格条件为：50°C，在7%SDS、0.5M Na3P〇4和ImM EDTA的混合溶液中杂交，在 65°(：，0.1\33(：，0.1%303中漂洗;也可为：用6\33(：，0.5%303的溶液，在65°(：下杂交，然后 用 2XSSC，0.1%SDS 和 1XSSC，0.1% SDS 各洗膜一次。
[0015]其中，序列SEQ ID N0:1的长度为3501bp，其开发阅读框(ORF)为来自5'末端第1位 至第3501位碱基，其编码氨基酸序列是序列表中SEQ ID NO:2所示的蛋白。
[0016]本发明的第三个目的是提供含有所述IbGI蛋白的编码基因的重组载体。
[0017] 本发明提供的重组载体为将SEQ ID N0:1所示的DNA分子插入到pGWB5的两个attR 位点之间得到的重组载体。
[0018]本发明的第四个目的是提供所述IbGI蛋白、编码基因和含有所述编码基因的重组 载体在调控植物开花过程中的应用。
[0019] 所述植物为长日照植物拟南芥(Arabidopsis thaliana);所述调控植物开花过程 为控制植物开花时间和开花数量;所述开花时间具体为统计植物抽薹时莲座叶数量体现， 所述开花数量具体由检测成花基因FT(Flowering locus T)表达量体现。
[0020] 本发明的第五个目的是提供所述IbGI蛋白、编码基因和含有所述编码基因的重组 载体在培育转基因植物中的应用。具体的，所述转基因植物具有如下性状:抽薹开花时间提 前;所述植物为长日照植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)。
[0021] 本发明的第六个目的是提供一种培育提前开花的转基因植物的方法。
[0022]本发明所提供的培育转基因植物的方法，为将编码上述IbGI蛋白的DNA分子导入 目的植物，获得转基因植物，所述转基因植物比目的植物提前开花。
[0023] 上述方法中，所述编码上述IbGI蛋白的DNA分子通过上述的重组载体导入目的植 物。
[0024] 上述方法中，所述目的植物为gi-2突变体拟南芥。
[0025] 本发明提供了一种IbGI蛋白及其编码基因，将该基因导入拟南芥gi-2突变体中， 得到了转IbGI拟南芥植株，结果证明IbGI能够恢复拟南芥gi-2突变体表型，使其正常开花 结实。说明IbGI蛋白及其编码基因在植物开花过程中起着重要的作用。本发明提供的IbGI 蛋白及其编码基因在提高植物开花与结实率方面具有重要的理论意义与应用价值。
【附图说明】
[0026] 图1为转IbGI拟南芥植株的PCR检测结果图；
[0027]图2为转IbGI拟南芥开花变化结果图；
[0028] 图3为FT基因相对表达量差异图。
【具体实施方式】
[0029]下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细描述。
[0030] 下述实施例中所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0031] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。实施例1 与甘薯开花相关蛋白IbGI及其编码基因的获得
[0032]实验材料:将甘薯品种Sinhwangmi(由韩国生命工学研究院赠予）在苗床催芽，待 生长约30天后取1-2片新鲜叶片，液氮速冻，-80°C保存。
[0033] 1、叶片总RNA提取与纯化
[0034] RNA提取所用溶液、器皿等均经过DEPC水的特殊处理，其操作严格按照《分子克隆 实验指南(第二版)》(2005-3-l，J.萨姆布鲁克等，科学出版社)有关RNA操作的要求进行，严 防RNase污染。
[0035] 采用美国GIBIC0L公司生产的Trizol试剂进行总RNA的提取，具体步骤如下：
[0036] 1)取甘薯品种Sinhwangmi叶片约0 ? 3g;
[0037] 2)用液氮研磨，将磨好的样品转入1 .5ml离心管，并且以每0. lg样品对应 lmlTrizol的比例加Trizol试剂，振荡混勾，室温放置5min左右，4°C，12000Xg离心10min;
[OO38] 3)取上清至RNase-free的离心管中，加入氯仿(Trizol试剂的1/5体积），剧烈震荡 15s，室温放置2-3min，4°C，12000 X g离心 lOmin;
[0039] 4)取上清，加入异丙醇（每mLTrizol试剂对应0.5mL异丙醇)并混匀，室温放置15-30min左右，4°C，12000 X g离心10-15min，得白色片状RNA沉淀；
[0040] 5)加入75%乙醇U TRIzoL试剂的1倍体积），漂洗1次，4°C，7400Xg离心5min。
[0041 ]倒掉酒精，在超净工作台上干燥RNA 15-30min，具体时间视RNA量而定。用适量的 RNase-free Water或灭菌的DEPC水溶解RNA。取6yl用于电泳检测，取4yl用于浓度测定，剩 余的于-80°C保存备用。用紫外分光光度计检测RNA的质量(0D 26Q)和纯度(0D26Q/0D28Q);并用 1.2 %变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。
[0042] 2、cDNA第一链的合成
[0043] 将提取的总RNA，通过First-Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒(T0Y0B0)分别反 转录成First-strand cDNA，具体步骤如下：
[0044] 1)取总RNAlyg于PCR管中，然后加入5yl的01igo(dT)20(10yM)，用RNase-Free H20 补足至12yl;
[0045] 2)在水浴锅中65 °C反应5min后，立即置于冰上；
[0046] 3)轻微离心，然后加入以下试剂：4yl 5XRT Buffer，2yl dNTP mix(10mM)，lyl RNase Inhibitor(10U/lil)，llil ReverTra Ace，加RNase-Free H2O定容至总体积为20lil;
[0047] 4)混勾后轻微离心，在PCR仪中42°C温浴20min，90°C反应5min终止First-strand cDNA synthesis；
[0048] 5)取4yl至0.2ml离心管中，并稀释10倍用于后续实验或放置-20°C保存。
[0049] 3、IbGI蛋白的cDNA编码序列克隆
[0050] 根据甘薯转录组测序的结果，通过同源序列比对找到IbGI蛋白的cDNA序列，并设 计正向引物1和反向引物2进行IbGI蛋白cDNA编码序列克隆。引物序列如下：
[0051] 引物1:5'-ATGGCTGCTTCATGTGAAA-3'（SEQ ID N0:3)
[0052]
[0053]以步骤2中准备好的cDNA为模板，用正向引物1和反向引物2进行PCR反应。
[0054] PCR 反应体系如下：lXPrimeSTAR buffer(Mg2+plus)，0.2mM dNTPs，1.0U PrimeSTAR HS DNA聚合酶(三者均购自大连TAKARA公司），100ng cDNA，正、反向引物各0.45 yM，ddH20 补充至终体积 50yl。热循环参数为：94°C3min;94°C30s，55°C30s，72°C2min，35f 循环;72°C5min，l个循环;4°C保存，反应是在PTC-225PCR仪上完成。扩增产物在水平电泳槽 上1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，获得3501bp长度的扩增片段。
[0055] 经过测序，该PCR产物具有SEQ ID NO: 1所示的核苷酸，该序列所示的基因的编码 区为序列表中SEQ ID N0:1自5'端第1-3501位核苷酸；序列表中SEQ ID N0:1由3501个碱基 组成；该基因编码的蛋白命名为IbGI，该蛋白的氨基酸序列为序列表中的SEQ ID N0:2;序 列表中SEQ ID NO:2由1166个氨基酸残基组成。
[0056]实施例2IbGI蛋白在调控植物开花过程中的应用 [0057] 一、转IbGI拟南芥的获得 [0058] 1、植物表达载体的构建
[0059]根据甘薯IbGI蛋白cDNA的编码序列和构建载体用的gateway技术，设计扩增出完 整编码序列的引物序列，并正反向引物分别引入一段含有attBl和attB2位点的接头序列， 具体引物序列如下：
[0060]引物3:5' -ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcATGGCTGCTTCATGTGAAA-3'（SEQ ID NO:5)(小写字母为接头序列，下划线部分为attBl位点）
[0061 ]引物4:5' -ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcCACAGATATAGTGCAGCCTAAT-3' (SEQ ID NO:6)(小写字母为接头序列，下划线部分为attB2位点）
[0062] 以人工合成的SEQ ID N0:1所示的DNA分子为模板(或以Sinhwangmi叶片cDNA为模 板)进行PCR扩增，得到3562bp的PCR产物，将产物通过BP反应克隆到gateway的入门载体 pD0NR221(购自Life Technologies生物技术公司，产品目录号为12535-019)中，命名为 PD0NR221: IbGI载体，进行测序，保证甘薯IbGI蛋白cDNA的阅读框正确。
[0063] 将载体pD0NR221:IbGI与植物表达载体pGWB5(由韩国生命工学研究院赠予)进行 LR反应，得到重组载体pGWB5: IbGI，即为植物表达载体。
[0064] 将上述重组载体pGWB5: IbGI转化大肠杆菌感受态细胞Trans-Tl (购自北京全式金 生物技术有限公司，产品目录号为⑶501)，37°C培养16h，对重组载体pGWB5: IbGI进行PCR扩 增鉴定并进行测序验证。测序结果表明，重组载体PGWB5: IbGI为将序列表中SEQ ID NO: 1自 5'端第1位-第3501位所示核苷酸插入pGWB5的两个attR位点之间得到的载体。
[0065] 2、植物表达载体转化农杆菌
[0066] 1)从_80°C低温冰箱中取出100yl的GV3101感受态细胞(购自上海唯地生物技术有 限公司），置于冰上融化，加入lyg上述步骤1得到的植物表达载体pGWB5:IbGI，混匀；
[0067] 2)液氮冷冻 5min，37°C 温育 5min;
[0068] 3)加入1000y 1的LB液体培养基，28 °C培养4h;
[0069] 4)取200yl菌液于含有抗生素（100μg/ml利福平(Rif)、50μg/ml卡那霉素(Kan))的 LB固体培养基上涂布均匀，于28 °C暗培养2天；
[0070] 5)挑取单菌落并进行PCR鉴定(鉴定引物为引物1和引物2,得到3501bp片段的为阳 性)；
[0071] 6)将阳性单菌落接种含有100μg/ml Rif和50μg/ml Kan的LB液体培养基中，28°C 培养至0D值达到1.0,即得到了可用于后续转化工作的农杆菌液。
[0072] 3、转IbGI拟南芥的获得
[0073] 1)转化
[0074]用农杆菌介导的方法将IbGI cDNA的编码序列导入到拟南芥GI缺失突变体材料 gi-2中，具体方法如下：
[0075]①将步骤2中准备好的农杆菌液离心后，加入1倍体积含有10mM MgCl2、5 %蔗糖、 0.02 % s i lwet L-77表面活性剂的悬浮溶液；
[0076]②将农杆菌悬浮液倒入50mL离心管中，将拟南芥横放使花序浸入离心管悬浮液中 浸染l〇s，轻微晃动离心管；
[0077]③用塑料膜包裹植株，并让浸染后的植株保持黑暗条件下高湿度24h;
[0078]④次日去掉包裹的塑料，将浸染后的拟南芥放回温室，正常生长1个月后，得到To 代转IbGI拟南芥；
[0079] 采用同样的方法将空载pGWB5转入gi-2拟南芥突变体中，得到转空载体拟南芥。
[0080] 2)分子鉴定
[0081] 用传统CTAB法提取To代转IbGI拟南芥、转空载体拟南芥与gi-2突变体拟南芥的基 因组DNA作为模板，进行PCR检测，所用的IbGI基因引*S:Primerl :5'-AGAGCCAAACCAGTGAATATGA-3 '（SEQ ID NO:7)和Primer2:5 '-TCACACAGATATAGTGCAGCCTA-3 ' (SEQ ID NOJhPCR 反应体系如下：lXPremix Taq，100ng DNA，正、反向引物各 0.45yl， ddH20补充至终体积20yl。热循环参数为：94°C3min; 94°C30s，复性温度55°C30s，72°C30s， 35个循环;72°C5min，1个循环;4°C保存。
[0082]从电泳检测扩增结果见图1(泳道M为Marker;泳道NK为阴性对照(gi-2突变体拟南 芥）；泳道CK为阳性对照（重组质粒pGWB5:1bGI);泳道T1-T6为IbGI转基因拟南芥）可以看 出，得到195bp的为阳性To代转IbGI拟南芥，表明IbGI基因已经整合到烟草基因组中，并证 明这些再生植株为阳性转基因植株。
[0083]转空载拟南芥与gi-2突变体拟南芥结果无显著差异。
[0084]二、转IbGI拟南芥的开花性鉴定 [0085] 1、表型鉴定
[0086] 将编号为T1、T2、T3转基因拟南芥、转空载拟南芥(EV)以及gi-2突变体拟南芥(CK) 种植于穴盘中，每3天浇水1次，待植株生长3周后，观察拟南芥生长情况。每个株系种植4株 以上，统计结果取平均值。
[0087] 结果如图2所示，可以看出编号为T1、T2、T3的转基因拟南芥比对照植株开花时间 与开花率显著提高，表明其开花性明显增强。
[0088] 同时，统计转基因拟南芥、转空载拟南芥与对照的莲座叶数，结果如下：
[0089] 编号为T1的转基因拟南芥的莲座叶数平均值为13;
[0090] 编号为T2的转基因拟南芥的莲座叶数平均值为12;
[0091] 编号为T3的转基因拟南芥的莲座叶数平均值为14;
[0092]转空载拟南芥的莲座叶数平均值为39;
[0093]对照gi-2突变体拟南芥的莲座叶数平均值为41。
[0094]转空载拟南芥与gi-2突变体拟南芥结果无显著差异。
[0095]上述莲座叶为生长在拟南芥基部的叶片，其数量多少可以反应开花时间的早晚。 莲座叶数越少，开花时间越早。
[0096] 2、成花基因FT表达量检测
[0097]成花基因FT是控制植物开花的关键基因，其基因表达量可以反应当前植物开花性 的强弱。因此，FT基因的表达水平可以作为检测植物开花性的一项指标。
[0098]提取上述生长3周后编号为T1、T2、T3转基因拟南芥、转空载拟南芥以及gi-2突变 体拟南芥的总RNA，通过荧光定量PCR技术检测各个植株中FT基因的表达水平，具体步骤如 下：
[0099]①根据实例1中植物总RNA的提取方法，对上述拟南芥的总RNA进行抽提、纯化、检 测与保存；
[0100]②根据实例1中cDNA第一链的合成方法，将提取的总RNA反转录成First-strand cDNA，稀释10倍后置于-20°C保存备用；
[0101] ③设计用于荧光定量PCR的FT基因特异引物5和引物6,以及内参Actin基因特异引 物7和引物8。引物序列如下：
[0102]
[0103] 引物6:5'-TGCCTGCCAAGCTGTCGAAA-3'（SEQ ID N0:10)
[0104] 引物7:5'-TATCGCTGACCGTATGAGCAAAG-3'（SEQ ID N0:11)
[0105] 引物8:5'-TGGACCTGCCTCATCATACTCG-3'（SEQ ID N0:12)
[0106] ④以上述cDNA为模板，根据SYBR Green Realtime PCR Master Mix(TOYOBO)试剂 盒，对FT基因进行荧光定量PCR检测，每个检测样品重复3次。
[0107] 荧光定量PCR反应体系如下：1XSYBR Green Realtime PCR Master Mix，0.4yM 上、下游引物，l〇〇ng cDNA，ddH20补充至终体积50yl。热循环参数为：95°C lmin; 95 °C 15s，60 °C15s，72°C45s，40个循环;Melting Curve Analysis lh，反应是在ABI StepOne Plus焚光 定量PCR仪上完成。
[0108] 检测结果见图3,可以看出，编号为T1、T2、T3转基因拟南芥的FT基因的表达量显著 高于转空载拟南芥和gi-2突变体拟南芥，表明IbGI转基因拟南芥的开花能力高于非转基因 拟南芥。转空载拟南芥与gi-2突变体拟南芥结果无显著差异。
[0109] 上述实验结果表明，IbGI蛋白及其编码基因可以促进植物开花。
【主权项】
1. 一种IbGI蛋白，其特征在于，该蛋白来源于甘薯，为如下（1)或(2)的蛋白质： (1) SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (2) SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸 残基且与植物开花相关的由（1)衍生的蛋白质。2. 权利要求1所述的IbGI蛋白的编码基因。3. 如权利要求2所述的编码基因，其特征在于，所述基因是如下（1)-(3)中任何一种DNA 分子： (1) SEQ ID N0:1 所示的DNA分子； (2) 在严格条件下与（1)限定的DNA分子杂交且编码植物开花相关蛋白的DNA分子； (3) 与（1)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、 至少具有90%、至少具有95%、至少具有96 %、至少具有97 %、至少具有98%或至少具有 99 %同源性且编码植物开花相关蛋白的DNA分子。4. 含有权利要求2或3所述编码基因的重组载体。5. 根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为将权利要求2或3所述 编码基因插入到PGWB5的两个attR位点之间得到的重组载体。6. 权利要求1所述的IbGI蛋白和权利要求2或3所述的编码基因和权利要求4或5所述的 重组载体在调控植物开花过程中的应用;所述植物为长日照植物拟南芥;所述调控植物开 花过程为控制植物开花时间和开花数量。7. 权利要求1所述的IbGI蛋白和权利要求2或3所述的编码基因和权利要求4或5所述的 重组载体在培育提前开花的转基因植物中的应用;所述植物为长日照植物拟南芥。8. -种培育转基因植物的方法，其特征在于，该方法为将编码权利要求1所述蛋白的 DNA分子导入目的植物，得到转基因植物;所述转基因植物比所述目的植物提早开花;所述 目的植物为gi-2突变体拟南芥。9. 根据权利要求8所述的培育转基因植物方法，其特征在于，所述编码权利要求1所述 蛋白的DNA分子通过权利要求4或5所述的重组载体导入目的植物。
【文档编号】C12N15/82GK105820226SQ201610383436
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2016年6月1日
【发明人】唐维
【申请人】江苏徐淮地区徐州农业科学研究所