一种抗逆、抗除草剂的转基因旱稻的培育方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于转基因工程技术领域，具体涉及一种抗逆、抗除草剂的转基因旱稻的 培育方法。
【背景技术】
[0002] 粮食安全和生态安全是我国农业持续发展中的首要问题。水稻为保证我国粮食安 全做出了巨大贡献。但水稻生产消耗了大量的淡水资源，作为重要的粮食作物，其用水量占 到农业用水总量的很大一部分，因此我国很多地区缺水的现状已成为影响水稻产量的重要 原因之一。我国大约有一亿多亩盐碱地，主要分布在东北、华北、西北等干旱和半干旱地区 以及长江以北的沿海地区。随着我国人口的剧增及工业的高速发展，可耕地急剧下降，而不 合理灌溉、耕作等又造成了大量良田的次生盐渍化，特别是受侧渗补给的低洼地，土壤盐渍 化日益严重，且有逐年增加的趋势，严重威胁着我国的水稻生产。除了干旱、盐碱等非生物 胁迫外，稻田杂草因与水稻争夺光、水、肥等资也成为影响水稻产量和品质的重要因子。杂 草竞争干扰导致水稻减产15%以上。杂草籽粒掺杂，影响谷物品质，有毒杂草还危害人类健 康。一些杂草是作物病虫害的重要寄主，间接增加了田间杀虫剂等化学物质的投放。
[0003] 因此，抗逆和抗除草剂水稻新品种培育迫在眉睫。但是传统育种周期长，选育过程 复杂，而且很难获得兼具抗逆和抗除草剂的能力的新品种。为了克服盐碱和干旱等非生物 逆境对农业生产的危害，满足世界和我国对抗旱、耐盐水稻品种日益增长的需求，同时有效 地控制稻田杂草，降低劳动力需求，提高水稻增产潜力，本申请应用现代生物技术，克隆了 小立碗藓中的抗逆基因8981基因，与抗除草剂基因 bar共同构建表达载体后，通过农杆菌 侵染法导入适于旱地种植的栽培稻即旱稻栽培种中，创制一批重要的转基因新材料，为培 育抗逆、高产、优质的新品种提供重要的基础，该技术目前还未见有相关的报道。
【发明内容】
[0004] 针对现有技术存在的技术缺陷，本发明的目的在于提供一种抗逆、抗除草剂的转 基因旱稻的培育方法。
[0005] 本发明具体通过以下技术方案实现：
[0006] 一种抗逆、抗除草剂的转基因旱稻的培育方法，包括以下步骤：
[0007] 1)利用抗逆8981基因构建重组表达载体pCAMBIA3301-Ubi-8981 ;
[0008] 2)将重组表达载体转化入农杆菌，并利用农杆菌菌液侵染目的旱稻的胚性愈伤组 织，利用共培养基培养；
[0009] 3)对共培养后的愈伤组织脱菌并恢复，转移至含有草铵膦的筛选培养基中进行筛 选；
[0010] 4)将筛选的抗性愈伤组织经预分化和分化培养，将分化形成的再生小苗转入生根 培养基中培养，幼苗生根后炼苗、移栽，得到抗逆、抗除草剂的转基因旱稻。
[0011] 本发明所述的8981基因序列为SEQ ID NO. 1。
[0012] 所述的重组表达载体的构建方法为：用EcoR I和BamH I酶切Ubi-T载体，得到含 有Ubiquitin基因的片段；用BamH I和Pml I酶切8981-T载体，得到含有8981基因的片 段；将含有Ubiquitin和8981基因的片段依次插入到载体pCAMBIA3301的多克隆位点中， 得到所述重组表达载体命名为PCAMBIA3301-UM-8981。
[0013] 进一步的，所述的Ubi-T载体为：通过将Ubiquitin基因连接pG EM-T vector 得到，所述的 Ubiquitinp 基因 PCR 扩增引物为 5' -CGG AATTCCTGCAGTGCAGCGTGACC-3' 和 5' -CGGGATCC CTGCAG AAGTAACACCAAACAAC-3'，扩增出的 Ubiquitin 长度为 2. Okb。
[0014] 进一步的，所述的所述8981-T载体为：将8981基因连接pGEM-T vector得到， 所述的 8981 基因 PCR 扩增引物为 5' -GGATCC TC TTGTGTATATTGTGCGC-3' 和 5' -CACGTG TGCGGTGTCTTATT TACTAT-3'。
[0015] 本发明所述目的旱稻为鲲旱1号。
[0016] 所述的共培养基为：NB+2, 4-D2mg/L+蔗糖30g/L+葡萄糖10g/L+AS20mg/L+凝胶 3. 2g/L，培养条件为：pH5. 2,25°C暗培养3天。
[0017] 所述的愈伤组织恢复培养基为：NB+特美汀500mg/L+麦芽糖30g/L+凝胶0. 58 %， pH6. 0,培养条件为：28°C暗培养7天。
[0018] 所述的筛选培养基为：NB+麦芽糖30g/L+特美汀300mg/L+草铵膦40mg/L+凝胶 3. 2g/L，pH6. 0, 28°C避光筛选三轮，40天。
[0019] 所述的预分化培养基为：NB+NAAlmg/L+6-BA 3mg/L+ABA3mg/L+ 麦芽糖 30mg/L+ 特 美汀300mg/L+草铵膦40mg/L+凝胶3. 2g/L，pH6. 0,培养条件为：28°C暗培养5天。
[0020] 所述的分化培养基为：NB+6-BAlmg/L+NAAlmg/L+麦芽糖30g/L+植物凝胶3. 2g/L， ρΗ5· 8,培养条件为：28°C暗培养。
[0021] 所述的生根培养基为：1/2MS+蔗糖30g/L+NAA0. 5mg/L+植物凝胶I. 6g/L，ρΗ5· 8 ; 培养条件为：28 °C下光照培养3-4周。
[0022] 本发明的有益效果为：将含有LEA家族8981基因重组表达载体导入目的旱稻中， 得到抗逆的转基因旱稻，所述转基因旱稻对干旱、盐碱以及除草剂的抗性高于目的旱稻。实 验证实，本发明的重组载体导入旱稻中，得到100个转基因旱稻株系。对100个阳性株系的 T3代依次进行了 PCR、RT-PCR筛选鉴定以及抗逆实验，得到对逆境及除草剂草铵膦具有良好 抗性的转基因旱稻株系，在培育新的抗逆旱稻品种中有良好的应用前景。本发明方法也可 应用于其他植物新品种的培育中。
【附图说明】
[0023] 图1是表达载体pCAMBIA3301-Ubi-8981的T-DNA区结构简图；LB，T-DNA左边 界；RB, T-DNA右边界；CaMV 35S，烟草花叶病毒35S启动子；Nos, Nos终止子；Ubi,玉米 Ubiquitin启动子；Bar，抗除草剂基因（PPT乙酰转移酶基因）；8981，LEA家族抗逆基因 8981 ；
[0024] 图2是转8981基因旱稻的PCR检测结果；
[0025] 图3是转8981基因旱稻的RT-PCR检测结果；
[0026] 图4是15% PEG4000胁迫转基因旱稻鉴定图；A为正常生长至三叶期的旱稻，cl 为非转基因旱稻，al、bl、dl、el为4个不同的转基因旱稻株系；B为15% PEG4000胁迫7 天后旱稻生长状况，c2为非转基因旱稻，a2、b2、d2、e2为4个不同的转基因旱稻株系；C为 复水7天后旱稻生长状况，c3为非转基因旱稻，a3、b3、d3、e3为4个不同的转基因旱稻株 系；
[0027] 图5是0. 75% NaCl处理5天转基因旱稻萌发图。A为非转基因旱稻鲲旱1号；B 为转8981基因旱稻鲲旱1号；
[0028] 图6是0. 8mg/ml草铵膦喷洒三叶期转基因旱稻鉴定结果图；A为喷洒草铵膦前旱 稻生长情况，其中al为非转基因旱稻，bl为转基因旱稻；B为喷洒0. 8mg/ml草铵膦72h后 旱稻生长情况，其中a2为非转基因旱稻，b2为转基因旱稻；
[0029] 图7是转基因旱稻与非转基因旱稻田间喷施500mg/L除草剂15天后效果；A、D、E 为转8981基因旱稻不同株系，B、C为非转基因旱稻。
【具体实施方式】
[0030] 下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施 例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示 的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明 的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
[0031] 实施例1重组载体的构建
[0032] 1、8981基因的克隆
[0033] 以小立碗藓cDNA为模板，进行RT-PCR扩增，扩增产物连接到pGEM-T vector上， 构建出克隆载体8981-T。所用引物为：
[0034] 5' -GGATCC TCTTGTGTATATTGTGCGC-3' ；
[0035] 5' -CACGTG TGCGGTGTCTTATTTACTAT-3'，