扩增出的 8981 基因片段长度为 0· 8kb。
[0036] 2、重组载体的构建
[0037] 1)用PCR扩增pTCK303(本实验室保存载体）的Ubiquitin启动子，所用的引物为 5' -CGGAATTC CTGCAGTGCAGCGTGAC C-3' 和 5' -CGGGATCC CTGCAGAAGTAACACCAAACAAC-3'， 扩增出的Uiquitin启动子长度为2. Okb。将此基因连接pGEM-T vector (购自promega公 司），命名为Ubi-T。
[0038] 2)用EcoR I和BamH I酶切Ubi-T载体，得到2. Okb的片段后纯化并插入到 PCAMBIA3301载体的EcoR I和BamH I酶切位点之间得到重组载体，将重组载体命名为 pCAMBIA3301-Ubi〇
[0039] 3)用BamH I和Pml I酶切8981-T载体，得到0. 8kb的片段后纯化并插入到 pCAMBIA3301-Ubi载体的BamH I和Pml I酶切位点之间得到重组载体，将重组载体命名为 pCAMBIA3301-Ubi-8981。
[0040] 构建的表达载体pCAMBIA3301-Ubi-8981的T-DNA区结构简图如图1。
[0041] 实施例2重组载体的转化、培养与分子鉴定
[0042] 1、表达载体转化农杆菌
[0043] 1)农杆菌感受态的制备
[0044] 从-80°C冰箱取出冻存的农杆菌菌株Agl-I，分别在Amp和Rif抗性、Kan和Rif抗 性、Rif抗性的LB平板上划线。28°C倒置培养48h，若Amp +和Kan +的平板均无菌落长出，此 管菌株可以作为制备感受态的原始菌株。挑取Rif抗性的LB平板上的根癌农杆菌的单菌落 于3-5mL的含Rif抗性的YEB液体培养基中，28°C 200rpm震荡培养过夜。取过夜的菌液按 1:50接种于50mL含Rif的YEB培养基中扩培，28°C继续摇培约6-7h，至0D600 = 0. 4-0. 6 取出。将摇培好的菌液放入冰中，冰浴30min。5000g，4°C离心5min，弃去上清回收菌体。向 回收的菌体中加入IOml 0. 15M NaCl，轻轻吹吸，使菌体在溶液中完全混匀。5000g，4°C离 心5min，倒去上清，菌体用ImL 20mM冰冷的CaCl2K轻悬浮。每管200 μ L分装，加入终浓 度为20 %的无菌甘油，混匀，并放入液氮中速冻后转入-80°C保存。
[0045] 2)表达载体转化农杆菌
[0046] 从_80°C冰箱中取出制备的农杆菌的感受态细胞，并置于冰上，感受态细胞融化 后，将10 μ L的质粒DNA加入到200 μ L的农杆菌感受态细胞中，轻轻吹吸混匀，放于冰上 冰浴30min。将装有感受态细胞的EP管放入液氮中速冻5min，随即放入37°C恒温水浴锅 中保温5min。取出离心管，在管中加入ImL无抗生素的YEB液体培养基，28°C 150rpm摇培 3-5h，同时制备含有（Kan 100mg/L，Rif 125mg/L)抗性的YEB固体培养基。室温5000rpm， 离心5min，弃去部分上清，用大枪轻轻吹吸混匀，使菌体均匀分布在培养基中，并涂布在含 有Kan+的YEB固体培养基上，在恒温培养箱中，28 °C倒置培养24-48h，均可见单菌落。
[0047] 农杆菌不是天然保存质粒的菌株，质粒在农杆菌中不能高拷贝的复制，致使质粒 提出来的浓度很低，因而我们采用恢复动员的方法，对质粒进行鉴定：从农杆菌中提出质粒 DNA，随后将质粒DNA转回到大肠杆菌中（DH5 α )，并挑取大肠杆菌的单菌落，将其放入液体 培养基中摇培，提取质粒DNA进行酶切鉴定。结果显示载体pCAMBI A3301-Ubi-8981已成 功转入农杆菌中。
[0048] 2、转化旱稻
[0049] 1)外植体的获得
[0050] 实验材料为鲲旱一号成熟胚。在无菌条件下，用75%乙醇浸泡已脱壳种子 I. 5min，期间轻轻摇晃锥形瓶，用蒸馏水洗绦3次，再用30% NaClO泡20min，浸泡过程中不 断摇晃锥形瓶，重复两次，用蒸馏水洗涤6次；用无菌滤纸吸干种子表面水分，无菌条件下 接种到诱导培养基上（NB+2, 4-D 2mg/L+麦芽糖30g/L+凝胶3. 2g/L)，每皿20粒，28°C暗 培养诱导愈伤组织；待愈伤长出后，挑选致密，淡黄色，粟米状大小，状态佳的愈伤组织进行 7天继代培养，继代培养与诱导愈伤培养基相同。
[0051] 2)农杆菌介导转化与培养
[0052] 无菌条件下，选取继代培养基中淡黄色致密的愈伤组织，将其转入到锥形瓶中，随 即倒入含有菌体的重悬液，重悬液OD (600)值0. 2,并使愈伤组织完全浸泡在重悬液中，保 证农杆菌与愈伤组织完全接触，浸泡20分钟，将重悬液倒出，用小勺刮出愈伤组织，将愈伤 转移到铺有10层滤纸的培养皿中，待愈伤表面无明显水迹后，将愈伤组织转移到共培养培 养基上（NB+2, 4-D 2mg/L+蔗糖 30g/L+葡萄糖 10g/L+AS20mg/L+凝胶 3. 2g/L)，ρΗ5· 2, 25°C 暗培养3天。
[0053] 3)愈伤组织的脱菌以及恢复培养
[0054] 在无菌条件下，将共培养3天后的愈伤组织收集到一个锥形瓶中，用无菌水清洗 4次，然后倒入含有抗生素特美汀500mg/L的无菌水，浸泡10分钟，期间轻轻摇晃，倒出无 菌水，最后倒入含有特美汀500mg/L的脱菌液（NB+特美汀500mg/L+2, 4-D 2mg/L+麦芽糖 30g/L，pH6. 0)，浸泡40分钟，期间轻轻摇晃，倒出脱菌液，用灭菌水清洗一次，将愈伤转移 到铺有10层滤纸的培养皿中，吸干表面水分，将吸干后的愈伤组织转移到含有特美汀的恢 复培养基中（NB+特美汀500mg/L+麦芽糖30g/L+凝胶0. 58 %，pH6. 0)，28 °C暗培养7天。
[0055] 4)抗性愈伤筛选
[0056] 待愈伤组织恢复一周后，将其转移到含有草按膦的筛选培养基中（NB+麦芽糖 30g/L+特美汀300mg/L+草铵膦40mg/L+凝胶3. 2g/L，ρΗ6· 0)，筛选三轮，前两轮每轮15 天，第三轮7天，28°C暗培养；每轮继代过程中，只挑取生长点处乳白色愈伤组织，其余泛黄 的老的愈伤组织舍弃。
[0057] 5)愈伤组织的分化及再生
[0058] 筛选37天后，挑取乳白色的愈伤组织，继代到预分化培养基中（NB+NAAlmg/ L+6-BA 3mg/L+ABA3mg/L+ 麦芽糖 30mg/L+ 特美汀 300mg/L+ 草铵膦 40mg/L+ 凝胶 3. 2g/L， pH6. 0)，28°C暗培养5天，经过预分化的愈伤组织颜色为白色，且颜色鲜亮有光泽，挑取白 色愈伤转移到分化培养基上（NB+6-BAlmg/L+NAAlmg/L+麦芽糖30g/L+植物凝胶3. 2g/L， pH5. 8)，28°C暗培养，每15天继代一次，实验发现经过预分化处理的愈伤组织，在分化培养 基上生长较快，长势较好，待其出现绿点，当绿点长出3cm左右小芽时，将小芽转接于生根 培养基上（1/2MS+蔗糖30g/L+NAA0. 5mg/L+植物凝胶L 6g/L，pH5. 8)，28°C下光照培养3-4 周，然后将苗移栽至温室或大田。
[0059] 3、转基因旱稻的检测
[0060] 1)DNA水平的检测
[0061] 按CTAB方法提取待测的叶片总DNA，以各转基因株系的基因组DNA为模版，质粒 pCAMBIA3301-Ubi-8981为阳性对照，未转化旱稻的基因组DNA为阴性对照，进行PCR检测。 所用引物序列为 S: AATTTCTTTCTTTTTGGATTA，A: TGCGGTGTCTTATTTACTA T。PCR 反应体系 (20 μ L) :DNA 2 μ L，dNTP Mix 1 μ L，IOx PCR buffer 2 μ L，Taq 酶 0· 2 μ L，S 引物 1 μ L，A 引物1以匕？0?反应程序：96°0预变性31^11;94°0变性3〇8;58°0退火4〇8 ;72°0延伸5〇8(35 循环）；72 °C延伸lOmin。扩增产物经I %琼脂糖凝胶电泳检测，能扩增出特异的0. 8kb基因 片段的植株为阳性植株，如图2所示，其中为阴性对照；" + "为阳性对照（以质粒为模板 扩增）；1-22为不同株系的旱稻植株鉴定结果；M为Marker，从下到上依次为100bp、250bp、 500bp、750bp、1000 bp、2000bp，最亮条带为750bp。由此结果看出，所检测样品均为转基因阳 性植株。
[0062] 2) RNA水平的检测