一种四环素耐低氧菌种的构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物发酵医药技术领域，特别是涉及一种四环素耐低氧菌种的构 建方法。
【背景技术】
[0002] 工业上通常进行高密度细胞发酵，四环素高密度细胞发酵过程需要消耗大量的氧 气。四环素发酵菌(金色链霉菌）属于放线菌，发酵过程中菌丝体的结构致密性和发酵培养 基的粘稠性，往往使溶氧受到限制；而氧气在发酵液中的溶解度较低，且随着发酵液中生物 量和消泡剂的增加，其溶解度和传质效率还会逐步降低，供氧通常会造成四环素工业发酵 的限制，严重制约着抗生素发酵效价的提高，严重影响四环素规模化生产。
[0003] 工业上为了解决放线菌发酵过程的缺氧问题，一般方法为： ①通过提高增加发酵罐的通气量以及降低罐体装液量来改善菌体发酵过程中的缺 氧问题，但是这种方法成本高，收益低。
[0004] ②利用物理和化学方法进行微生物诱变育种来选育耐低氧菌种，这种方法耗费 大量的人力和物力，周期长，成效慢。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种四环素耐低氧菌种的基因构建方法，通过该方法构建的 四环素耐低氧菌种可以改善重组四环素在低氧条件下的蛋白表达水平，最终达到节约能 源，降低成本的目的。
[0006] 本发明采用如下技术方案实现： 一种四环素耐低氧菌种的构建方法，其特征在于其工艺包括： 大肠杆菌ET12567菌体感受态细胞的制备； 将可表达的透明颤菌血红蛋白基因的质粒PSET152转化入大肠杆菌ET12567菌体感受 态细胞中； 将转化后的大肠杆菌ET12567中与金色链霉菌进行接合转移，得到四环素耐低氧菌 种。
[0007] 所述大肠杆菌ET12567菌体感受态细胞的制备过程为：在0-4°C条件下离心收 集在LB培养基中培养至对数期中期的ET12567菌体，将该菌体悬浮于预冷至1 一 5°C的 0. lmol/L的CaCl2溶液中，在1 一 5°C冷浴20-30min，然后继续在0-4°C条件下离心，收集 菌体即可得到感受态细胞。
[0008] 所述离心时转速控制在3500 - 4500r/min。
[0009] 所述对数期中期是指0D600为0· 2-0. 6。
[0010] 所述ET12567菌体的培养条件为：33-37°C、180-200r/min条件下摇床培养。
[0011] 将收集的菌体悬浮于IOOuL预冷至1 一 5°C的0. lmol/L的0&(：12溶液中，4°C冰箱 保存备用。
[0012] 所述将可表达的透明颤菌血红蛋白基因的质粒pSET152转化入大肠杆菌ET12567 菌体感受态细胞中的具体过程为：取ET12567感受态细胞于EP管中，加入可表达的透明颤 菌血红蛋白基因的质粒PSET152, 1-5°C冰浴20-40min ;39-42°C恒温水浴中热激30~50s， 立即冰上放置5~IOmin ;加入适量LB培养基，混匀，35~39°C，180~200r/min摇床恢 复培养30~50分钟；将转化的菌液涂布于含50~100mg/ml安普霉素 APr的LB平板上； 35~39°C倒置过夜培养，筛选转化子。
[0013] 所述ET12567感受态细胞和可表达的透明颤菌血红蛋白基因的质粒pSET152的体 积比为：60-100:5-10。
[0014] 所述将转化后的大肠杆菌ET12567中与金色链霉菌进行接合转移的具体过程为： 将转化后的大肠杆菌ET12567接种于加有安普霉素的LB培养基中培养，离心收集菌 体； 制备金色链霉菌孢子悬浮液，将其转入孢子预萌发培养基中，在38-42?的水浴锅热 激5-10分钟后，冷至室温，在摇床上培养10-30分钟； 将上述培养好的金色链霉菌孢子液与大肠杆菌菌体混匀，放置1-5分钟后涂布双碟， 培养，覆盖萘啶酮酸，PCR验证即可。
[0015] 10、按照权利要求1所述的四环素耐低氧菌种的构建方法，其特征在于所述将构 建的质粒PSET152转化入大肠杆菌ET12567 (含有PUZ8002质粒）中后，先进行特异性引物 PCR鉴定和凝胶成像鉴定，然后再与金色链霉菌进行接合转移。
[0016] 所述特异性引物PCR鉴定条件为：94°C预变性5-10min，然后94°C变性30-45s， 62-66°C退火 10_30s，72°C退火 45-60s，共 25-30 个循环，最后 72°C延伸 5-10min。
[0017] 链霉菌是一类高G+C含量的革兰氏阳性菌，目前报道的23种抗生素及生物活性 化合物来源于链霉菌。然而链霉菌遗传操作比较困难，要实现对其中许多代谢途径的转移 和调控需要有效的工具，自从Trien_Cuot等人证明了穿梭质粒接合转移能够在亲缘关系 比较远的生物之间发生后，人们构建了许多类似的穿梭质粒，进一步证明了接合转移可以 在分类学上亲缘关系遥远的细菌中发生。透明颤菌血红蛋白是一种应用广泛的原核生物血 红蛋白。研宄发现VHb蛋白具有与氧接合和传递氧的能力，使透明颤菌能生存于贫氧环境 中，基于这一特性，vhb基因已在多种异源宿主，包括细菌、酵母、动植物细胞中成功表达， 它能明显改善异源宿主在限氧条件下的生长，提高宿主生物量和促进次级代谢。
[0018] 基于上述理由，本发明采用以链霉菌广泛使用的整合型质粒PSET152为出发质 粒，通过供体大肠杆菌（Escherichia coli )ET12567 (pUZ8002)进行属间接合转移四 环素。ET12567(pUZ8002)是甲基化缺陷型菌株。大部分链霉菌能够通过甲基修饰系统区分 出自身DNA和外来DNA，ET12567(pUZ8002)通过结合转移的方法进入链霉菌体内，pUZ8002 质粒含有tra基因，能够编码转移蛋白Tra，从而实现基因 DNA转移。ET12567(pUZ8002) 配套使用载体是PSET152和pKC1139, pUZ8002 :有Kmr和Tetr，是不能自我转移的RK2衍 生质粒，能诱动ori质粒结合转移，大肠杆菌ET12567是质粒PSET152的运载体(如图1所 示)。透明颤菌（siercoraria)是一种专性好氧革兰氏阴性细菌，生长在贫氧 环境中，透明颤菌血红蛋白基因（以FgvW透明颤菌血红蛋白 (Vitreoscilla hemoglobin，VHb)在低氧环境中产生一种分子量约为15. 8 kDa的可溶性 蛋白，具有较高的氧吸附和解离速率常数，且菌体在生长过程中能诱导合成一种血红蛋白 以适应贫氧环境。
[0019] 本发明将构建的可表达透明颤菌血红蛋白基因（Vgb)的质粒PSET152转化入大 肠杆菌PUZ8002中，将转化后的大肠杆菌与四环素菌种进行接合转移得到四环素耐低氧菌 种，并使之在受体细胞四环素中增殖和表达，跨越了遥远的细菌之间的界限。
[0020] 本发明的技术效果体现在： 1、提取原始四环素菌种与构建的耐低氧四环