一种耐超高温耐碱β-甘露聚糖酶基因、氨基酸序列及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物酶工程技术领域，具体涉及一种耐超高温耐碱β-甘露聚糖酶 基因，本发明还公开了一种耐超高温耐碱β-甘露聚糖酶的氨基酸序列，本发明还公开了 一种耐超高温耐碱β-甘露聚糖酶基因的应用。
【背景技术】
[0002] 甘露聚糖是生物质中半纤维素的主要组分，β-甘露聚糖酶在自然界半纤维素 资源的开发利用及甘露寡糖药物的研发具有重要作用。β-甘露聚糖酶（e-l，4-mannan mannohydrolase, EC 3. 2. 1. 78)，又称为β -D-甘露聚糖酶或β -1，4-D-甘露聚糖酶，是一 类能够水解含有e-l，4-D-甘露糖苷键的甘露寡糖、甘露多糖（包括甘露聚糖、半乳甘露 聚糖、葡甘露聚糖等）的内切水解酶。它属于半纤维素酶类，在生物质降解中发挥重要作 用。虽然动物植物也可以生产β-甘露聚糖酶，但生产和提取成本都明显高于微生物，而且 微生物来源的β-甘露聚糖酶活性高、产量大。利用微生物生产甘露聚糖酶的研宄与生物 技术的发展阶段相适应。早期的研宄和生产主要集中在菌株的选育，发酵条件优化、酶的纯 化和理化性质、酶水解作用机理等方面，比如在1960至1980年代，国内外都进行了许多甘 露聚糖酶产酶菌株的筛选、选育、酶的分离纯化和酶学性质以及作为工具酶研宄天然多糖 类物质的糖链结构和生化特性等。国内的相关研宄菌株报道有巨曲霉、黑曲霉和沃特曼青 霉等。国际上日本、法国、前苏联、美国等国家先后开展了甘露聚糖酶产生菌嗜水气单孢菌 F-25、卡塞尔黄肠球菌FL2121、嗜碱芽孢杆菌ΑΜ001等的研宄。有报道可以利用β-甘露聚 糖酶水解植物胶如魔芋粉、角豆胶、瓜儿豆胶等生产低聚甘露糖，而后者能促进双歧杆菌的 增殖用于生产益生饲料或功能产品。随着分子生物学和蛋白质工程技术的广泛应用，β -甘 露聚糖酶的研宄和生产开始转向基因克隆和高效表达以及活性位点分子育种等方面的研 宄。许多细菌和真菌都可以产生β-甘露聚糖酶。一般地细菌型β-甘露聚糖酶具有更多 的种类，即使是同一种菌不同菌株产酶的活性都有很大差异；而且细菌的酶一般具有结构 单一的完整的特征性结构域，底物专一性好，而真菌型β -甘露聚糖酶则混有纤维素酶或 木聚糖酶特征性结构域，结构更加复杂。另外，细菌相对来说具有更广泛的生态适应性，酶 的进化结果使得β-甘露聚糖酶能够适应更广的PH和温度范围。更重要的是细菌的深层 发酵效率高，对设备要求较低，具有降低工业成本的优势。
[0003] 因而，细菌来源β-甘露聚糖酶的研宄逐渐成为热点。1999年Jonathan等从高温 厌气热梭杆菌（Clostridium thermocellum)基因组文库获得甘露聚糖酶基因 manBl，推测 编码一个589个氨基酸的蛋白质（Man26A)，分子量为66. 816kDa，N-端有一个原核生物的 信号肽，酶催化结构域与另外一些糖苷水解酶家族26的甘露聚糖酶同源性只有32%，此酶 的最适作用温度为65°C，最适pH为6. 5。Anwar等（2000)从嗜纤维杆菌（Caldibacillus cellulovorans)中鉴定一个含有4567bp核苷酸序列的基因丛，它含有三个0RF，其中ORFl 一部分编码一个C-端纤维素结合域（CBD)，0RF2编码β -甘露聚糖酶，0RF3编码一个功能 未知的蛋白质。0RF2编码的酶具有多个结构域，包括一个功能未知的N-端结构域（Dl)，一 个内部CBD (D2)，一个β -甘露聚糖酶的催化结构域（D3)和一个C-端CBD (D4)。D3与糖苷 水解酶家族5有一定的同源性，将D3的基因克隆并表达重组酶ManAd3,发现它的最适作用 温度和pH分别为85°C和6. 0,在70°C具有极高的热稳定性。2004年有报道从碱性枯草芽 孢杆菌N16-5中纯化出一种碱性β -甘露聚糖酶，该酶的最适作用温度和pH分别为75°C 和9. 5,通过SDS-PAGE推断该酶为单体酶，分子量为55kDa，等电点pi为4. 3,能有效地将 半乳甘露聚糖和葡甘露聚糖水解成一系列的低聚糖和单糖，该酶的基因（manBl)包括一个 1479bp的ORF，与糖苷水解酶家族5的基因具有高度同源性。
[0004] β-甘露聚糖酶可以在医药、食品、饲料、化工污染处理等方面应用。我国对β-甘 露聚糖酶的研宄从八十年代就己开始，也有报道相关酶类，但是属于聚糖水解酶超家族 26 (Glyco_hydro_26superfamily)的嗜热β -甘露聚糖酶、且具有耐热温度为70_100°C、耐 碱pH范围为7-10的特性，在国内还没有报道。
【发明内容】
[0005] 克服现有技术的不足，本发明的目的是提供一种耐超高温耐碱β -甘露聚糖酶基 因，其碱基序列为SEQ ID NO. 1。
[0006] 本发明的另一目的是提供一种上述耐超高温耐碱β -甘露聚糖酶的核苷酸序列， 其核苷酸序列为SEQ ID NO. 2。
[0007] 本发明的另一目的是提供一种上述耐超高温耐碱β -甘露聚糖酶基因在制备耐 超高温耐碱甘露聚糖酶中的应用，本发明将来自热带特殊环境的甘露聚糖酶产生 菌HFS06先用常规复合诱变技术筛选到酶活性大幅提高的突变菌株HFS08,进一步利用基 因工程手段将突变株中的β-甘露聚糖酶改良基因挖掘出来并进行高效表达，避免改良基 因发生回复突变或被修复而丢失。是微生物酶工程及其分子育种的重要策略。
[0008] 本发明所采用的技术方案是，一种上述的耐超高温耐碱β-甘露聚糖酶基因在制 备耐超高温耐碱β-甘露聚糖酶中的应用，包括以下步骤：
[0009] 步骤1、从热带林业土壤样品中分离获得枯草杆菌Bacillus sp.菌株HFS06,进行 诱导和筛选，得到诱变菌株Bacillus sp. HFS08 ;
[0010] 步骤2、提取诱变改良菌株HFS08基因组DNA :将枯草杆菌Bacillus sp. HFS08纯 培养单菌落接种至LB培养基中在30-38°C下培养10_13h，用试剂盒提取基因组DNA ;
[0011] 步骤3、β-甘露聚糖酶重组菌株的构建：根据pET-26b(+)表达载体及β-甘露聚 糖酶基因序列特点，构建表达载体，设计引物：
[0012] Pl:5,-ATAGGATCCCCAYACTGTGTCGCCTGTAAAT-3' ，
[0013] Ρ2 :5'-ATACTCGAGTTCAACGATAGGCGTTAAAGAATC-3' ；
[0014] 以所得枯草杆菌Bacillus sp.HFS08基因组DNA为模板，通过PCR克隆法分别 将两个菌株的β-甘露聚糖酶基因克隆到细菌表达载体PET-26M+)中；用限制性内切 酶BamHI和XhoI分别对β -甘露聚糖酶基因 PCR-产物和载体pET-26b(+)进行双酶切， 然后将酶切后的产物连接获得重组质粒pET-26b(+)-manBlm，将重组质粒转化大肠杆菌 E. coli BL21(DE3)，并筛选阳性克隆，从而获得诱变的β-甘露聚糖酶表达菌株E. coli pET-26b(+)-manBlm ；
[0015] 步骤4、β -甘露聚糖酶基因的表达：将诱变的β -甘露聚糖酶表达菌株E. coli pET-26b (+) -manBlm接种至LB液体培养基中，在30-37 °C下振荡培养至0D600nm = 0. 4-0. 6,并加入异丙基-β -D-硫代半乳糖苷0. 5-1. Ommol/L诱导β -甘露聚糖酶基因的 表达；
[0016] 步骤5、β -甘露聚糖酶酶学活性的检测：
[0017] 诱导后的重组菌上清液进行平板活性测定，在槐豆胶平板加入上述上清原液或稀 释液3微升，30°C下培养6-12h然后现在刚果红染色以确定其酶解情况；或者将诱导后的重 组菌上清液用纯水稀释10倍后，取ImL稀释液与ImL槐豆胶溶液混合，55°C反应lOmin，然 后用DNS法测定水解产生的还原糖；
[0018] 步骤6、重组β-甘露聚糖酶的纯化和酶谱分析：利用硫酸铵沉淀法将分泌型 表达的重组目的蛋白进行沉淀，再经Ni-NTA柱纯化；同时制备2块Native-PAGE胶，加 0. 2wt%槐豆胶溶液于Native-PAGE的分离胶中；分别加同样的表达酶蛋白样品与2块 Native-PAGE中平行电泳，结束后一个胶做考马斯亮蓝染色，另一个加槐豆胶的PAGE用刚 果红染色，以原位检测表达酶的活性，重组β-甘露聚糖酶蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0019] 本发明的特点还在于，
[0020] 骤1中从热带林业土壤样品中分离获得枯草杆菌Bacillus sp.菌株HFS06,进行 诱导和筛选，得到诱变菌株Bacillus sp. HFS08具体为：
[0021] ①原始菌株从热带林业土壤样品中分离获得，具有同时降解纤维素，木聚糖和甘 露聚糖的活性；经鉴定其为枯草杆菌Bacillus subtilis subsp. Spizizenii亚种，记为 HFS06 ；
[0022] ②选取菌株HFS06制成浓度约10~6Cfu/ml的悬液，用化学诱变剂甲基磺酸乙酯在 不同处理浓度和不同作用处理时间下诱变，然后在含有甘露聚糖的选择培养基上生长，挑 单菌落筛选降解圈大的菌株，待复选稳定后，再行紫外光复合诱变，在固定紫外光强度下在 不同照射时间下诱变，即UV在波长254nm、功率20w、照射距离25cm固定条件下、照射累计 时间分别为30s，60s，120s，240s，照射间隙轻轻旋转悬液；复合诱变处理的菌悬液严格避 光，在红光下涂布甘露聚糖选择培养基上，包以锡箔纸避光培养。最后筛选获得代表性菌 株，其具有降解活性高、生长快和继代稳定的特点，诱变菌株，记为Bacillus sp. HFS08。
[0023] 用化学诱变剂甲基磺酸乙酯在不同处理浓度和不同作用处理时间下诱变，具体的 浓度和时间分别为：浓度〇. l，〇. 25,0. 5mol/L，作用时间5，10，15,30,60min。
[0024] 本发明的有益效果是：本方法先用常规诱变方法筛选到β-甘露聚糖酶改良基 因，在此基础上利用基因工程手段将优良基因克隆表达，使得改良基因在回复突变或被修 复前挖掘出来，为产业化生产耐碱、耐热甘露聚糖酶的提供技术和材料支持，是微生物 酶工程和分子育种的新思路。
[0025] 本发明获得的表达酶比活最高可达10413. 3U/mg。在80°C和90°C下保温90min 后，其剩余酶活分别为92. 7%和78. 6%，并在100°C保温60min后，仍具有81. 3%的剩余酶 活。而且在PH8-10范围内具有>75%的剩余活性。该酶基因全长由1089个核苷酸组成， 编码362个氨基酸，其N-端包含一个推测的27个氨基酸的信号肽，属于糖苷水解酶超家族 26。利用镍离子亲和层析柱纯化，经SDS-PAGE电泳表明其成熟蛋白分子量约为符合推测大 小约37. 8kD。本发明之β -甘露聚糖酶是一种嗜热碱性酶，具有耐碱、耐高温特性，适于在 食品、