耐高温异淀粉酶基因的克隆、表达及应用
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程和生物能源技术领域，具体涉及一种耐高温异淀粉酶基因克隆、表达及在酶生物燃料电池中的应用。
【背景技术】
[0002]生物燃料电池是以有机物为原料，利用细胞或酶将化学能转化为电能的一类绿色燃料电池。根据催化剂种类可分:微生物燃料电池和酶生物燃料电池，它们具有能量转化效率高、生物相容性好、原料来源广泛、成本低廉且环保等优点，在医疗、电子、环境保护等领域均有重要的使用价值。但目前大部分的生物燃料电池输出功率密度较低，极大限制了在生产中的应用。微生物燃料电池由于对电子屏蔽作用明显和较多副反应导致对燃料使用效率较低，而酶生物燃料由于催化剂浓度较高并且没有传质壁皇，因此有可能产生更高的输出功率，在室温和中性溶液中工作，满足一些微型电子设备或生物传感器的需求。另外，与甲醇燃料电池相比，糖分(淀粉或葡萄糖)驱动的酶燃料电池因原料成本低廉，生物可降解性更强，更绿色环保而获得研宄者青睐。最新研宄表明:在不消耗ATP前提下，通过人工合成的多酶催化途径，可以实现淀粉水解为葡萄糖和葡萄糖彻底氧化偶联技术，这有力推动了高能量密度的酶燃料电池的发展，为淀粉类原料在酶燃料电池中的应用提供了很大可能性。但针对淀粉类原料中的支链淀粉和麦芽糖糊精，由于存在大量糖苷键分支位点(如图1所示)，在α-葡聚糖磷酸化酶作用下，水解为葡萄糖-1-磷酸效率偏低，造成能源浪费和酶燃料电池能量密度的降低。针对支链淀粉和麦芽糖糊精，异淀粉酶或普鲁兰酶可以将支链淀粉和麦芽糖糊精中的α -1，6糖苷键水解，切下整个侧枝，形成直链淀粉，极大提高了α -葡聚糖磷酸化酶水解支链淀粉的能力。但是，目前已发现的普鲁兰酶或异淀粉酶都存在稳定性差，不耐热等问题，限制了此类酶在工业中的应用。所以，耐高温异淀粉酶的发现和应用对提高新型淀粉燃料电池作用至关重要。
【发明内容】
[0003]本发明主要目的是提供一种耐高温异淀粉酶基因序列，同时提供该序列所表达蛋白的制备方法及该蛋白在酶生物燃料电池中的应用。
[0004]本发明所采取的技术方案如下。
[0005]一种耐高温异淀粉酶基因，其DNA序列如SEQ ID N0.1所示，全长2151bp，该基因从 KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)数据库中的tokodaii基因组中筛选获得，其代码为:0RF ST0928。
[0006]所述耐高温异淀粉酶基因所编码耐高温异淀粉酶，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示，包括716个氨基酸，分子量为83.lKDa，其中编码序列17~108氨基酸为第48家族的碳水化合物结合模序(CBM);编码序列204~545氨基酸为淀粉酶催化结构域；编码序列546-716为未知功能多肽；该酶在本发明申请之前被推定为一种糖原脱枝酶，本申请则经过验证证明其为耐高温异淀粉酶。
[0007]所述耐高温异淀粉酶的制备方法，包括以下步骤:
(1)基因克隆，通过设计引物，应用PCR技术扩增或人工合成方法得到包含异淀粉酶基因全长序列；
设计引物序列设计如下:
IF:5’ ACTTT AAGAA GGAGA TATAC ATatg gtttt ttcac acaag gatag accat 3’，
IR:5’ TCAGT GGTGG TGGTG GTGGT Gatat tcaat cctcc tatat accat tgcgg 3’ ；
VF:5’ ccgca atggt atata ggagg attga atatC ACCAC CACCA CCACC ACTGA 3、
VR:5，atggt ctatc cttgt gtgaa aaaac catAT GTATA TCTCC TTCTT AAAGT 3，0
[0008]其中其中IF和IR的5’端大写碱基属于pET20b (+)载体上的序列，3’端小写碱基属于插入基因ORF ST0928上序列；VF和VR的5’端小写碱基属于插入基因ORF ST0928上序列，3’端大写碱基属于pET20b (+)载体上序列，IF与VR反向互补，IR与VF反向互补；
(2)载体构建，分别以异淀粉酶基因和市售载体上的序列为模板，采用文献You等(DNACloning and Assembly Methods, Humana Press，2014，183-192)提供的简单克隆方法，进行重叠延伸PCR得到重组表达质粒；
(3)异淀粉酶表达与纯化，将重组质粒转入万.coliRosetta (DE3)中，挑选阳性重组子培养，IPTG诱导表达，收获细胞，超声破碎后，使用镍柱将带有His标签的异淀粉酶纯化出来。
[0009]所述耐高温异淀粉酶，最适反应条件为:以500 μ L反应体系为例，含40 mM乙酸缓冲液(pH 5.5)，添加有0.5 mM MgCl2,85°C催化反应。
[0010]所述耐高温异淀粉酶可用于酶生物燃料电池中，所述酶生物燃料电池为单极室无隔膜类型，结构包括:反应容器、离子交换膜和反应物；
所述反应物包括:淀粉、耐高温异淀粉酶、α-葡聚糖磷酸化酶、磷酸葡萄糖变位酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶、二氢硫辛酸脱氢酶、HEPES缓冲液、NaCl、NAD+、Mg2+、Mn2+和电子穿梭体(AQDS)；
具体为:淀粉、0.012%耐高温异淀粉酶(质量体积比)、7U α -葡聚糖磷酸化酶(a GP)、3U磷酸葡萄糖变位酶(PGM)、1.5U 6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PDH)、5.4 U 二氢硫辛酸脱氢酶(DI)、50 mM pH 7.2 的HEPES缓冲液、0.3 M NaCl,4 mM NAD+,5 mM Mg2+、0.25 mM Mn2+、1.7 mM电子穿梭体(AQDS)。
[0011]发明人从KyotoEncyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)数据库中，对于最适生长温度在80°C的耐高温古生菌Sulfolobus的基因组进行筛选后发现，其开放阅读框ORF ST0928序列，理论推测其具有糖原脱枝酶活性，但目前还没有任何相关文献对其生化性质进行过详细描述。发明人采用基因工程方法，通过将ORF ST0928序列进一步转化整合进入大肠杆菌进行诱导表达后，得到一种新的耐高温异淀粉酶重组蛋白，检测结果表明，该耐高温异淀粉酶热稳定性优良，在90°C条件下半衰期可达200min，用于糖燃料电池时，有望取得优良效果。具体而言，该耐高温异淀粉酶的优势在于:(I) ORF ST0928基因编码的异淀粉酶耐高温、酶活力稳定，具有很强工业应用潜力；(2)该耐高温异淀粉酶用于糖燃料电池时，可使淀粉类物质彻底水解为葡萄糖，从而提高能量转化效率，拓展生物燃料电池的应用范围。
【附图说明】
[0012]图1为异淀粉酶作用原理图；
图2为表达载体pET20b-StIA构建图；
图3为目的蛋白即耐高温异淀粉酶电泳检测结果；
图4为糖燃料电池构造原理图，其中#1为异淀粉酶；#2为α -葡聚糖磷酸化酶;#3为磷酸葡萄糖变位酶；#4为6-磷酸葡萄糖脱氢酶；#5为二氢硫辛酸脱氢酶；AQDS为电子穿梭体；
图5为糖燃料电池实物图。
【具体实施方式】
[0013]下面结合实施例对本发明做进一步的解释说明。
[0014]实施例1
本发明所提供的耐高温异淀粉酶基因，其DNA序列如SEQ ID N0.1所示，全长2151bp，该基因从 KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)数据库中的 SwJ/bJo/ws?ο左ο?/aii基因组中筛选获得，其代码为:0RF ST0928。
[0015]所述耐高温异淀粉酶基因所编码耐高温异淀粉酶，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示，包括716个氨基酸，分子量为83.lKDa，其中编码序列17~108氨基酸为第48家族的碳水化合物结合模序(CBM);编码序列204~545氨基酸为淀粉酶催化结构域；编码序列546-716为未知功能多肽；该酶在本发明申请之前被推定为一种糖原脱枝酶，本申请则经过验证证明其为耐高温异淀粉酶。
[0016]所述耐高温异淀粉酶的制备方法，包括以下步骤:
(I)基因克隆，通过设计引物，应用PCR技术扩增或人工合成方法得到包含异淀粉酶基因全长序列；具体步骤如下:
A.设计引物，以KEGG数据库公布的11i/aii基因组中的序列片段ORFST0928和市售pET20b (+)载体为模板，使用Primer Premier 5.0软件设计引物如下:
IF:5’ ACTTT AAGAA GGAGA TATAC ATatg gtttt ttcac acaag gatag accat 3，，
IR:5’ TCAGT GGTGG TGGTG GTGGT Gatat tcaat cctcc tatat accat tgcgg 3’ ；
VF:5’ ccgca atggt atata ggagg attga atatC ACCAC CACCA CCACC ACTGA 3、
VR:5，atggt ctatc cttgt gtgaa aaaac catAT GTATA TCTCC TTCTT AAAGT 3，0
[0017]其中其中IF和IR的5’端大写碱基属于pET20b (+)载体上的序列，3’端小写碱基属于插入基因ORF ST0928上序列；VF和VR的5’端小写碱基属于插入基因ORF ST0928上序列，3’端大写碱基属于pET20b (+)载体上序列，IF与VR反向互补，IR与VF反向互补。
[0018]B.\>丄Sulfolobus 1Aot/aii基因组为模板，步骤A所设计IR、IF序列为引物进行PCR扩增，
反应体系为:高保真DNA聚合酶(按说明书用量，0.02U/yL) ;dNTP各200 μ Μ;引物各0.5 μ M ;模板 0.05ng/ μ L0
[0019]扩增条件为:98°C预变性30s，25个循环(98°C变性10 s，60°C退火10 s，72°C延伸)，最后一步72°C延伸10 min。
[0020]取3 μ L扩增产物使用0.8%的琼脂糖凝胶纯化，纯化产物送华大基因进行测序。测序结果表明，PCR扩增产物所得基因序列与SEQ ID N0.1所示核苷酸序列相同，即ORFST0928 序列。
[0021]用PCR产物回收试剂盒回收PCR扩增产物，对回收产物用紫外分光光度计进行含量测定，备用。
[0022](2)载体构建，构建过程参考图2所示，分别以异淀粉酶基因和市售pET20b (+)载体上的序列为模板，米用文献You等(DNA Cloning and Assembly Methods,Humana Press，2014，183-192)提供的简单克隆方法，进行重叠延伸PCR得到重组表达质粒；具体步骤如下:
C.以市售pET20b (+)载体为模板，步骤A所设计VR、VF序列为引物进行PCR扩增，
反应体系:高保真DNA聚合酶(按说明书用量，0.02U/μ L) ;dNTP各200 μΜ;引物各0.5“]?;模板0.05叩/^1^1\6〇 buffer ο
[0023]扩增条件为:98°C预变性30s，30个循环(98°C变性15 s，55°C退火15 s，72°C延伸 3kb/min)，最后一步 72°C延伸 5 min。
[0024]扩增产物纯化、测序，得到如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列，即ORF ST0928序列，使用PCR产物回收试剂盒进行回收，最后使用紫外分光光度计进行含量测定，备用。
[0025]D.重叠延伸PCR得到重组表达质粒，
具体为，按照文献You et al.2014提供的方法，将步骤(I)中PCR扩增回收得到的ORFST0928序列产物与步骤C中PCR扩增回收产物混合，进行重叠延伸PCR。
[0026]混合反应体系设置如下:5倍的GC缓冲液，10 μ L ；dNTP (各10 μ M)，I μ L ；DNA载体片段(步骤C所回收产物)，4 ng/yL (16 μ L);插入片段(步骤I所回收产物)，4 ng/μ L(5 μ L);水添加到49.5 μ L，高保真DNA聚合酶，0.5 μ L (1.0单位/50 μ L)。
[0027]反应条件为:98