一种耐超高温液化淀粉酶的制备方法
【专利摘要】一种基因重组菌发酵生产辅酶Q10的方法,将NAD激酶基因转入高效表达还原性辅酶Q10的菌株；所述的重组菌优化的培养条件为：（1）斜面活化；（2）种子培养；（3）发酵培养。本发明通过基因工程手段构建的重组菌，稳定性强，其辅酶Q10产量较出发菌株提高了21.6%，达到1.63g/L，能够达到工业生产的要求。
【专利说明】一种耐超高温液化淀粉酶的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种淀粉酶的制备方法，尤其是涉及一种在高温下仍然有较高活力的用于淀粉液化的淀粉酶的制备方法。
【背景技术】
[0002]淀粉广泛应用于食品、医药、化工、造纸、石油等领域，发展前景非常广阔。随着科学技术的不断发展，淀粉、淀粉糖和淀粉衍生物等新产品的不断增多及淀粉深加工产品的开发，加快并推动了淀粉产业的发展。
[0003]我国淀粉及淀粉制品行业发展迅速，淀粉总产量以年均10-15%左右的速度递增，已成为世界最大的淀粉生产国之一，为淀粉深加工产品的开发与生产奠定了相当的物质基础。
[0004]目前，全世界淀粉的主要来源是玉米、木薯、小麦等。
[0005]现有生产耐高温液化淀粉酶的方法主要存在以下不足:一是生产成本相对较高；二是制备得到的淀粉酶耐受的温度很难超过100°c，用于淀粉液化效果不理想；三是多数企业是将发酵液用硫酸铵盐析或酒精沉淀，经过滤干燥而成固体淀粉酶，这种产品含有残渣、硫酸铵等杂质，应用范围受到限制。
【发明内容】
[0006]本发明要解决的技术问题是，克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种生产成本低，可耐超高温，产品质量 好的液化淀粉酶的制备方法。
[0007]本发明解决其技术问题采用的技术方案是，一种耐超高温的液化淀粉酶的制备方法，包括以下步骤:
步聚1，琼脂培养基接种培养:(I)琼脂培养基准备:培养基配方为，胰蛋白胨 1.0-1.5 %，酵母膏 0.5-0.7 %, NaCl 0.9-1.1 %，琼脂 1.8-2.1 %，可溶性淀粉0.25-0.30%，pH6.5-7.0，其余为水；将所述配料混匀后，放于培养皿中，0.09-0.1lMPaMPa (优选0.1MPa)灭菌30-35min，冷却到室温，制成琼脂复壮培养基，备用；(2)接种与培养:将保存的地衣芽孢杆菌环移取1-2环放于每个培养皿的琼脂培养基上，置于36°C ±1°C恒温培养60-70h，取出保存，制成琼脂培养基菌种；
步聚2，扩大培养:(I)扩大培养基配方:胰蛋白胨1.0-1.5%，酵母膏0.5-0.7%,NaCl
0.9-1.1%，可溶性淀粉 0.25-0.30%，ρΗ6.5-7.0，其余为水；0.09-0.1lMPa (优选 0.1MPa)灭菌30-35min，冷却至39-41 °C (优选40°C )，制成扩大培养基，备用；(2)扩大培养方法:取步聚I制成的琼脂培养基菌种，按扩大培养基重0.8%的接种量，接种到冷却至39-41°C (优选40°C )的扩大培养基，360C ± 1°C恒温培养60-70小时，恒温培养时，不断搅拌通风，搅拌速度为300-320转/分钟，通风量为1.3-1.5立方气体/升扩大培养基/分钟，制成扩大培养液；
步聚3，液态发酵制备:(I)液态发酵培养基配方=(NH4)SO40.22-0.27 %, KH2PO40.30-0.37%,CaCl20.015-0.02%，可溶性淀粉 0.25-0.30%，胰蛋白胨 0.35-0.45%，玉米粉 2.9-3.5%, pH6.5-7.0，其余为水；0.09-0.1lMPa MPa (优选 0.1MPa)灭菌 30_35min，冷却至39-41°C(优选40°C )，制成液态发酵培养基，备用；⑵液态发酵培养:取步聚2制成的扩大培养液，按液态发酵培养基重2.5-3.5%的接种量，接种到冷却至39-41°C (优选40°C ) V的液态发酵培养基，360C ± 1°C恒温培养60-70小时，恒温培养时，不断搅拌通风，搅拌速度为300-350转/分钟，通风量为1.3-1.5立方气体/升培养基/分钟，制成液态发酵液；步聚4，粗滤:往步聚3制成的液态发酵液中添加相当于液态发酵液重4-6%的硅藻土，混合均匀，板框压滤，得粗滤液；
步聚5，膜浓缩:以微滤膜将步聚4所得粗滤液过滤浓缩至原粗滤液的1/4-1/5 (即IOOkg粗滤液，经膜浓缩后，制得浓缩液25-20kg)，在5-25°C下保存即可。
[0008]所述地衣芽孢杆菌为公知常见微生物(参见《酶制剂工业》下册，张树政主编，科学出版社1998年第三次印刷，476页)。
[0009]淀粉酶活力检测方法采用BAU法(参见《酶制剂工业》下册，张树政主编，科学出版社1998年第三次印刷，485页)。
[0010]按本发明方法生产的耐超高温淀粉酶产品质量符合QB/B23061997标准。在不增加生产成本前提下，酶活力达22000-27000u/mL ;最高能耐受117°C高温。【具体实施方式】
以下结合实施例对本发明作进一步说明，但这些实施例不应理解为对本发明保护范围的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法所作的修改或替换，均属于本发明的保护范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，加入的各原料除特别说明外，均为市售产品。
[0011]步聚I，琼脂培养基接种培养:(I)琼脂培养基准备，培养基配方:胰蛋白胨1.2g，酵母膏0.6g，NaCl 1.(^，琼脂2.(^，可溶性淀粉0.288，pH6.8，其余为水，合计总重100g ;将所述100g配料混匀后，分放于培养皿中，0.1MPa灭菌33min，冷却至室温，制成琼脂复壮培养基，备用；(2)接种与培养:将实验室保存的地衣芽孢杆菌环移取I环放于每个培养皿的琼脂培养基上，置于36°C ±1°C恒温培养65h,取出保存,制成琼脂培养基菌种；
步聚2，扩大培养:(I)扩大培养基配方:胰蛋白胨60g (1.2%)，酵母膏30g (0.6%),NaCl 50g (1.0%)，可溶性淀粉 14g (0.28%),水 4846g (96.92%)，合计总重 5000g (5kg)，pH6.8 ；0.1MPa灭菌33min，冷却至40°C，制成扩大培养基，备用；(2)扩大培养方法:取步聚I制成的琼脂培养基菌种，按扩大培养基重0.8%的接种量，接种到冷却至40°C的扩大培养基，36°C ±1°C恒温培养65小时，恒温培养时，不断搅拌通风，搅拌速度为310转/分钟，通风量为1.位方气体/升扩大培养基/分钟，制成扩大培养液；
步聚3，液态发酵制备:(1)液态发酵培养基配方:(NH4) SO40.25 kg, KH2PO4 0.34kg，CaC120.018kg，可溶性淀粉0.28kg，胰蛋白胨0.40 kg,玉米粉3.20kg，水95.512kg,ρΗ6.8，合计总重100kg，0.1MPa灭菌33min，冷却至40°C，制成液态发酵培养基，备用；(2)液态发酵培养:取步聚2制成的扩大培养液，按相当于液态发酵培养基重3.0%的接种量，接种到冷却至40°C的所述液态发酵培养基，360C ± 1°C恒温培养65小时，恒温培养时，不断搅拌通风，搅拌速度为330转/分钟，通风量为1.位方气体/升培养基/分钟，制成液态发酵液；步聚4，粗滤:往步聚3制成的液态发酵液中添加相当于液态发酵液重4-6%的硅藻土，混合均匀，板框压滤， 得粗滤液；步聚5，膜浓缩:以微滤膜将步聚4所得粗滤液过滤浓缩至原粗滤液的1/5，经膜浓缩后，将浓缩液以塑料桶装，在室温(5-25°C)温度下保存即可。
[0012]制得的液化淀粉酶，按照BAU 法检测，酶活力达到27000u/mL ;能耐受117°C高温。
【权利要求】
1.一种耐超高温的液化淀粉酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: 步聚1，琼脂培养基接种培养:(I)琼脂培养基准备:培养基配方为，胰蛋白胨 1.0-1.5 %，酵母膏 0.5-0.7 %，NaCl 0.9-1.1 %，琼脂 1.8-2.1 %，可溶性淀粉0.25-0.30%，pH6.5-7.0，其余为水；将所述配料混匀后，放于培养皿中，0.09-0.1lMPaMPa灭菌30-35min，冷却到室温，制成琼脂复壮培养基，备用；(2)接种与培养:将保存的地衣芽孢杆菌环移取1-2环放于每个培养皿的琼脂培养基上，置于36°C 土TC恒温培养60-70h，取出保存，制成琼脂培养基菌种； 步聚2，扩大培养:(I)扩大培养基配方:胰蛋白胨1.0-1.5%，酵母膏0.5-0.7%,NaCl 0.9-1.1 %，可溶性淀粉 0.25-0.30 %，ρΗ6.5-7.0,其余为水；0.09-0.1lMPa,灭菌30-35min，冷却至39-41°C，制成扩大培养基，备用；(2)扩大培养方法:取步聚I制成的琼脂培养基菌种，按扩大培养基重0.8%的接种量，接种到冷却至39-41°C的扩大培养基，36 0C 土 1°C恒温培养60-70小时，恒温培养时，不断搅拌通风，搅拌速度为300-320转/分钟，通风量为1.3-1.5立方气体/升扩大培养基/分钟，制成扩大培养液； 步聚3，液态发酵制备:(1)液态发酵培养基配方=(NH4)SO40.22-0.27 %, KH2PO40.30-0.37%,CaCl20.015-0.02%，可溶性淀粉 0.25-0.30%，胰蛋白胨 0.35-0.45%，玉米粉 2.9-3.5%, ρΗ6.5-7.0，其余为水；0.09-0.1lMPa MPa 灭菌 30_35min，冷却至 39-41。。，制成液态发酵培养基，备用；(2)液态发酵培养:取步聚2制成的扩大培养液，按液态发酵培养基重2.5-3.5%的接 种量，接种到冷却至39-41°C的液态发酵培养基，36°C 土 1°C恒温培养60-70小时，恒温培养时， 不断搅拌通风，搅拌速度为300-350转/分钟，通风量为1.3-1.5立方气体/升培养基/分钟，制成液态发酵液； 步聚4，粗滤:往步聚3制成的液态发酵液中添加相当于液态发酵液重4-6%的硅藻土，混合均匀，板框压滤，得粗滤液； 步聚5，膜浓缩:以微滤膜将步聚4所得粗滤液过滤浓缩至原粗滤液的1/4-1/5，在5-25 °C下保存。
2.如权利要求1所述耐超高温的液化淀粉酶的制备方法，其特征在于，步聚I中，琼脂复壮培养基的灭菌压力为0.1MPa0
3.如权利要求1或2所述耐超高温的液化淀粉酶的制备方法，其特征在于，步聚2中，扩大培养基灭菌的压力0.1MPa，冷却至40°C。
4.如权利要求1或2所述耐超高温的液化淀粉酶的制备方法，其特征在于，步聚3中，液态发酵培养基的灭菌压力为0.1MPa MPa，冷却至40°C。
【文档编号】C12N9/28GK103614353SQ201310666013
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年12月11日 优先权日:2013年12月11日
【发明者】林亲录, 袁四岳, 孙术国, 吴跃, 梁盈, 付湘晋, 肖华西 申请人:湖南湖湘生物科技有限公司