专利名称：：热稳定的高温酸性α-淀粉酶基因、工程菌、重组酶及应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于生物工程领域。涉及一种热稳定高温酸性a-淀粉酶及其某因和歪组酶，包括热稳定高温酸性a-淀粉酶基因的表达载体；本发明还涉及其基因T程菌株大肠埃希氏菌EHJ21(EscherichiacoliEHJ21)CGMCCNo.2157(已f2007年9月06日保藏在中国微牛物菌种保藏管理委员会普通微牛物中心，保藏编号为CG:M:CCNo.2i57);本发明还涉及该齒株产重组热稳定卨温酸性u-淀粉酶方法与产品。
背景技术：
：a—淀粉酶为a-1，4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶(a-1，4-glucan-4-gluca加hydrolaseEC.3.2丄1),是最軍:要的工业酶制剂之一，已被广泛应用在食品、发酵、纺织、造纸和制药等诸多行业。目前工业用a—淀粉酶主要来自嗜热脂肪地芽孢杆菌(GeobacillusstearothermopMus)和地衣芽孢朴菌(Bacilluslicheniformis),这些酶的最适作用条件为90。C和pH6，存在的主要问题是热稳定性差，高于i00。C和pH低于6.0时易失活，热稳定性依赖cf。超嗜热微生物由于能产生在a温下活性a，且具有很好热稳定性的超卨温酶，而成为研究的热点。超嗜热微生物处于特殊的物理、化学和生态环境，使它们形成了极为特殊的生物结构、代谢机制，导致来fi超嗜热微生物的超高温酶具有独特的结构和功能，显示了其独特的特性具有极高的热稳定性，通常能抵抗化学变性剂如表面活性剂、有机溶剂和高酸高碱环境，其催化功能优于g前在各种工业生产中应用的酶。因此，超高温酶己作为研究酶的进化、酶的稳定性和酶的活性机制、蛋白质结构和功能的关系以及生物催化性的模型。目前国外研究的超高温酶在分子牛物学、淀粉加工、纤维素的降解、乙醇的生产及化学合成工业已有广泛的应用(Vieilleetal.，2()()1)，已有卨温聚合酶、糖酶、淀粉酶、蛋白酶等儿种极端酶开始工业化生产，并且已经创造了数十亿美元的经济效益(肖湘等，2006)。可以在80-nox:范围内生长的超高温菌，是a-淀粉酶最重要的潜在来源，国外已报道产高温a—淀粉酶的超嗜热微生物主要为乌兹炽热球菌(Pyrococcuswoesei)，强烈'识!冉J求菌(P,furiosus)，!冉7JC高i显I求菌(ThermococcushydrothermaHs)、Thermococcusprofundus、Desulfurococcusmucosus、Pyrodictiumabyssi、海生葡萄状嗜热菌(Staphylothermusmarinus)、嗜热网络球杆菌(:Dictyoglomusthermop'hilum)，海栖热袍菌(Thermotogamaritime),其中来源于Pyi'ococcuswoesei、Pyi'ococcusfuriosus、Thermococcushydrothe皿alis、Thermococcusprofundus禾口Thermotogamaritime等中a-淀粉酶基冈已被克隆和表达到常温宿主细胞巾。国内近几年开展了从超嗜热微生物中克隆a-淀粉酶基因的研究，如将强烈炽热球菌的a-淀粉酶基因在不同常温宿主中表达，以及海栖热袍菌的a-淀粉酶基因在大肠杆菌屮的表达的研究。
发明内容本发明的目的之一是从嗜热古菌中克隆-一种热稳定高温酸性a-淀粉酶的基因。本发明的热稳定高温酸性a-淀粉酶基因来自超嗜热古菌嗜热球菌ThermococcussicuirH:j2i菌株。本发明采用的技术方案是根据NC:Bi中已报道的超嗜热古菌a-淀粉酶的基因序列设计引物，通过聚合酶链式反应(PCR)的方法获得了超嗜热古齒嗜热球菌ThermococcussiculiHJ21a—淀粉酶基因的保守序列，采用SiteFinding-PCR技术扩增获得超嗜热古茼嗜热球茼ThermococcussiculiHJ21.a—淀粉酶基冈两端的序列。通过序列分析和拼接获得了1374bp完整的超嗜热古菌嗜热球菌ThermococcussiculiHJ21a-淀粉酶基因。测定了其碱棊序列，如序列表SEQIDNO.l.所示本发明的另一目的是提供包括上述热稳定高温酸性a-淀粉酶基因碱基序列的表达载体。其是用常规方法将本发明的热稳定高温酸性a—淀粉酶基因的碱基序列连接f各种载休上构建而成，该载休可以是市售的质粒、粘粒、噬菌休或病毒载休等。较佳的是将PCR技术扩增到的热稳定卨温酸性a—淀粉酶基因产物和克隆载体pM::D18-T连接，形成克隆载体pMD18-T-amy,p:MD18-T-amy和表达载体p:Et-28a-His6分别用限制性内切酶消化，形成互补的粘性末端，经T4连接酶连接，形成热稳定高温酸性a-淀粉酶基因表达载体pEt-28a-ffis6-amy。本发明的再一目的是提供一种某因工程菌株，其是将包含本发明热稳定高温酸性a—淀粉酶基因碱基序列的表达载体转化到感受态大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中得到的基因工程菌株大肠埃希氏菌EHJ21(EscherichiacoliEHJ21)CGMCCNo.2157，如将表达载休pEt-28a-His6-amy转化其中得到含有表达载休pEt-28a-ffis6-amy的大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/pEt-28a扭s6-amyo本发明的乂-'目的是提供-'种制备重组热稳定高温酸性a-淀粉酶的方法，其包括用k述木发明表达载体转化宿主细胞，培养转化体，获得重组的热稳定高温酸性a-淀粉酶。本发明不局限于任何特定的宿主细胞，只要它能够表达歪组表达载体，在一优选实验方案本发明使用BL21(DE3)。以上技术方案中所有基本分了生物操作均参照"分了克隆实验指南"(第三版，科学出版社，2002年)本发明的^温a-淀粉酶不仅可以水解淀粉，对于由葡萄糖以a-1,4糖苷键聚合的多糖都有.'定的催化能力。嗜热古菌来源于太平洋深海热液口，最适生长温度为88"C。由于嗜热古茼生长条件苛刻，人工培养困难，同时所含高温a—淀粉酶的产量比较低，因此不能直接利用古生菌来生产a-淀粉酶。解决上述问题的有效方法就是利用棊因工程的方法将该基因转入一种容易培养的宿主里面，进行表达。基f这一理论我们将高温a-淀粉酶的基因导入大肠朴菌，进行表达。对来源于太平洋深海火热液口的嗜热古菌(通过培养、目的基因钓取，得到本发明所述高温a-淀粉酶基因，基因测序工作由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。序列如SEQIDNO.l所示。我们将高温a-淀粉酶基因重组到T系统载体上，然后转入到大肠杆菌宿主巾，得到一株基冈工程茼株大肠埃希氏菌EHJ21(EscherichiacoliEHJ21)CGMCCNo.2157，已于2007年9月06日保藏在l卜:l微生物菌种保藏管理委员会普通微生物屮心，保藏编号为CGMCCNo.2157，保藏单位地址北京市朝阳区大屯路。基因工程菌表达产物是细胞内可溶性蛋白，通过超声波破碎、加热失活大肠朴菌杂蛋白，即nj进行分离纯化得到重组热稳定高温酸性a-淀粉酶。本发明还具体公开了一种用以上技术方案中所述的基因工程菌株大肠埃希氏齒EHJ21(EscherichiacoliEHJ21)CGMCCNo.2157产重组热稳定高温酸性a-淀粉酶的制备方法，其步骤如F，(l)将基因工程菌株以1X的接种量接入装有50m:L:LB(蛋白胨，1%;酵母粉，0.5%;NaCl，1%;pH7.0)培养基的250mL三角瓶屮，在37°C，180转/分———F摇床培养，当培养菌液的OD,达到l.O时，再加入浓度为lmmol■L—'诱导剂IPTG，诱导4h,得发酵液；(2)将发酵液i3000Xg离心5min后去掉上淸，用3m:L牛理盐水悬浮细胞，l:醫Xg离心5min去掉....匕清，重复此操作一次；用3mL蒸馏水充分悬浮细胞，()。C水浴中经超声波破碎5min,13000Xg离心10min取上淸液即得重组热稳定高温酸性a—淀粉酶的粗酶液；(3)将制取的粗酶液用80。C水浴中处理30min，13000Xg离心10min取上清液，再用DEAE离子交换层析和Ni亲和JS析的方法对至组酶进行纯化，即得。以上技术方案所述的方法得到的重组热稳定高温酸性a-淀粉酶的性质为该酶的分了量为约50KD;最适作用温度9(rC，在95。C和l()(rC分别有90%和7()%的酶活力；该酶热稳定性不依赖于Ca2、酶液分别在80、90、iO(TC保温5'h后，其残余酶活分别为82%、77%和69%;该酶的作用pH范围为pH49,最适作用pH为5.05.5,在pH4.5有81%的残余酶活；在80°C和901:下该酶在pH59和pH58的范围内稳定，该酶在100tMh，pH57.5的范闱内稳定；金属离子K—'—、Na+对酶有激活作用，Hg2"、:Pb2+、Al3+、Cu2+、Fe3+和Zn2+能够抑制酶活性;lmmmol-L-1和5mmmo1七-1N-溴代丁二酰亚胺对酶的活性具有抑制作川；该酷的Km为45mg'mi;1，Vmax为9mg.ml4.min1;该酶分解马铃薯淀粉为麦芽'始和4T-1唐。应用大肠杆菌工程菌EHJ21表达高温蛋白经活性实验鉴定，具有a-淀粉酶活性，该高温蛋白即为所述的重组热稳定高温酸性a—淀粉酶。重组热稳定卨温酸性a-淀粉酶具有普通a-淀粉酶所不具备的特点，能在7()100。C高温下催化反应，有很强的抗高温和化学物质变性剂的作用；运用到生产中，有储运成木低、加快动力学反应、对冷却器系统要求标准低等优点。重组热稳定高温酸性a-淀粉酶可应用于淀粉水解，催化淀粉液化，在食品工业、生物化工，医药业等领域具有軍:要的应ltj潜力。图l为本发明热稳定高温酸性a-淀粉酶基因的PCR扩增图谱，其中，M:DNAMarker,i，2:为a—淀粉酶基因的PCR扩增产物。图2为pMD18-T-amy的构建图。图3为本发明克隆质粒p:M:D18-T-amy的EcoRI和SalI:双酶切分析图谱，其中，M，DNAMarker,1，pMD18-T-amydigestedbyEcoRI/SalI。图4为軍:组表达载体pEt-28a-His6-amy的构建图。图5为本发明表达质粒pEt-28a-His6-amy经EcoRI和SalI双酶切分析图谱，其中，Ml，M2，DMAMarker;1，a-淀粉酶基因的PCR扩增产物；2,EcoRI&Sall;3，pEt-28a-His6-amy/EcoRI:。图6为本发明基因工程菌株表达产物重组热稳定^温酸性a-淀粉酶的SDS-PAGE电泳图，其中，M为标准蛋白；1,2，纯酶；3，Ni亲和^析；4，D:EAE离子夂换层析；5:加热处理；6，粗酶液；7，活性带。图7为温度对重组热稳定高温酸性a-淀粉酶酶活力的影响图。图8为pH温度对茧组热稳定高温酸性a-淀粉酶酶活力的影响图。图9为重组热稳定高温酸性a—淀粉酶的温度稳定性图。图10为重组热稳定高温酸性a-淀粉酶的pH稳定性图。图ii为重组a—淀粉酶水解可溶性淀粉的Lineweaver-Burk图。图12为重组热稳定卨温酸性a-淀粉酶水解'纟铃薯淀粉产物薄层层析图，1-4为1、6、16、24h;Gl，葡萄糖；G2，麦芽糖；G3，左芽三糖；G4,麦芽四糖；G5，麦芽五糖；G6，麦芽六糖；G7，麦芽七糖。具体实施例方式以下参照附图，进一歩描述本发明的具体技术方案，以便于本领域的技术人员进一步地理解本发明，rfn不构成对其权利的限制。K列实施例中的材料与方法为所采用的分子克隆技术参见J.莎亩布鲁克等编的《分子克隆实验指南》。所使用的工具酶购自大连宝生物公司和....匕海生工生物工程公司，具体的反应条件和使用方法均参考商品说明书。所使用的胶回收试剂盒购自大连宝生物公司，使用方法均参考商品说明书。实施例1。从ThermococcussiculiHJ21克隆热稳定高温酸性a—淀粉酶基因。根据NCBI屮已报道的超嗜热古菌a-淀粉酶的雄闲序列设计引物，通过聚合酶链式反应的方法获得了ThermococcussiculiHJ21a—淀粉酶基因的保守序列，采用SiteFinding-PCR技术扩增获得ThermococcussiculiHJ21a—淀粉酶基因两端的序列。通过序列分析和拼接获得了i374bp完整的ThermococcussiculiHJ2ia-淀粉酶基因(见图丄)，其碱基序列如SEQIDNo.l所示，编码成熟肽的DNA的大小1374bp。实施例2。克隆质粒pM:D18-T-amy的构建。根据实施例l.得到的a-淀粉酶的基冈序列，设计正向引物1和反向引物2。在引物1加上EcoRI酶切位点，在引物2加上Sail酶切位点。引物l.序列5，GCGCGAATTCATGAACAGGGGTATAT-3'，划线部分为EcoRI位点。引物2序列5，-TAGTCGACTCAGCCCACCCCACAG-3,划线部分为SalI位点。以ThermococcussiculiHJ21基因组DNA为模板进行PCR扩增，结果如图1，扩增出的片段约1400'bp，与预测的结果一致。PCR产物电泳，利用TaKaRa公司GelExtractionKit试剂盒割胶回收纯化。与pMD18-T载体连接，构建了克隆质粒pMD18-Lamy(见图2)，转化大肠杆菌感受态细胞，通过蓝白菌落初步筛选阳性克隆，进一歩将重组质粒用EcoRI和SalI同时进行双酶切后电泳检领U，在1.4kb处"-条特异性亮带(见图3)，证明所选重组了为阳性克隆，与已经获得的淀粉酶基因序列对比表明序列完全正确。实施例3。表达载体pEt-28a-His6-amy的构建。重组T-载体(pMD18-T-amy)和pEt-28a-:ffis6分别进行EcoRI和SalI双酶切，其酶切反应体系(20PL)如下10XbufferH2uLEcoRI(或SalI)(l()U.u1uLpEt-28a-His6(或PCR产物)14uL将pMD18-T-amy进行EcoRI和SalI双酶切，胶回收1/lkb条带，对pEt-28a质粒进行EcoRI和SalI双酶切，胶回收5.6kb的条带；将前后两次胶回收产物混合，i6°C连接18h(如图4)，构建了N端含有A个组氨酸标签的表达载体pEt-28a-His6-amy。外源基因在E.coli表达吋，为'/简化表达产物的纯化步骤，通常添加His、M:BP等标签，使表达产物可以通过M-NTA层析柱纯化(Schliebenetal.，2004)。冈此在构建表达载体时在N端添加了:ffis。标签。重组质粒pEt-28a-扭s。-amy经EcoRI和SalI双酶切，电泳验证发现在1,4kb左右处出现一条亮带，证明軍:组i—F.确，见图5。实施例4。一种用于表达实施例1所述的热稳定高温酸性a-淀粉酶的基因工程菌株大肠埃希氏菌EHJ21(EscherichiacoliEHJ21)CGMCCNo.2157,它是将实施例3所述的表达载休pEt-28a-His6-amy转化到大肠杆菌E.coliB:L2i(:DE3)中得到的基因工程菌株大肠埃希氏菌EHJ21(EscherichiacoliEHJ21)CGMC:CNo2157。实施例5。-'种用实施例4所述的基因工程菌株大肠埃希氏菌EHJ21(EscherichiacoliEHJ21)CGMCCNo21.57产重组热稳定高温酸性a-淀粉酶的制备方法，其步骤如卜.，(1.)将棊因工程菌株以1%的接种量接入装有50mLLB培养某的25()mL三角瓶中，在37。C，180转/分下摇床培养，当培养菌液的ODe。。达到1.0时，再加入浓度为lmmolL-1诱导齐IJIPTG，诱导4h，得发酵液;(2)将发酵液i3000Xg离心5min后去掉上淸，用3m:L牛理盐水悬浮细胞，l:醫Xg离心5min去掉....匕清，重复此操作一次；用3mL蒸馏水充分悬浮细胞，()。C水浴中经超声波破碎5min,13000Xg离心10min取上淸液即得重组热稳定高温酸性a—淀粉酶的粗酶液；(3)将制取的粗酶液用80。C水浴中处理30min，13000Xg离心10min取上清液，再用DEAE离子交换层析和Ni亲和JS析的方法对至组酶进行纯化，即得。上述歩骤(3)采用加热处理、DEAE离子交换层析、Ni亲和层析的方法对重组酶的粗酶液进行了纯化(见表l)，在SDS-PAGE上a-淀粉酶的活性染色带与考马斯亮蓝染色带一致，其分子量为50KDa(见图6)。表1粗酶液的纯化<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>实施例6。实施例5所制得的重组热稳定高温酸性a-淀粉酶的酶学性质研究。[ooeo](1—)温度对酶活力的影响。将酶分别在50、60、70、80、85、90，95和IO(TC水浴中进行酶活测定。用pH5.0的乙酸钠溶液配置的1%(w，"淀粉溶液作为作用底物。至组a-淀粉酶的最适作用温度9CTC时，在95。C和100。C分别:"90%和70%的酶活力(见图7)。(2)pH对酶活力的影响。将酶液与在不同pH的i%(wv1)的可溶性淀粉溶液中在95T下进行酶活力测定。采用两种方法配制不同pH的lX(wv,的可溶性淀粉溶液，第一种方法为不同pH值的缓冲液为50mmol.L—1柠檬酸钠缓冲液(pH3.04.0);50mmo1L—1乙酸钠缓冲液(pH4.06.0);5()mmo1L-1磷酸钠缓冲液(pH6.07.5);5()腿01'L-'Tris-盐酸缓冲液(pH7,59,0)。第二种方法用各种不同pH的Britton-Robinson缓冲液(pH41l)(Rauenetal.，1964)。ig组a—淀粉酶的作j-tjpH范围为pH49，最适作用pH为5.5,在pH4.5和pH5.0分别闩、-f/81%和93%的相对酶活(见图8)。(3)温度对酶热稳定性的影响。将酶分别在80、90和iOO。C的水浴中保温进行温度对酶稳定性的实验，同时在每个温度下增加一组含有5mmo1L—1Ca21的酶液，用以验证该酶的热稳定性是否依赖Ca2+，每个温度保温5h,每隔l'h取出.'组样品，迅速置T冰水中，待保温结束后统.-进行酶活力测定，以未处理酶液作为对照。重组a-淀粉酶热稳定性好，酶液分别在80、90、100。C分别保温5h后，其残余活性分别为82%、77%和69%(见图9)。(4)pH对酶稳定性的影响。将酶液与不同pH的伯瑞坦-罗宾森(Britton-Robinson)缓冲液pH4.59混合，分别在8()、9()和l()()t:的水浴中保温lh后取测定残余酶活，以未处理的酶液的酶活设为丄00%。在不同pH的伯瑞坦-罗宾森缓冲液中分别在80、90和iOO。C处理丄'h，实验结果表明在8()"C和9()'C下该酶在pH59和pH58的范围内均有较好的稳定性，该酶在10(TC下pH稳定范围变窄，只在pH57.5范围内M示较好的稳定性。在三个温度下pH5.5稳定，pH5.0和pH6.0的稳定性也很好，相对酶活均在80%以l:，见图10。(5)金属离子或化学试剂对酶活性的影响。将各种金属离子与酶液混合，使其最终浓度分别达到1..()mmol■L—1和5.0mmo卜L入然后在9(TC下测酶活。将各种常用化学试剂与酶液混合，使其最终浓度分别为lmmol.U1和5mmo1.L—1测酶活，均以未处理的酶液的酶活设为100%。金属离了K+、Nai对酶有激活作用，Kg,Pb2+、Afi、Cu2+、Fe3+和Zi^等能够强烈的抑制酶活性(见表2)。lmmmol■L—1的尿素、碘乙酸、EDTA和DTT溶液对酶的抑制作用较弱，而lmmmol.:L"和5mmmo1.:L"NBS对酶的活性具有较强抑制作用(见表3)。表2金属离子对歪组热稳定高温酸性a-淀粉酶影响金属离子1mmolLT15mmolLT1MetalionCa2+97.5±3.481.2±3.6Co2+81.8±0.153.0±2.1Ba2+111.6±6.298.4±0.8Hg2+32.7±2.80.0±0.0IT116.2±0.497.1±2.1Pb2+0.0±0.00.0±0.0Mn2+46,6±0.68.1±0.0Ni+57,4±0.121.3±3.0Mg2+100.2±3.526.0±0.9Si>111.3±0.845.5±2.1Li+103.8±0.362.7±0.6Ag+Al3+112.0±0.2106.9±3.00±0.01.1±0.0Cu2+O士O.OO士O.ONa+102.6±0.3109.5±1.6Fe3+0.0±0.00.0±0.0Zn2+3.3±9.71.1±0.0表3化学试剂对重组热稳定高温酸性a-淀粉酶影响变性剂degenaration1mmolLT15mmol.LT尿素ureau95.0±0.17104.8±0.56SDS101.2±2.0374.9±1.83三氯乙酸TCA0.8±0.490碘乙酸Iodoaceticacid85.0±4.350EDTA67.9±2.8422.1±1.03N-溴代丁二酰亚胺O土O.O0±0.0(NBS)N-Bromosuccinimide二硫苏糖醇112.1±0.49106.1±5.26Drthiothreitol_(6)酶动力学研究。选择适当的nj溶性淀粉浓度梯度进行酶动力学研究，梯度为2、3、'1、5、8、丄0、15、20、30和40g.:L—'，反应休系为取i90uL不同浓度的淀粉溶液加入淀粉酶1()PL，于9()。C下准确反应1()min,取出If^迅速加入2()()uLDNS沸水浴5min，加入3mL蒸馏水，在520nm下测定吸光值。以fH浓度的可溶性淀粉作为底物，对重组的纯化淀粉酶进行酶动力学测定，根据Lineweaver-Burk理论，由方程V1=Km'Vmax1'S—i+Vmax1求得该酶的Km为45mg.m:L—1，Vmax为9.0mg.ml—1mn—:l(见图11)。(7)虚组热稳定高温酸性ci—淀粉酶水解产物特异性研究。以1%(w.v。的马铃薯淀粉作为底物，衬-ii升底物溶液中加入100UL稀释的酶液，置f9(rC水浴中，分别反应l、6、16和2他，取不同反应时间的产物进行高效薄层层析，展剂使用正丁醇、乙酸和水的混合物，显色剂为5%浓硫酸和乙醇溶液，使用喷雾器将显色剂均匀喷撒到千燥后的薄层板上，置于1()5。C下显色2()3()min。该重组超卨温a-淀粉酶可以很好的水解马铃薯淀粉，在作用lh后既已将马铃薯淀粉糊精化，继续反应后形成含麦芽糖在内的一系列寡糖，随着水解时间的延长糊精逐渐减少，麦芽寡糖含量逐渐升高，连续作用24h后层析图中未发现葡萄糖生成(见图12)，表明该重组a-淀粉酶分解马铃薯淀粉，其主要产物是麦芽糖和麦芽三糖。SEQIDNO.l<11()>淮海工学院<120>热稳定的高温酸性a-淀粉酶基因、工程菌、重组酶及应用<15()>2()()81()()21753.5<151>2008-08-12<160>1<170>:Patentnversion3,3<210>1<211>1862<212>DNA<2L3>ThermococcussiculiHJ2丄<4()()>1:0091]cgcgaaagctgcgagctgtgcgagaaggcaaagcgcgtcaagaatctcatcgaactctaa60:0092]cttttttcccactattgaaacacgacgttccattttcaacacttaatcccatgttctttt120:0093]acgtcctttoatg腺catto站g她Mgctto组站ttcaccgc伊gtg站站Mtot180:0094]gggcacgtgcccaaatagatacgtgggggattgccatgaacaggggtatattggcggcac24-0:0095]tggtgatagccctggttgtcttaagcgtctctgctgtccctgcaaaggccgagacccttg300:0096]aaaacggcggagtgataatgcaggccttctactgggacgtccccggtgggggaatctggt360:0097]gggacaccatagcccagaagataccagactgggcgagcgcaggaatttcggcaatatgga420:0098]ttccccccgcgagc牆gggc吨agcggcggctectccatgggctocgatccctocgact4-80:0099]acttcgacctcggcgagtactaccagaagggaaccgttgagacccgcttcggctccaagg540:0100]ccgagctggtgaacatgataaacaccgcccacgcctacaacatgaaggtcatagccgaca600:0101]tagtcatcaaccaccgcgccggcggagacctcgagtggaaccccttc魄aacgactaca660:0102]cctggaccgacttctccaaggttgcctccggcaagtocaccgccaactocctcgacttcc720:0103]acccgaacgagcttcacgcgggcgattccggaacctttggcggctatccggacatatgcc780:0104]acgacaagagctgggaccagtactggctctgggccagccaggagagctacgccgcctacc840:0105]tcaggagcatcggcgttgatgcctggcgcttcgactacgtgaagggctacggcgcttggg900:0106]tggtcaaggactggctcagctggtggggcggctgggcggtaggagagtactgggacacca960:0107]acgtcg吨ccctcctg堪ctgggcctocgac绍cggtgccaaggtcttcgacttcccgc1020:0108]tctactacaagatggacgaggccttcgataacaacaacattcccgcgctggtagatgccc1080<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>权利要求一种热稳定高温酸性α-淀粉酶基因，其特征在于，它具有序列表中的SEQIDNO.1所示的碱基序列。2.-浙热稳定高温酸性a-淀粉酶，其特征在T，它具有序列表中S:EQI::DNO.l所示的碱基序列编码的蛋白序列。3.--种碱基序列的表达载体，其特征在于，它是包括权利要求l所述的热稳定高温酸性a—淀粉酶基因的碱基序列的表达载体pEt-28a-His6-amy。4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，它由下列方法制得将权利要求l所述的热稳定高温酸性a-淀粉酶基因的碱基序列扩增，与质粒pMD18-T载体连接，得到克隆载休pMDi8-T-amy,再将克隆载休pM:Di8-T-amy和表达载休pEt-28a-His6分别经EcoRI和Sail双酶切后连接得到表达载体pEt-28a-ffis6-amy。5.-f巾用T表达权利耍求2所述的热稳定高温酸性a-淀粉酶的基因工程菌株大肠埃希氏茼EHJ21.(EscherichiacoliEHJ21)CGMCCNo.21.57，其特征在于，它是将权利要求3或4所述的表达载体pEt-28a-Hivamy转化到人肠杆菌E.coHBL21(DE3)中得到的基因工程菌株大肠埃希氏菌EHJ21(EscherichiacoliEHJ21)CGMC:CNo.2157。6.-—种用权利要求5所述的基因工程菌株大肠埃希氏菌EHJ21(EschericWacoliEHJ21)CGMCCNo.2157产重组热稳定高温酸性a-淀粉酶的制备方法，其特征在f,其步骤如(1)将基因工程齒株以1%的ft种一接入装有5()mLLB培养基的25()mL二角瓶中，在3rC，180转/分下摇床培养，当仏;'「茵液的CO,达到1.0时，再加入浓度为lmmol'L-1诱导剂IPTG，诱导4h，得发酵液；(2)将发酵液13000Xg离心5mfn后去掉上清，用3mL生理盐水悬浮细胞，13000Xg离心5min去掉上清，歪复此操作一次；用3mL蒸馏水充分悬浮细胞，()。C水浴屮经超声波破碎5min，13000Xg离心10min取上清液即得重组热稳定高温酸性a—淀粉酶的粗酶液；(3)将制取的粗酶液用80。C水浴中处理30min，i3000Xg离心i0min取上淸液，再用DEAE离子交换层析和Ni亲和层析的方法对重组酶进行纯化，即得。7.-'种如权利耍求6所述方法得到的重组热稳定高温酸性a-淀粉酶，其特征在丁-:该酶的分子量为50KD;适合作用温度9(rC，在95。C和l()(rC分别有9()%和70%的酶活力；该酶热稳定性不依赖于Ca2—，酶液分别在80、90、100"C保温5h后，其残余酶活分别为82%、77%和69%;该酶的作J1:jpH范围为pH4.9，适合作用pH为5.05.5，在pH4.5:"81X的残余酶活；在80。C和90i:下该酶在pH59和pH58的范围内稳定，该酶在10()lMh，pH57.5的范围内稳定；金属离了K—'—、Na+对酶有激活作用，Hg2+、Pb2+、Af丄、Cu2+、:Fe3+和Zn2丄能够抑制酶活性;丄mmmol-L-1和5mmmo1.L—'N-溴代丁二酰亚胺对酶的活性具有抑制作用；该酶的Km为45mg'mL—、Vmax为9mg'ml—1,in1;该酶分解马铃薯淀粉为麦芽糖和麦芽三糖。8.—种如权利要求7所述重组热稳定高温酸性a-淀粉酶在淀粉水解中的应用。全文摘要本发明公开了一种来自超嗜热古菌嗜热球菌(ThermococcussiculiHJ21)编码热稳定高温酸性α-淀粉酶基因，提供了该基因序列；提供了含有该基因序列的表达载体pEt-28a-His6-amy和表达该热稳定的高温酸性α-淀粉酶的基因工程菌株大肠埃希氏菌EHJ21(EscherichiacoliEHJ21)CGMCCNo.2157；本发明还提供了利用该基因工程菌株表达的重组热稳定高温酸性α-淀粉酶的制备方法及酶性质与应用。文档编号C12R1/01GK101691576SQ20091016337公开日2010年4月7日申请日期2009年8月13日优先权日2009年8月13日发明者刘姝,刘红飞,吕明生,房耀维,王淑军,秦松,陆兆新申请人:淮海工学院