专利名称：：一种以蛋白酶作为烟草加工辅助的酶制剂及制备、使用方法
技术领域：
：本发明属于烟草复烤前添加的提高烟草品级的酶制剂。
背景技术：
：蛋白酶作为蛋白质的水解酶，种类繁多，不同蛋白酶的性质和催化反应条件不同。姚光明研究了中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶对烟草中蛋白质的降解。得出①加蛋白酶后的烤烟烟叶，在一定温度下经过一定时间贮存烟叶中的蛋白质含量均有所降低；②3种蛋白酶对烤烟烟叶中蛋白质降解的效果并不相同，以中性蛋白酶降解的幅度最大，木瓜蛋白酶次之，碱性蛋白酶的降解幅度最小，③在河南B3F烤烟烟叶中，中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶的用量分别为120u/g、40u/g和80u/g时，烟叶中蛋白质的变化量最大；④中性蛋白酶的用量为120u/g，在45t:烟叶水分为25%、作用时间为4h的条件下，可降解烟叶中蛋白质12%左右；烟叶的燃吸质量得到明显改善。分别取河南B3F、山东X3F、贵州B3K烤烟和湖北中三白肋烟加人中性蛋白酶，作用时间结束后，制成巻烟样品送郑州烟草研究院进行评吸。评吸结果表明用中性蛋白酶处理过的烟叶香气质变好，香气量有所增大，杂气减轻，剌激性减小，余味变得较干净舒适，尤其是对白肋烟杂气的去除和苦辣味的消除效果更为明显。[姚光明。降低烟叶中蛋白质含量的研究。烟草科技，2000，(9):68]。工业化生产具有充足酶来源的蛋白酶，主要以福林-酚法测定。一般可用酶反应的最佳酶活显示的最佳pH值范围简单地划分为酸性、中性或碱性蛋白酶，pH69的一般可归在中性蛋白酶类，常见的有枯草孢杆菌Asl.398产生的蛋白酶pH5.59.5，测定标准中采用pH7.5，还有来源动植物组织pH8.0左右的胰蛋白酶和pH7的木瓜蛋白酶等[郭勇主编。酶工程。北京中国轻工业出版社，1994，p314317;杨叶昆，等。酪蛋白的酶促水解及其水解物的美拉德反应。食品科学，2003，24(4):104107]。由蛋白酶测定原理可知，福林(Folin)试剂(磷钨酸和磷钼酸的混合物)，在碱性条件下极不稳定，可被酚类化合物还原呈兰色反应(钨兰和钼兰混合物)。蛋白质及水解产物含酚基酪氨基酸、色氨酸和苯丙氨酸也有此反应。这些有酚基的氨基酸及其蛋白酶产物氨基酸是Maillard反应前体，Maillard反应产物的加香效果有①在适宜条件下，谷氨酸、半胱氨酸与葡萄糖生成的Maillard反应产物对烟丝的吸味有一定程度的改进和修饰作用，表现为减轻烟气的剌激性和杂气；②在其它条件相同的情况下，在反应原料里添加少量乙醛可使Maillard反应产物的加香效果增强，烟香增浓，杂气减轻；③以水代替多元醇作为反应溶剂，得到的Maillard反应产物虽然也有增香作用，但留香时间较短；④在相同反应条件下，谷氨酸与葡萄糖、蔗糖和木糖的反应产物加香效果各不相同，其中以与葡萄糖的反应产物对巻烟吸味的改善效果最好；⑤在相同反应条件下，葡萄糖与甘氨酸、丙氨酸、赖氨酸、谷氨酸和半胱氨酸的反应产物的增香效果亦不同，以与谷氨酸的反应产物的增香效果最好，可以明显改善低档巻烟的吸味[刘国珍，等。谷氨酸和葡萄糖的Maillard反应。烟草科技，2002，(10):3033]。杨叶昆等，以胰蛋白酶和木瓜蛋白酶水解酪蛋白，水解产物和糖在一定条件下进行美拉德反应制成新型非酶棕色化香料，具有浓郁的烤土豆香味。可应用于食品和烟草的加香[杨叶昆，等。酪蛋白的酶促水解及其水解物的美拉德反应。食品科学，2003，24(4):104107]。姚光明认为烟叶中蛋白质含量过高，燃吸时会产生如同燃烧羽毛的臭味，同时还会产生辛辣、苦涩的感觉。但是，烟叶中蛋白质的水解和进一步转化的产物又可以产生烟草的致香物质。因此，探索使烟叶中部分蛋白质酶解为一系列较小分子的含氮化合物，就可以有效地改善烟叶的燃吸质量，提高烟叶的使用价值[姚光明。降低烟叶中蛋白质含量的研究。烟草科技，2000，(9):68]。相关的专利文献中，"一种促进打叶复烤烟叶自然醇化的生物酶处理方法"[中国发明专利ZL02116594.7]，利用蛋白酶、果胶酶等生物酶来处理烟草，以降解烟草中的蛋白质和果胶，并配以生化反应促进剂丙酮酸、色氨酸、亮氨酸及金属离子Mn2+、Zn2+、Mg2+、K+来激活烟叶自身酶类活性。该发明所涉及的酶是多种水解酶混合的复合酶，且有非酶成份添加物。
发明内容鉴于蛋白酶水剂保存时间极短，不宜商品化，本发明目的是用中性蛋白酶制成酶活性可逆的钝化形式，即，酶以原蛋白无活性的特征稳定存在，并制备成浓縮的酶制剂，提供一种使烟叶中部分蛋白质酶解以改善烟叶质量的蛋白酶酶制剂。本发明的目的通过以下方式实现(—)本发明蛋白酶制剂本发明制剂的蛋白酶酶活力为3000040000U/mL。所述制剂蛋白酶为pH5.59.5的中性蛋白酶，最佳酶活力为36000U/mL。所述制剂使用EDTA以除去酶产生所需的活性中心离子，使蛋白酶酶活性呈可逆的纯化形式存在。所述制剂为浓縮的蛋白酶酶液，该浓縮酶液经恢复活性后在浓縮原液中相当于4(TC下测定的控制在3000040000U/mL之间的中性蛋白酶酶活力。(二)制备本发明酶制剂的方法(1)将微生物来源的中性蛋白酶作为粗品进行精制，S卩，将蛋白酶粗制品固体以缓冲液溶解，二者比例(W/V)为lg:(1020)mL，3500r/min离心20min，取上清液，加入(NH4)2S04使其在上清液中的终浓度为42%，静置12h后，4°C15000r/min离心30min，取上清液，补加浓度(W/V)为10%的(朋4)2504过夜，再一次4"15000r/min离心30min，收集沉淀、合并；(2)加EDTA使蛋白酶酶活性呈可逆的纯化形式，即，将(1)精制合并的沉淀用精制初始缓冲液用量的一半充分溶解后，用0.1%EDTA溶液补体积至原缓冲液体积，静置2h，离心，得到酶活性被钝化的上清液；步骤(2)进一步为在酶活性被钝化的上清液中加入浓度0.01%的蔗糖低聚物，上清液与蔗糖低聚物体积比为100mL:lmL，经-8t:冷冻干燥浓縮8IO倍得浓縮酶制剂。(三)使用本发明酶制剂的方法将蛋白酶的酶活力为3000040000U/mL制剂稀释250倍作为片烟复烤前的第二次润叶用水，其使用的蛋白酶酶活力范围为120160U/mL。4或进一步将36000U/mL的浓縮蛋白酶制剂稀释250倍作为片烟复烤前的第二次润叶用水，其使用的中性蛋白酶最佳酶活力为150U/mL。所述制剂以pH5.59.5的烟草作为适宜的处理对象。本发明中，EDTA名为乙二胺四乙酸二钠，是常用的络合剂。本发明中，微生物来源的中性蛋白酶和蛋白酶粗制品均可购买市售商品酶。以上制备酶制剂的缓冲液可选择Britton-Robinsion缓冲液，详见[印永嘉。大学化学手册。济南山东科学出版社，1985]配制方法。改进和调制成pH7.5的方法参照[刘士清，等。农业生物环境中基础酶技术研究法修建探讨。农机化研究，2008，(10):162166,175]使用。以上蛋白酶测定方法采用工业用液化型淀粉酶，糖化酶淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶质量标准(北京中华人民共和国轻工部，1980)。测定中性蛋白酶，测定温度为4(TC。测定钝化液和浓縮液中的酶活，需将被测定样品稀释成适宜的稀释倍数，稀释及测定所用的缓冲液中每lOOmL中需补加有0.3gCa(N03)2、0.3gMgS04和0.4gZnS04作为基本的酶稳定与激活剂，以释放酶活性本发明中关键的是将蛋白酶加入EDTA络合剂钝化，除去酶液中的金属离子，使浓縮原液中的蛋白酶以可逆的无活性状态形式稳定存在，用冰冻干燥法浓縮制备烟草活性添加剂，延长了浓縮原液的贮存期；将蛋白酶浓縮制剂用水稀释250倍替代片烟复烤时原有的第二润叶用水，使用简易，能够在片烟调制的实验研究中降低烟叶的蛋白质量，协调施木克值而提高烟草的一定品质，起到提高和改善烟草品级的作用。本发明也可以与其它烟草加工活性酶制剂配合使用，并作为其中的蛋白酶制剂部分，同时，本发明将成为申请人"一种烟草品质改善与提高的烟草加工活性复合酶制剂"的酶组分之一。图1是本发明酶制剂中性蛋白酶的制备与使用流程图。以下通过具体实施方式对本发明做进一步说明，但实施例并不作为对本发明其它实施方式的限制。具体实施例方式(—)本发明蛋白酶制剂的制备蛋白酶直接购买pH5.59.5枯草芽孢杆菌Asl.398发酵生产的中性蛋白酶。该蛋白酶pH值范围较宽，使制剂能够适宜不同pH值条件的烟草处理对象。将购买的粗制品酶固体用pH7.5Britton-Robinsion缓冲液充分溶解，粗制品酶固体与缓冲液比例(W/V)为lg:15mL，溶解后3500r/min离心20min，弃沉淀，取离心除去了菌体及填充物等杂质的上清液，加入W/V为42X的(NH4)2S04，自然室温下过夜或静置12h，然后4°C15000r/min离心30min，取上清液补加W/V鄉的(NH4)2S04过夜，再一次4°C15000r/min离心30min，将两次收集的沉淀合并后，用初始缓冲液用量的一半充分溶解，加入含0.1%EDTA等体积的缓冲液，静置2h，3500r/min离心20min，弃沉淀得到酶活性被钝化的上清液。以上清液体积V/V=100mL:lmL加入浓度0.01%的P-环糊精，经_8°C冷冻干燥浓縮8倍左右得浓縮酶制剂。出厂分装前勾对混合不同酶活的蛋白酶制剂，将成品酶活力控制在3000040000U/mL之间，最佳为36000U/mL。对于浓縮的蛋白酶制剂，经恢复活性后相当于4(TC下3000040000U/mL之间的中性蛋白酶酶活力。蛋白酶测定方法采用工业用液化型淀粉酶，糖化酶淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶质量标准(北京中华人民共和国轻工部，1980)及参照前述内容。使用时，将36000U/mL的浓縮蛋白酶制剂稀释250倍，使酶活力为150U/mL，作为pH5.59.5的片烟在复烤前的第二次润叶用水。(二)使用本发明蛋白酶制剂作为第二次润叶用水的结果以云85品种B2F(上橘二)等级为处理对象，在实验室条件下模拟烟叶片烟复烤醇化过程，考察活性添加剂浓縮酶制成品对醇化(自然发酵)前期的影响。成品制剂中性蛋白酶制剂用自来水代替第二次润叶用水作为辅助活性添加剂，对照用相同量的自来水作为润叶水。打叶、复烤后，各个包装500g烟叶，每个处理平行重复不少于3次，在相对湿度65%的室温下自然醇化60天，分别制成烟丝混匀，取样分析和巻成巻烟评吸。4批预成品各处理烟叶常规分析部分结果为<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>各处理所得结果与对照相比，主要的蛋白质下降8.93%17.70%，引起其它结果有变化，促使烟碱量有所下降。特别是烟叶的施木克值(可溶性总糖与蛋白质含量之比)上升，有趋向优质烟叶标准对施木克值2.02.5要求的现象。结果中以制成品蛋白酶活力在34260u/mL下施木克值较好。由于蛋白酶仅改善了部分单向品质特征，物质协调均衡较差。巻烟通过评吸评分总得分5159，仅比对照得分略高或相当。得分与对照相比表现为清香型香韵，香气质上升，香气量相同，杂气上升，浓度相同，剌激上升，劲头下降。从结果看，本发明有明显降低烟草蛋白酶含量的作用，利于改善烟叶品质施木克权利要求一种以蛋白酶作为烟草加工辅助的酶制剂，其特征是该制剂蛋白酶的酶活力为30000～40000U/mL。2.根据权利要求1所述的以蛋白酶作为烟草加工辅助的酶制剂，其特征是该制剂蛋白酶为pH5.59.5的中性蛋白酶，最佳酶活力为36000U/mL。3.根据权利要求1、2所述的以蛋白酶作为烟草加工辅助的酶制剂，其特征是该制剂中有EDTA以使蛋白酶酶活性呈可逆的纯化形式存在。4.根据权利要求1、2所述的以蛋白酶作为烟草加工辅助的酶制剂，其特征是该制剂为浓縮的蛋白酶酶液，该浓縮酶液经恢复活性后在浓縮原液中相当于4(TC下测定的控制在3000040000U/mL之间的中性蛋白酶酶活力。5.根据权利要求3所述的以蛋白酶作为烟草加工辅助的酶制剂，其特征是该制剂为浓縮的蛋白酶酶液，该浓縮酶液经恢复活性后在浓縮原液中相当于4(TC下测定的控制在3000040000U/mL之间的中性蛋白酶酶活力。6.制备如权利要求15所述的以蛋白酶作为烟草加工辅助的酶制剂的方法，其特征是(1)将微生物来源的中性蛋白酶作为粗品进行精制，B卩，将蛋白酶粗制品固体以缓冲液溶解，二者比例(W/V)为lg:(1020)mL，3500r/min离心20min，取上清液，加入(NH4)2S04使其在上清液中的终浓度为42%，静置12h后，4°C15000r/min离心30min，取上清液，补加浓度(W/V)为10%的(NH4)2S04过夜，再一次4。C15000r/min离心30min，收集沉淀、合并;(2)加EDTA使蛋白酶酶活性呈可逆的纯化形式，即，将(1)合并的沉淀用精制初始缓冲液用量的一半充分溶解后，用0.1%EDTA溶液补体积至原缓冲液体积，静置2h，离心，得到酶活性被钝化的上清液。7.根据权利要求6所述的制备以蛋白酶作为烟草加工辅助的酶制剂的方法，其特征是在步骤(2)获得的上清液中加入浓度0.01%的蔗糖低聚物，上清液与蔗糖低聚物体积比为100mL:lmL，经_8"冷冻干燥浓縮810倍得浓縮酶制剂。8.使用如权利要求15所述的以蛋白酶作为烟草加工辅助的酶制剂的方法，其特征是将蛋白酶的酶活力为3000040000U/mL制剂稀释250倍作为片烟复烤前的第二次润叶用水，其使用的蛋白酶酶活力范围为120160U/mL。9.根据权利要求8所述的使用以蛋白酶作为烟草加工辅助的酶制剂的方法，其特征是将36000U/mL浓縮蛋白酶制剂稀释250倍作为片烟复烤前的第二次润叶用水，其使用的中性蛋白酶最佳酶活力为150U/mL。10.根据权利要求8、9所述的以蛋白酶作为烟草加工辅助的酶制剂的使用方法，其特征是该制剂以PH5.59.5的烟草作为适宜的处理对象。全文摘要一种以蛋白酶作为烟草加工辅助的酶制剂及制备、使用方法，属于烟草复烤前添加的提高烟草品级的酶制剂。本发明将已知蛋白酶酶活力的酶源进行除杂精制，预先用EDTA络合剂除去酶液中的金属离子，使失去活性中心离子的酶以可逆酶活性的钝化不显示酶活力的状态存在，经浓缩得到制剂。本发明中性蛋白酶适应较宽pH范围的烟草处理对象，使用时用水稀释替代片烟复烤第二润叶用水，改善烟草品质。文档编号C12N9/50GK101787362SQ20091016327公开日2010年7月28日申请日期2009年12月30日优先权日2009年12月30日发明者何宝玉,陈应昆,韩伟申请人:云南万芳生物技术有限公司