专利名称：一种以葡萄糖氧化酶作为烟草加工辅助的酶制剂及制备、使用方法
技术领域：
本发明属于烟草复烤前添加的提高烟草品级的酶制剂。
背景技术：
葡萄糖氧化酶是一种能将葡萄糖催化氧化成葡萄糖酸和11202 (双氧水)的较普遍的生理性酶，普遍存在于动植物和微生物体内，可由微生物发酵生产获得。黑曲霉(Asperillus niger)和点青霉(Penicillium notat咖)是研究和制备葡萄糖氧化酶的常用菌种。因黑曲霉菌种产酶量高，工业化生产多采用黑曲霉。如，利用黑曲霉，经发酵、破碎细胞，得到胞内葡萄糖氧化酶，然后经超滤原液、硫酸铵盐析、DEAE-纤维素离子交换层析、S印hadexG-100凝胶过滤分离纯化[王志新，等。黑曲霉A9葡萄糖氧化酶的提取纯化。中国食品学报，2007， 7(1) :64 6S]。该酶在生理学研究中较为常见，广泛应用于临床医学中测定葡萄糖的研究。葡萄糖分析的酶系统中，应用较多的是葡萄糖氧化酶和过氧化物酶(P0D)偶联的双酶体系[江秀明，等。葡萄糖氧化酶-过氧化物酶偶联体系葡萄糖分析。郑州工程学院学报，2003，24(2) :85 S7。张宁，等。葡萄糖氧化酶——氧消耗速率法的方法学评价。泸州医学院学报，2002，25(4) :327 32S]。王志新等研究黑曲霉A9葡萄糖氧化酶的酶学性质，发现纯化所得的酶的分子量为138200Da，亚基的分子量为70210Da，小于报道的黑曲霉葡萄糖氧化酶的分子量150000Da左右，亚基各为80000。酶蛋白的最适pH接近中性，区别于报道的一般在5. 6 6. 0之间值，有较宽的pH稳定范围在pH40 8. 0。最适温度为3(TC，在5(TC条件下活性基本保持不变，6(TC下还保存有近50%的酶活力。酶不受EDTA、 SDS阻抑，而Cu2+、 Fe2+则表现稍微的抑制作用，Ca2+、 Na+、 Mg2+、 Zn2+等对酶有一定的激活作用[王志新，等。黑曲霉A9葡萄糖氧化酶的酶学性质研究。河北农业大学学报，2006,29(4) :69 72,83]。胡常英等也研究产葡萄糖氧化酶的青霉属的主要产酶菌株，以及点青霉HW2203葡萄糖氧化酶性质及应用特性，将酶活性单位定义为在26°C 、pH值5. 6条件下，每分钟催化释放一微克分子^02所需的酶量。酶活力测定采用邻-联(二)茴香胺分光光度法，即，在有氧存在条件下，葡萄糖氧化酶催化葡萄糖脱氢产生H202在过氧化物酶(POD)作用下氧供体邻_联(二 )茴香胺(DH2)被氧化成棕色产物。于460毫微米处测量吸光度的变化[胡常英，等。点青霉高产葡萄糖氧化酶菌株的诱变选育。河北省科学院学报，2006，23(3) :11 15 ;胡常英，等。点青霉HW2203葡萄糖氧化酶应用特性研究。生物学杂志，2008， 25(1) :31 34]。张茜等也同样研究青霉葡萄糖氧化酶的性质和分离纯化，酶催化葡萄糖氧化反应的最适pH为5. 6，最适温度为40°C，酶在pH5. 5 8. 5区间和温度低于5(TC下稳定，Al3+、Zn2+对酶有一定的激活作用[张茜，傅婉辉，康劲翮，陈清西，等。青霉葡萄糖氧化酶的分离纯化及性质研究。厦门大学学报(自然科学版)，2009,48(1) :99 102]。 河北省微生物研究所从上世纪80年代初，选用黑曲霉菌种研究、制备葡萄糖氧化酶精酶，供应临床检验葡萄糖含量的应用。之后，又陆续开发应用于啤酒、果汁果酒、面粉品质改善、海产品和肉类保鲜、饲料添等用途，并建立了葡萄糖氧化酶专业生产车间[胡常英，等。点青霉高产葡萄糖氧化酶菌株的诱变选育。河北省科学院学报，2006，23(3) :11 15]。李艳等总结为葡萄糖氧化酶是需氧脱氢酶，易溶于水，不溶于有机溶剂。工业生产多从黑曲霉中提取，广泛应用于食品、医药、饲料等行业中，起到了去除葡萄糖、脱氧、杀菌等作用。提取葡萄糖氧化酶GOX的纯化工艺为培养黑曲霉细胞一过滤留滤液一酸化至pH4. 0 4. 5 —离子交换柱分离一用缓冲液洗脱一离心一收集饱和的沉淀物一结晶一冷冻干燥一得到纯品。测定酶活性的方法主要有分光光度法、荧光法、电化学法等。测定过程中的影响
因素主要有温度、PH值、供氧量等。高纯度的葡萄糖氧化酶为淡黄色晶体，易溶于水，不溶
于乙醚、氯仿、甘油等。葡萄糖氧化酶的最大光吸收波长A腿x为377nm和455nm。在紫外光下无荧光，但是在热、酸或碱处理后具有特殊的绿色。葡萄糖氧化酶稳定的PH值范围为3. 5 6. 5，作用温度一般为30°C 60°C 。固体酶制剂在(TC下保存至少稳定两年，在-15°C下可以稳定8年。葡萄糖氧化酶反应机理通常与过氧化氢酶组成一个氧化还原酶系统。葡萄糖氧化酶在分子氧存在下能氧化葡萄糖生成D-葡萄糖酸内酯，同时消耗氧生成过氧化氢。过氧化氢酶能够将过氧化氢分解生成水和1/2氧，而后水又与葡萄糖酸内酯结合产生葡萄糖酸[李艳，等。葡萄糖氧化酶及其应用。食品工程，2006， (3) :9 11]。
葡萄糖氧化酶的酶活力测定方法有，用过量NaOH中和产物葡萄糖酸，用HC1滴定过量NaOH。酶活力单位定义为每分钟催化葡萄糖氧化生成1 P mol葡萄糖酸的酶量为1个单位(U)[郭勇，主编。酶工程。北京中国轻工业出版社，1994，p325 326]。葡萄糖氧化酶测定的原理依据是选择性地将葡萄糖氧化，定量产生葡萄糖酸和H202，利用产物的可定量测定性进一步衡量葡萄糖氧化酶活力，因为H202在POD的催化下与联二茴香胺、或4-氨基安替比林_苯酚、或a -萘酚-|3 -磺酸钾等定量生成有色化合物，在一定波长下比色测定生成的^02可用于确定衡量葡萄糖氧化酶[江秀明，等。葡萄糖氧化酶_过氧化物酶偶联体系葡萄糖分析]。无论前述的测定法，或是采用邻_联(二 )茴香胺分光光度法，以及其他改进方法，都是针对产物的量来衡量酶活力的方法。
发明内容
本发明目的是不改变片烟调制操作的原有工艺，即在新鲜烟草烘烤后，在复烤前的加工过程中利用葡萄糖氧化酶酶制剂，降低烟叶中糖含量而达到工业化生产中提高烟草品质的效果。 本发明另一目的是结合葡萄糖氧化酶酶制剂制备工艺提出一种测定酶活力的方法，以满足工业化生产产品的稳定性和可靠性。
本发明的目的通过以下方式实现 以葡萄糖氧化酶作为烟草加工辅助添加的酶制剂，该制剂葡萄糖氧化酶具有氧化-还原催化反应降低烟叶中糖含量的作用，其制剂酶活力为10000 15000U/mL。
所述制剂葡萄糖氧化酶的最佳酶活力为12000U/mL。
制备本发明酶制剂的方法 该制剂具有氧化还原催化反应的葡萄糖氧化酶，其酶活力为10000 15000U/mL。 所述制剂葡萄糖氧化酶的酶活力为12000U/mL。 所述制剂中有PMSF抑制蛋白酶活性，避免其破坏葡萄糖氧化酶。
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—种制备葡萄糖氧化酶作为烟草加工的辅助酶制剂的方法，包括以下步骤 (1)取葡萄糖氧化酶粗品固体或液体加入含有浓度为0. lmol/L蛋白酶抑制剂
PMSF的缓冲液溶解或稀释，葡萄糖氧化酶粗品与含有PMSF缓冲液的配比为lg : 20mL或
为lmL : 10mL，3500r/min离心20min，取上清液，加入(NH4) 2S04，使硫酸铵终浓度为55% ，
静置24h，然后4。C 15000r/min离心30min，取上清液，补加浓度为10% (W/V)的(NH4)2S04
过夜，再4°C 15000r/min离心30min，收集沉淀、合并； 上述葡萄糖氧化酶粗品为微生物来源的未精制的葡萄糖氧化酶 (2)检测沉淀中葡萄糖氧化酶的酶活力，加入浓度0. 0001%的蔗糖低聚物液调制
为酶原液，使其酶活力为10000 15000U/mL，最佳为12000U/mL。 本发明中，微生物来源的葡萄糖氧化酶粗制品可购买市售商品酶产品或用相应的产葡萄糖氧化酶微生物菌株发酵生产获得。 以上为精制原液制成本发明酶制剂的过程，所用的Britton-Robinsion缓冲液详见[印永嘉。大学化学手册。济南山东科学出版社，1985]配制方法。改进和调制成pH5. 6的方法参照[刘士清，等。农业生物环境中基础酶技术研究法修建探讨。农机化研究，2008，(10) :162 166， 175]使用。 本发明还提供了一种以被催化氧化反应的底物衡量葡萄糖氧化酶酶活力的的方法，具体是 用3， 5- 二硝基水杨酸(DNS)显色，0D54Qnm分析进行葡萄糖定量测定； 以温度3(TC和pH5. 6条件下1. 0000mg/mL浓度葡萄糖标准底物液中每分钟被氧化
减少1 P g葡萄糖所需的酶量为1U，酶样品表示为U/mL或U/g。 所述的测定方法进一步为将需检样品稀释成适宜酶测定的稀释倍数，所用缓冲液每100mL中补加0. 3g Ca(N03)2和0. 3g MgS04作为基本的酶稳定与激活剂，在检测中增强酶活性，并计算检测结果。 葡萄糖定量测定过程详见[李合生，等。植物生理生化实验原理和技术。北京高等教育出版社，2000， p197 199 ;刘士清，等。农业生物环境中基础酶技术研究法修建探讨。农机化研究，2008， (10) :162 166， 175]。 应用上述的葡萄糖氧化酶作为烟草加工辅助酶制剂的方法 将葡萄糖氧化酶原液制剂稀释250倍作为片烟复烤前的第二次润叶用水，其酶活力范围为40 60U/mL。 所述的应用方法进一步是将浓縮葡萄糖氧化酶制剂稀释后作为片烟复烤前的第二次润叶用水，其最佳酶活力为48U/mL。 在以上内容中，对于市售的商品酶制剂，应尽量选择食品级酶源，进行精制除杂即
可，而不必购买医用级酶源。 本发明具有下述积极效果 葡萄糖氧化酶保存条件适宜时，本身就具有较好的稳定性。在产品的质量控制检测中，本发明以底物葡萄糖测定的DNS法测定葡萄糖氧化酶方法来衡量制剂的葡萄糖氧化酶活力。 选用食品级的葡萄糖氧化酶其目的在于能够保留来源微生物酶系中对糖有作用的酶。
本发明也可以与其它烟草加工活性酶制剂配合使用，并作为其中的葡萄糖氧化酶制剂部分。同时，本发明也可作为申请人"一种烟草品质改善与提高的烟草加工活性复合酶制剂"的酶组分之一。
图1为本发明葡萄糖氧化酶制剂制备工艺流程示意图。 以下结合附图并通过具体实施方式
对本发明做进一步说明，但实施例并不作为对本发明其它实施方式的限制。
具体实施例方式( — )本发明制剂的制备及测定方法 葡萄糖氧化酶可直接购买微生物发酵的产品。或者自行利用相应产葡萄糖氧化酶菌株发酵产生，通过破细胞壁释放和收集发酵初步提取等得到粗制品。然后，以本发明方法进行精制、提取最主要是能达到食品级的酶，并抑制蛋白酶对葡萄糖氧化酶的破坏。
将葡萄糖氧化酶作为粗品进行精制是将葡萄糖氧化酶粗制品固体以W/V二lg : 20mL或液体W/V = lmL : 10mL比例，加入含有浓度为0. lmol/L蛋白酶抑制剂PMSF的缓冲液溶解或稀释，3500r/min离心20min，取上清液，加入(NH4)2S04，使硫酸铵终浓度为55%，静置24h，然后4°C 15000r/min离心30min，取上清液，补加浓度为10% (W/V)的(NH4)2S04过夜，再4°C 15000r/min离心30min，收集沉淀、合并；检测葡萄糖氧化酶的酶活力，然后用适量的加有0. 0001%的蔗糖低聚物液调制为10000 15000U/mL的酶原液，最佳调制为12000U/mL的酶原液。成品一般为酶活力10000 15000U/mL的葡萄糖氧化酶制剂。 可进一步将所得的酶原液通过-8t:冷冻干燥浓縮8 10倍获得浓縮复合酶制剂。
以上成品葡萄糖氧化酶活力测定方法采用本发明在发明内容中上所提出的葡萄糖氧化酶测定方法是用3，5-二硝基水杨酸(DNS)显色，0D54。 分析进行葡萄糖定量测定；以温度3(TC和pH5. 6条件下1. OOOOmg/mL浓度葡萄糖标准底物液中每分钟被氧化减少1 P g葡萄糖所需的酶量为1U，酶样品表示为U/mL或U/g。 在测定过程中，在需检样品稀释成适宜酶测定的稀释倍数后，将所用缓冲液每100mL中补加0. 3g Ca(N03)2和0. 3g MgS04作为基本的酶稳定与激活剂。
使用时，将葡萄糖氧化酶制剂稀释250倍作为片烟复烤前的第二次润叶用水，其葡萄糖氧化酶酶活力范围为40 60U/mL。 葡萄糖氧化酶最佳酶活力为48U/mL，因此，以12000U/mL的浓縮葡萄糖氧化酶制剂稀释250倍作为片烟复烤前的第二次润叶用水，
( 二 )本发明模拟烟叶片烟复烤醇化的效果 在实验室条件下模拟烟叶片烟复烤醇化过程，考察活性添加剂浓縮酶制成品对醇化(自然发酵)前期的影响。成品制剂中性葡萄糖氧化酶制剂用自来水代替第二次润叶用水作为辅助活性添加剂，对照用相同量的自来水作为润叶水。打叶、复烤后，各个包装500g烟叶，每个处理平行重复不少于3次，在相对湿度65%的室温下自然醇化60天，分别制成烟丝混匀，取样分析和巻成巻烟评吸。
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常规分析结果对去85上部烟叶总糖降低5%左右，还原糖降低3%左右，对中部烟叶的总糖和还原糖均可下降2%左右，对下部烟叶的总糖和还原糖下降与中部烟叶的总糖和还原糖下降率相当。由于糖的变化也引起了其他指标成分的变化，对蛋白质无影响，特别造成了施木克值较大变化。 对于葡萄糖氧化酶的单一使用，从评吸结果来看，通过对糖下降不是消耗性降解，而是氧化-还原反应的转化，因此对品质的改善虽然评分项少，但总体上较对照烟叶品质较为圆孰、细腻，反映出对协调物质变化有一定均衡作用。
权利要求
一种以葡萄糖氧化酶作为烟草加工辅助的酶制剂，其特征是该制剂具有氧化还原催化反应的葡萄糖氧化酶，其酶活力为10000～15000U/mL。
2. 根据权利要求1所述的以葡萄糖氧化酶作为烟草加工辅助的酶制剂，其特征是该制剂葡萄糖氧化酶的酶活力为12000U/mL。
3. 根据权利要求1，2所述的以葡萄糖氧化酶作为烟草加工辅助的酶制剂，其特征是该制剂有PMSF抑制蛋白酶活性，避免破坏葡萄糖氧化酶。
4. 一种制备权利要求1 3所述的葡萄糖氧化酶作为烟草加工的辅助的酶制剂的方法，包括以下步骤(1) 取葡萄糖氧化酶粗品固体或液体加入含有浓度为O. lmol/L蛋白酶抑制剂PMSF的缓冲液溶解或稀释，葡萄糖氧化酶粗品与含有PMSF的缓冲液配比为lg : 20mL或为lmL : 10mL， 3500r/min离心20min，取上清液，加入(NH4) 2S04，使硫酸铵终浓度为55 % ，静置24h后4。C 15000r/min离心30min，取上清液，补加浓度为10% (W/V)的(朋4)2504过夜，再4°C 15000r/min离心30min，收集沉淀、合并；上述葡萄糖氧化酶粗品为微生物来源的未精制的葡萄糖氧化酶(2) 检测沉淀中葡萄糖氧化酶的酶活力，加入浓度0. 0001%的蔗糖低聚物液调制为酶原液，使其酶活力为10000 15000U/mL，最佳为12000U/mL。
5. 根据权利要求4所述的一种制备葡萄糖氧化酶制剂的方法，其特征是将步骤(2)所得的酶原液，经-8t:冷冻干燥浓縮8 10倍获得浓縮复合酶制剂。
6. —种葡萄糖氧化酶酶活力的测定方法，其特征是用3， 5- 二硝基水杨酸(DNS)显色，0D54Qnm分析进行葡萄糖定量测定；以温度3(TC和pH5. 6条件下1. 0000mg/mL浓度葡萄糖标准底物液中每分钟被氧化减少1 P g葡萄糖所需的酶量为1U，酶样品表示为U/mL或U/g。
7. 根据权利要求6所述的葡萄糖氧化酶酶活力的测定方法，其特征是将需检样品稀释成适宜酶测定的稀释倍数，所用缓冲液每100mL中补加0. 3gCa(N03)2和0. 3g MgS04作为基本的酶稳定与激活剂。
8. 使用权利要求l 3所述的葡萄糖氧化酶作为烟草加工辅助酶制剂的方法，其特征是将葡萄糖氧化酶原液稀释250倍作为片烟复烤前的第二次润叶用水，其酶活力范围为40 60U/mL。
9. 根据权利要求8所述的使用葡萄糖氧化酶作为烟草加工辅助酶制剂的方法，其特征是将浓縮葡萄糖氧化酶制剂稀释后作为片烟复烤前的第二次润叶用水，其最佳酶活力为48U/mL。
全文摘要
一种以葡萄糖氧化酶作为烟草加工辅助的酶制剂及制备、使用方法，属于烟草复烤前添加的提高烟草品级的酶制剂。本发明将已知葡萄糖氧化酶酶源进行除杂精制，以PMSF抑制蛋白酶活性，以精制获得的沉淀用0.0001％的蔗糖低聚物液调制为10000～15000U/mL的酶原液，最佳调制为12000U/mL的酶原液成为烟草活性添加剂，使用时用水稀释替代片烟复烤时原有的第二润叶用水，能较好降解烟草中的糖含量单一指标，有协调均衡各物质变化提高烟草品质的作用。
文档编号C12Q1/26GK101785578SQ20101003916
公开日2010年7月28日 申请日期2010年1月14日 优先权日2010年1月14日
发明者何宝玉, 陈应昆, 韩伟 申请人:云南万芳生物技术有限公司