专利名称：：Leber遗传性视神经病变线粒体DNA原发突变G3635A的快速检测方法
技术领域：
：本发明涉及一种Leber遗传性视神经病变线粒体DNA原发突变G3635A的快速检测方法，属Leber遗传性视神经病变研究
技术领域：
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背景技术：
：Leber遗传性视神经病变(Leberhereditaryopticneuropathy,LHON;MM535000)是由线粒体DNA突变所导致的致盲性母系遗传性疾病，主要多发于青壮年男性，并且存在疾病不完全外显现象，即含有线粒体DNA原发突变的个体也不一定会临床发病。基于欧洲西部人群的调查研究发现，每25，000-50，000人中就有一例LHON患者；亚洲人群中目前还没有相关的临床调查资料。前人研究表明，95%以上的LHON是由线粒体DNA的三个点突变G11778A、G3460A、T14484C中的一种引起的。基于这三个原发突变的基因检测是目前临床上对该病确诊的一种重要的手段。欧亚病人群体中，这三种原发突变的分布情况差别很大，提示原发突变谱在欧亚人群中迥异。针对临床上大量的疑似LHON病例的研究，有望拓展国人LHON原发突变的名录，为临床遗传诊断和咨询服务。Jia等人2006年对国人群体中903个有LHON临床症状的患者检测发现，有557个患者没有检测到上述三个原发突变中的任何一个，提示国人群体中存在新的有待证实和发现的线粒体DNA原发突变。Brown等人2001年在一个不含有三个主要的原发突变的俄罗斯LHON家系中发现，线粒体DNA突变G3635A是其发病的原因。该突变导致线粒体呼吸链复合物INADH脱氢酶ND1亚基第110位高度保守的丝氨酸转变成天冬酰胺，从而使呼吸链功能受损。G3635A突变被首次报道后，一直未见相关的后续研究和报道来证实该突变的致病性。近期，我们在一个有LHON临床症状却没有携带三个原发突变的国人家系中也检测到G3635A突变，二级结构预测分析显示该突变减弱了ND1蛋白的疏水性，这种结构上的改变或许会进而引发LHON。Yang等人几乎同时在另外两个疑似LHON但无三个原发突变的国人家系中也发现了G3635A突变。我们未发表数据显示，G3635A突变在表现LHON临床症状的国入患者群体中出现的频率达到1%。这些研究证实了G3635A是国人群体中LHON发病的一个重要的致病性突变。目前，对于LHON尚无有效的治疗方法。以分子遗传学检测方法对该病进行遗传研究在一定程度上能预防该病的发生。因此，对于基因检测未发现有G11778A、G3460A、T14484C三个主要原发突变的LH0N患者家系进行G3635A突变检测，无疑对于该病的遗传研究、遗传咨询和预防具有重要的意义。目前公开的与本发明相似的检测线粒体DNA突变G3635A的申请专利有一个，其名称为"Leber氏遗传性视神经病变相关mtDNA突变位点集成检测基因芯片及其制备与应用"，申请号200810204771.7，该发明所用方法为基因芯片技术，该方法对仪器设备的要求很高，且成本较高，不适合在常规的实验室推广使用。现有很多其他检测DNA突变的技术，如单链构象多态性分析(SSCP)、变性高效液相色谱(DHPLC)、等位基因特异PCR等。其中，等位基因特异PCR(Allele-specificPCR，AS-PCR)由于其经济、快速、简易的特点被广泛应用到各种DNA突变检测工作中。等位基因特异PCR的原理是将引物3'末端设计成突变特异的碱基，配合适当的反向引物，有突变的DNA因3'末端与引物配对从而扩增得到突变特异的PCR产物，而无突变的DNA模板不能与突变特异性引物配对，从而不能扩增得到PCR产物。通过常规的琼脂糖电泳检测PCR产物的有无，进而来判断检测样本DNA是否存在突变。经文献检索，未见与本发明方法相同的公开报道。
发明内容本发明的目的在于提供一种快速、简易、经济的Leber遗传性视神经病变线粒体DNA原发突变G3635A的快速检测方法。本发明基于AS-PCR的原理，将突变特异的引物3'端第一位设计成T碱基(见表1，H3635)，用于扩增突变型DNA;在引物3'端第四位引入一个错配碱基(碱基A突变成碱基T，形成T/T错配)，增强引物对于突变位点的特异性；在线粒体DNA序列上远离G3635A突变的一个区段，即1138-1782区域，设计了一对内参引物(见表1，L1156/H1782)，用于监测PCR扩增反应体系中是否存在标本DNA及反应体系是否合适。采用上述两对引物(L3179/H3635和L1156/H1782)，在单个PCR反应中对待测标本DNA样品进行扩增。无论检测的标本DNA是否含有G3635A突变，内参引物L1156/H1782都会得到扩增，这样就能避免由于PCR失败而造成的G3635A突变假阴性的结果。PCR扩增产物经琼脂糖电泳检测，依据突变特异的电泳图谱对G3635A突变进行基因分型，实现基因突变的快速检测。由于线粒体DNA突变具有异质性，即突变的与正常的线粒体DNA同时共存的现象，如果检测方法的灵敏度不够高，则很有可能在有突变异质性的患者个体中检不到突变，从而导致假阴性结果。本发明通过将正常人与含有G3635A突变的病人的DNA样品按不同比例混合，进行AS-PCR，以检测本技术方法的灵敏度，并提供本技术检测到的最低水平的突变DNA的技术参数。本发明利用等位基因特异PCR(Allele-specificPCR，AS-PCR)方法检测Leber遗传性视神经病变线粒体DNA原发突变G3635A，具体步骤如下(l)DNA提取使用常规酚/氯仿法从临床样本中提取基因组DNA。(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，进行PCR反应。PCR反应引物扩增引物序列及产物大小见表1表lAS-PCR所用引物组成、序列及产物大小<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>PCR反应体系总体系为20iiL，包含50ng基因组DNA，10mMTris-HCl(pH8.3)，1.5mMMgCl2，50mMKCl，O.5UTaKaRarTaq，175yMdNTP，突变特异引物L3179和H3635各0.15iiM，内参引物L1156和H1782各0.075iiM。PCR反应程序94。C，预变性5min;94。C变性30s，60。C退火30s，72。C延伸30s，重复30个循环；72。C延伸7min。(3)PCR产物检测取PCR产物2iiL在1.5%的琼脂糖凝胶上电泳，电泳缓冲液为1XTAE，130V恒压电泳30min，溴化乙啶染色5min，凝胶成像系统下观察拍照。(4)灵敏度检测能检到的最低水平的突变DNA的浓度以lng、2.5ng、5ng、10ng的含有G3635A突变的DNA为模板，用与步骤(2)和(3)相同的PCR反应体系和程序扩增并检测；能检到的最低水平的突变异质性将正常人DNA样本与含有G3635A突变的患者DNA样本在总量为50ng的情况下按设定比例混合，使突变的DNA样本比例分别为5%、10%、15%和20%，将混合好的DNA模板按照与步骤(2)和(3)相同的PCR反应体系和程序扩增并检测。本发明与现有技术相比，具有快速、简单、经济、准确、灵敏的特点，仪器设备要求不高，适合于在大规模的临床样本检测中推广应用。本发明对于Leber遗传性视神经病变的遗传研究及咨询具有重要的意义。图1为用本发明方法进行等位基因特异PCR检测LHON线粒体原发突变G3635A的电泳图谱。图2为本发明方法的灵敏度检测电泳图谱。具体实施方案1、引物设计根据线粒体DNAG3635A突变，将突变特异的引物3'端第一位设计成T碱基(见表1，H3635)，用于扩增突变型DNA，同时在引物3'端第四位引入一个错配碱基(碱基A突变成碱基T，形成T/T错配)，以增强引物对于突变位点的特异性，在上游设计另一个引物(表l，L3179)，和突变特异性引物一起扩增出一条496bp的突变特异的片段。同时，在线粒体DNA1138-1782区段设计了一对内参引物(见表1，L1156/H1782)，无论有无G3635A突变，内参引物都能扩增得到一条664bp的片段。引物由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列及产物大小见表l。2、样本采集采集5例经过DNA序列测定证实携带有G3635A突变的DNA样本和4例正常人全血样本。3、样品基因组DNA提取使用酚/氯仿法提取全血样本中基因组DNA。4、PCR扩增PCR反应体系总体系为20iiL，包含50ng基因组DNA，10mMTris-HCl(pH8.3)，1.5mMMgCl2，50mMKCl，O.5UTaKaRarTaq，175yMdNTP，突变特异引物L3179和H3635各0.15iiM，内参引物L1156和H1782各0.075iiM。PCR反应程序94。C，预变性5min;94。C变性30s，60。C退火30s，72。C延伸30s，重复30个循环；72。C延伸7min。5、PCR产物检测PCR产物检测取PCR产物2iiL在1.5%的琼脂糖凝胶上电泳，电泳缓冲液为1XTAE，130V恒压电泳30min，溴化乙啶染色5min，凝胶成像系统下观察拍照。6、灵敏度检测能检到的最低水平的突变DNA浓度以lng、2.5ng、5ng和10ng的含有G3635A突变的DNA为模板，用与步骤4和5相同的PCR反应体系和程序扩增并检测；能检到的最低水平的突变异质性将正常人DNA样本与含有G3635A突变的患者DNA样本在保持总量为50ng模板DNA的情况下按一定比例混合，使突变的DNA样本比例分别为5%、10%、15%和20%，将混合好的DNA模板用与步骤4和5相同的PCR反应体系和程序扩增并检测。用本发明方法进行等位基因特异PCR检测LHON线粒体突变G3635A的电泳结果(见图1)。其中泳道1为未加DNA模板进行PCR扩增的阴性对照，泳道2-5为无G3536A突变的正常人DNA样本扩增结果，泳道6-10为有G3635A突变的LHON患者DNA样本扩增结果，泳道M为50bp的核酸分子量标准。图中664bp的条带为内参条带，除了阴性对照外，所有的检测样本都有此条带，表明PCR体系和条件合适，扩增成功；496bp的条带为突变特异条带，只有G3635A突变存在的样本才会扩增出此条带。本发明方法的灵敏度检测结果(见图2)。其中泳道1为未加DNA模板进行PCR扩增的阴性对照；泳道2-5分别为以lng、2.5ng、5ng和10ng含有G3635A突变的DNA为模板进行扩增的结果；泳道6-9为突变的与正常的DNA在总量为50ng模板DNA的情况下混合，使突变的DNA比例分别为5%、10%、15%和20%，再进行扩增的结果；泳道10为含有G3635A突变的LHON患者DNA样本扩增结果；泳道M为50bp的核酸分子量标准。如图所示，本发明提供的实验条件最少可以采用2.5ng的DNA为模板进行有效的扩增检测。在DNA模板总量为50ng的情况下，本发明可以检测到低至5-10%的G3635A突变的异质性水平。序列表〈110〉中国科学院昆明动物研究所〈120〉Leber遗传性视神经病变线粒体DNA原发突变G3635A的快速检测技术〈130〉说明书〈160>4〈170>PatentInversion3.3〈210>1<211〉20〈212>DNA〈213〉人工合成〈220>〈221>primer_bind〈222>(1)..(20)〈223〉引物L3179〈400>1agcgccttcccccgtaaatg〈210>2〈211>21<212〉DNA〈213〉人工合成〈220〉〈221>primer—bind<222〉(1)..(21)〈223〉引物H3635〈400>2ggattgagtaaacggcttggt〈210>3〈211>19〈212>DNA〈213>人工合成〈220〉〈221>primer_bind〈222>(1)..(19)〈223〉引物L1156〈400>3g朋cactecg3gccac3gc〈210>4<211〉22〈212>DNA〈213〉人工合成〈220〉〈221〉primer_bind〈222〉(1).(22)〈223〉引物H1782〈400>4ctgttaaaagtgcataccgcca2权利要求一种Leber遗传性视神经病变线粒体DNA原发突变G3635A的快速检测方法，包括基因组DNA提取、引物设计、PCR扩增、电泳检测步骤，其特征在于本方法的具体步骤如下(1)使用常规酚/氯仿法从临床样本中提取基因组DNA；(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，进行PCR反应，PCR反应引物为PCR反应体系总体系为20μL，包含50ng基因组DNA，PH为8.3的10mMTris-HCl，1.5mMMgCl2，50mMKCl，0.5UTaKaRarTaq，175μMdNTP，突变特异引物L3179和H3635各0.15μM，内参引物L1156和H1782各0.075μM；PCR反应程序94℃，预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，重复30个循环；72℃延伸7min；(3)PCR产物检测取PCR产物2μL在1.5％的琼脂糖凝胶上电泳，电泳缓冲液为1×TAE，130V恒压电泳30min，溴化乙啶染色5min，凝胶成像系统下观察拍照；(4)灵敏度检测能检到的最低水平的突变DNA的浓度以1ng、2.5ng、5ng、10ng的含有G3635A突变的DNA为模板，用与步骤(2)和(3)相同的PCR反应体系和程序扩增并检测；能检到的最低水平的突变异质性将正常人DNA样本与含有G3635A突变的患者DNA样本在总量为50ng的情况下按设定比例混合，使突变的DNA样本比例分别为5％、10％、15％和20％，将混合好的DNA模板按照与步骤(2)和(3)相同的PCR反应体系和程序扩增并检测。全文摘要本发明涉及一种Leber遗传性视神经病变线粒体DNA原发突变G3635A的快速检测方法，属Leber遗传性视神经病变研究
技术领域：
。本发明基于AS-PCR的原理，将突变特异的引物3′端第一位设计成T碱基H3635，同时在引物3′端第四位引入一个错配碱基(碱基A突变成碱基T，形成T/T错配)，在线粒体DNA序列的1138-1782区域，设计一对内参引物L1156/H1782。采用上述两对引物(L3179/H3635和L1156/H1782)，在单个PCR反应中对待测标本DNA样品进行扩增。PCR扩增产物经琼脂糖电泳检测，依据突变特异的电泳图谱对G3635A突变进行基因分型，实现基因的快速检测。本发明具有简单、快速、经济、灵敏的特点。本发明对于Leber遗传性视神经病变的遗传研究及咨询具有重要的意义。文档编号C12Q1/68GK101781683SQ20101003916公开日2010年7月21日申请日期2010年1月14日优先权日2010年1月14日发明者姚永刚,毕蕊申请人:中国科学院昆明动物研究所