用于治疗青光眼性视网膜病变及眼病的JunN端激酶抑制剂的制作方法

专利名称：用于治疗青光眼性视网膜病变及眼病的JunN端激酶抑制剂的制作方法
背景技术：
1.发明领域本发明主要涉及视神经保护，更具体地涉及Jun N端激酶(JNK)抑制剂在治疗青光眼性视网膜病变及其他眼病中的用途。
2.相关领域描述眼的许多病理学改变，例如青光眼、急性缺血性视神经病变、黄斑变性、色素性视网膜炎、视网膜脱离、视网膜破裂或裂孔，以及其他缺血性视网膜病变或视神经病变，会引起导致视力损失的视网膜神经损伤或死亡。例如，原发性开角型青光眼(POAG)是导致视神经损伤并最终失明的进行性疾病。该病的原因经过了多年广泛研究，但仍未得到充分理解。青光眼导致视网膜和视神经的神经元变性。即使在最佳医学护理和手术治疗下，该病仍然伴有视网膜神经节细胞(RGC)的逐渐损失，引起视觉功能的下降(Van Buskirk等人，(1993)；Schumer等人，(1994))。
眼内压(IOP)的异常增加是青光眼的主要危险因素。目前，对于青光眼唯一可用的治疗是通过药物或手术降低IOP。降低IOP在减慢POAG发展并延缓其损伤作用中是有效的。但是，视野损失在青光眼患者中并不是总与IOP相关，而且单独降低IOP不能完全终止该疾病的进展。这暗示了压力也许并不是青光眼性视网膜病变和视神经病变的唯一原因。其他机制，特别是存在于视神经乳头和视网膜中的机制，可能造成RGC的死亡。
已经假设了青光眼性视网膜病变的若干机制。似乎没有一个机制单独足够解释在青光眼患者中通常观察到的病理学改变的广泛范围和模式。可能青光眼涉及不止一种病因学，而且不同机制在不同患者中和/或疾病不同阶段中出现。一些更重要的提议是神经营养因子的剥夺、血管异常(缺血)和谷氨酸毒性。这些机制最终导致RGC的凋亡(Clark和Pang(2002))。
已经提议，相同机制也涉及其他眼病。例如，神经营养因子的减少与大鼠模型的色素性视网膜炎有关(Amendola等人，(2003))。向视网膜引入某些神经营养因子可以减少与色素性视网膜炎(Tao等人，(2002))、视网膜脱离(Hisatomi等人，(2002)；Lewis等人，(1999))以及实验性黄斑变性(Yamada等人，(2001))相关的视网膜损伤。视网膜缺血涉及急性缺血性视神经病变、黄斑变性(Harris等人，(1999))以及其他缺血性视网膜病变或视神经病变。类似地，谷氨酸毒性可能造成见于视网膜脱离中可见的视网膜损伤(Sherry和Townes-Anderson(2002))。
目前，尚无可用的青光眼治疗可中断在疾病进展中损伤眼组织的机制。需要解决青光眼根本病理学原因的青光眼治疗，并由此提供保护免于视网膜神经节细胞损失或损伤。
发明概述本发明通过提供目标为作用于眼组织致损机制的治疗青光眼和其他眼病的组合物和方法，克服了现有技术的这些及其他缺点。该组合物和方法包含至少一种用于治疗与眼病有关的受损视网膜组织的JNK抑制剂，所述眼病例如青光眼、急性缺血性视神经病变、黄斑变性、色素性视网膜炎、视网膜脱离、视网膜破裂或裂孔，以及其他缺血性视网膜病变或视神经病变。
附图简述下列附图构成本说明书的一部分，并且包括在本说明书进一步证明本发明的某些方面中。结合本文提出的具体实施方案的详细说明，参考这些附图可以更好地理解本发明。


图1.含有或不含有营养因子、含有或不合有谷氨酸(100μM)时，SP600125对大鼠RGC存活的作用。将细胞在不同的条件下培养3天。通过计数所有Thy-1阳性健康细胞定量存活。
图2.SP600125对缺血/再灌注诱导的视神经病变的作用。视神经损伤分值1代表无损伤，而分值5代表全部损伤。*经学生T检验(Student’s t检验)与载体处理组相比p＜0.05。
图3.SP600125对培养的成年大鼠RGC存活的作用。将细胞以含有或不含有SP600125的谷氨酸(100μM)处理3天。
图4。SP600125对培养的成年大鼠RGC存活的作用。将所选营养因子(bFGF、BDNF、CNTF)从除了对照之外的所有孔除去。将细胞以所示浓度的SP600125处理3天(TF＝营养因子)。
优选实施方案详述本发明针对治疗青光眼和其他眼病的组合物和方法，所述眼病包括急性缺血性视神经病变、黄斑变性、色素性视网膜炎、视网膜脱离、视网膜破裂或裂孔，以及其他缺血性视网膜病变或视神经病变。该组合物包含可药用载体中的一种或多种JNK抑制剂。
Jun N端激酶(JNK)是应激活化蛋白激酶家族，包含至少10种由mRNA转录物可变剪接产生的同种型，所述mRNA来自三个基因JNK1、JNK2和JNK3(Gupta等人，(1996))。JNK活化是某些应激诱导的凋亡形式所需的(Tournier等人，(2000))，导致许多转录因子和细胞蛋白质、特别是与凋亡相关的细胞蛋白质(例如Bcl2、BCI-XL、p53等)的磷酸化。在细胞培养中，JNK活化与多种损伤诱导的神经元凋亡相关(Xia等人，(1995)；LeNiculescu等人(1999))。JNK3是营养因子剥夺后交感神经元死亡所需的(Bruckner等人，(2001))。JNK3缺陷小鼠对由红藻氨酸诱导的海马神经毒性具有抗性(Yang等人，(1997))。因为这些神经保护作用，已提议将JNK抑制剂用于治疗脑退行性疾病，例如阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、中风和缺血诱导的脑功能障碍。另外，因为JNK信号传导途径也调节一些炎症中涉及的分子的活性和代谢(Manning和Mercurio(1997))，已提议将JNK抑制剂用于治疗免疫疾病，例如类风湿性关节炎、哮喘、慢性移植排斥、炎性肠病和多发性硬化。其他研究进一步说明，JNK抑制剂可以用作肥胖、2型糖尿病(Hirosumi等人，(2002))和癌症(Adjei(2001))的可能治疗剂。
即使具有上面列出的多种药理学作用，JNK抑制剂可用于治疗青光眼也并非显而易见。原因如下(1)上述疾病尚无一种显示与青光眼或前述眼病有关。(2)由于对脑退行性疾病有效的治疗剂并不总是对RGC的青光眼性凋亡死亡或其他眼病提供保护，药物在脑中的有效性并不预示其在眼中的有效性。(3)感染、免疫异常、糖尿病、肥胖或癌症并没有作为青光眼或上述眼病的病因学得到广泛接受。
出乎意料的是，本发明人发现，非肽类JNK抑制剂SP600125在培养中对谷氨酸诱导的或营养因子剥夺诱导的大鼠视网膜神经元RGC的死亡具有保护作用。本发明人还发现该化合物在大鼠中对缺血/再灌注诱导的视神经病变具有保护作用。由于已经将营养因子剥夺、缺血和谷氨酸毒性提议为青光眼和多种眼病的可能机制，这些数据说明，可以将非肽类JNK抑制剂用作治疗或预防青光眼和其他眼病，例如急性缺血性视神经病变、黄斑变性、色素性视网膜炎、视网膜脱离、视网膜破裂或裂孔，以及其他缺血性视网膜病变或视神经病变的治疗剂。
本文所用的“JNK抑制剂”指可以将JNK活性降低为对照值的50％或更低的那些化合物。本领域技术人员可以容易地评价化合物对JNK活性的可能抑制作用。可以通过商业途径获得多种JNK活性测定试剂盒，例如Stratagene目录号205140、Upstate目录号17-166等。
希望可用于本发明的方法和组合物中的JNK抑制剂的实例包括但不限于SP600125及在专利申请号WO200035906、WO200035909、WO200035921、WO200064872、WO200112609、WO200112621、WO200123378、WO200123379、WO200123382、WO200147920、WO200191749、WO2002046170、WO2002062792、WO2002081475、WO2002083648、WO2003024967中公开的可药用活性化合物；所有专利申请在此引用作为参考。
该方法包括给予人类患者一种或多种JNK抑制剂以治疗青光眼和/或其他眼病，例如急性缺血性视神经病变、黄斑变性、色素性视网膜炎、视网膜脱离、视网膜破裂或裂孔，以及其他缺血性视网膜病变或视神经病变。
根据本领域技术人员已知的制剂技术，本发明的JNK抑制剂可以包含在多种类型的可药用组合物中。通常，将JNK抑制剂配制为局部眼用或眼内施用的溶液剂或混悬剂，或配制为全身施用(例如口服或静脉内)的片剂、胶囊剂或溶液剂。
由于易于施用，优选JNK抑制剂的口服制剂。口服制剂可以是液体或固体形式。通常，口服制剂将是活性JNK抑制剂和惰性赋形剂。通常，固体片剂或胶囊剂将含有多种赋形剂，例如膨胀剂、结合剂、随时间释放的衣料等。液体配药将含有载体、缓冲剂、张力剂、增溶剂等。
通常，用于上述目的的剂量会变化，但将在有效量之内以抑制或改善视网膜神经病变。本文所用的术语“药学有效量”指抑制或改善视网膜神经病变的量。JNK抑制剂通常将以约0.01至约10.0重量/百分数的量包含在这些制剂中。优选的浓度范围在约0.1至约5.0重量/百分数的范围内。对于局部施用，根据熟练临床医生的常规判断，将这些制剂每天一至六次输送到疾病位点。以可用于治疗的例如片剂或液体形式全身施用，将含有约10-1000mg的JNK抑制剂，并且可以根据熟练临床医生的判断每日使用1-4次。
本文所用的术语“可药用载体”指安全的任何制剂，且其为有效量的本发明的至少一种JNK抑制剂的所需施用途径提供适当递送。
本文包含下列实施例，以示例本发明的优选实施方案。本领域的技术人员应当理解，这些实施例中公开的技术遵循由发明人发现的代表性技术，以在本发明的实践中较好地发挥作用，并从而可以认为所述技术组成实践本发明的优选模式。然而，依照所述公开内容，本领域技术人员应当理解，可以在公开的具体实施方案中进行多种改变而不背离本发明的精神和范围，并依然获得同样或相似的结果。
实施例1下列实施例证明JNK抑制剂对视网膜细胞的细胞毒性损伤的保护功效。
大鼠视网膜神经节细胞存活测定通过CO2窒息安乐处死成年Sprague-Dawley大鼠。摘除其眼球并置于Dulbecco改良的Eagle培养基(Dulbecco′s modified Eagle′s medium)营养素混合物FI 2(1∶1；DMEM/F12)中。将视网膜在木瓜蛋白酶溶液中于37℃孵育25分钟，所述木瓜蛋白酶溶液包含在DMEM/F12中的木瓜蛋白酶(34个单位/mL)、DL-半胱氨酸(3.3mM)和牛血清白蛋白(0.4mg/ml)。然后研磨视网膜碎片直至细胞分散。将细胞悬液(1.5mi；含有约4.5×106个细胞)置于各个多聚D-赖氨酸包被的玻璃底培养皿中。将细胞在之前由Barres等人(1988)描述的培养基中于37℃在95％空气/5％CO2中培养3天。
在评价谷氨酸对细胞存活的毒性的实验中，将细胞用100μM谷氨酸培养3天。在评价神经营养因子剥夺对细胞存活的有害作用的实验中，从培养基中去除碱性成纤维细胞生长因子、脑衍生营养因子和睫状源性神经营养因子，并将细胞培养3天。在评价JNK抑制剂SP600125可能的保护性作用的实验中，当存在谷氨酸或不存在指定的营养因子时，将细胞与该化合物培养3天。在3天培养期末，将细胞对RGC的细胞表面标志Thy-1免疫染色，并在荧光显微镜下观察。计数Thy-1阳性细胞并计算平均值。结果示于图1。
图1说明RGC的存活依赖于指定的神经营养因子的存在，因而，从培养基中去除神经营养因子(TF剥夺)引起RGC死亡，多达对照组的大约50％。将细胞与SP600125孵育，显著并完全保护细胞免于这种损伤。图1也说明，由于向培养基加入100μM谷氨酸使细胞存活降低约50％，谷氨酸对RGC有毒性。同样，将细胞与SP600125培养，也显著并完全保护细胞免于这种细胞毒性。
实施例2下列实施例证明JNK抑制剂对缺血诱导的大鼠视神经病变的保护功效。
缺血/再灌注诱导的大鼠视神经病变将成年Wistar大鼠麻醉，并在每只动物一只眼睛的前房插管。将导管与升高的盐溶液池(saline reservoir)连接，调节盐溶液池的高度以产生高于动物收缩压的眼压，该眼压通过终止视网膜血流而产生视网膜缺血。缺血60分钟后，去除房内导管从而容许视网膜再灌注。两周后，使大鼠安乐处死，分离其视神经，在0.1M二甲胂酸缓冲液中的2％多聚甲醛、2.5％戊二醛中固定，切片，并在按照Hollander和Vaaland(1968)所述制备的异丙醇∶甲醇(1∶1)中的1％对苯二胺中染色。按照先前由Pang等人(1999)报告的视神经损伤评分(Optic Nerve Damage Score)，将各个视神经切片中的视神经损伤分级。在该分级体系中，分值1代表没有损伤，而分值5代表全部损伤。
为了测试SP600125可能的保护作用，在诱导缺血前2天开始，连续16天每日腹膜内注射SP600125(30mg/kg)处理所选动物。结果示于图2。
如视神经损伤分值的显著升高所示，图2说明缺血/再灌注引起视神经的显著损伤。由视神经损伤分值的显著降低说明，该图也证明全身施用SP600125可以保护缺血对视网膜的损伤。
实施例3在培养的成年大鼠视网膜神经节细胞(RGC)中测试JNK抑制剂SP600125。显示其对谷氨酸诱导的和营养因子剥夺诱导的细胞毒性均有保护性。
方法A.RGC培养通过CO2窒息安乐处死成年Sprague-Dawley大鼠。摘除其眼球并分离视网膜。将视网膜细胞于37℃以木瓜蛋白酶处理25分钟，然后以5mLRGC培养基(含有多种营养补充物+1％胎牛血清的Neurobasal培养基)洗涤3次。研磨分散视网膜细胞。将细胞悬液置于多聚D-赖氨酸和层粘连蛋白包被的8孔有隔培养玻片(8-well chambered culture slides)上。然后于37℃在95％空气/5％CO2中培养细胞。
B.细胞毒性损害为了谷氨酸诱导的毒性研究，用载体或指定化合物将细胞预处理30分钟，随后以100μM谷氨酸处理3天。
为了营养因子剥夺研究，从培养基中去除碱性成纤维细胞生长因子、脑源性神经营养因子和睫状神经营养因子这三种营养因子。在该培养基中将细胞用指定化合物培养3天。
C.定量细胞存活在孵育期末，将细胞固定，并通过免疫细胞化学标记RGC标志——Thy-1。通过手工计数各孔中的Thy-1阳性健康细胞定量细胞存活。
结果A.SP600125对大鼠RGC中谷氨酸诱导的毒性的作用以前已经说明谷氨酸对大鼠RGC有毒性；100μM谷氨酸处理3天后仅50-70％的细胞存活。可以通过以MK801预处理而阻止这些细胞中谷氨酸诱导的毒性。SP600125以剂量依赖的方式对该损害具有保护性(图3)。
B.SP600125对RGC中营养因子剥夺诱导的毒性的作用以前已经说明，除去三种营养因子3天，引起大约40-50％的细胞死亡。SP600125以剂量依赖的方式对该损害具有保护性(图4)。
实施例4可用于治疗青光眼和其他眼病的局部组合物
通过首先将一部分纯净水置于烧杯中并加热至90℃而制备上述制剂。然后将羟丙基甲基纤维素(HPMC)加入加热的水中，并通过强烈涡旋搅拌混和直到HPMC全部分散。然后使产生的混合物一边搅拌一边冷却，从而使HPMC水合。然后在具有液体入口和疏水性消毒空气排放过滤器的容器中通过高压灭菌将产生的溶液消毒。
然后将氯化钠和乙二胺四乙酸二钠加入另一部分纯净水中并溶解。接着将苯扎氯铵加入该溶液，并以0.1M NaOH/HCl将溶液pH调节至7.4。通过过滤将溶液消毒。
通过干热或环氧乙烷将SP600125消毒。如果选择环氧乙烷消毒，需要于50℃通风至少72小时。将经过消毒的化合物无菌称重，并置于加压球磨研磨容器中。然后将消毒的玻璃球加入该容器中，将容器中的内容物以225转/分钟无菌研磨16小时或研磨至所有颗粒在大约5微米范围内。
在无菌条件下，将通过前述步骤形成的微米级药物悬液或溶液边搅拌边注入HPMC溶液中。用一部分含有氯化钠、乙二胺四乙酸二钠和苯扎氯铵的溶液冲洗球磨研磨容器以及其中含有的球。将冲洗液无菌加入HPMC溶液中。然后用纯净水调整该溶液的终体积，如果需要，以NaOH/HCl将溶液pH调节至pH7.4。
实施例5局部施用的优选制剂
实施例6口服施用制剂片剂根据片剂制剂领域技术人员已知的程序配制1-1000mg含有例如淀粉、乳糖和硬脂酸镁这类无活性成分的JNK抑制剂。
不使用不当实验法，可以根据本申请的公开制备并实施在此公开并要求权利的所有组合物和/或方法。尽管已经根据优选实施方案对本发明的组合物和方法进行了描述，对于本领域技术人员显而易见的是，可以对本文所述的组合物和/或方法以及该方法的步骤或步骤顺序进行改变，而不背离本发明的概念、精神和范围。更具体地，显然可以用化学和结构均相关的某些试剂替代本文所述的试剂以获得类似的结果。将所有这类对本领域技术人员显而易见的替代和修改视为在本发明的精神、范围和概念之内，所述精神、范围和概念如附加的权利要求所定义。
参考文献从提供示例性方法或对本文所述的示例性程序补充其他细节的角度，在此明确引用下列参考文献作为参考。
专利和公开的专利申请WO200035906WO200035909WO200035921WO200064872WO200112609WO200112621WO200123378
WO200123379WO200123382WO200147920WO200191749WO2002046170WO2002062792WO2002081475WO2002083648WO2003024967书籍其他出版物Adjei，″Blocking oncogenic Ras signaling for cancer therapy，″JNATL CANCER INST 931062-1074(2001).
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权利要求
1.治疗青光眼和其他眼病的组合物，所述其他眼病例如急性缺血性视神经病变、黄斑变性、色素性视网膜炎、视网膜脱离、视网膜破裂或裂孔，以及其他缺血性视网膜病变或视神经病变，所述组合物包括有效量的一种或多种Jun N端激酶(JNK)抑制剂和可药用载体。
2.根据权利要求1的组合物，其中所述JNK抑制剂是SP600125。
3.根据权利要求1的组合物，其中所述组合物是口服制剂。
4.根据权利要求1的组合物，其中所述组合物是局部眼用、外科冲洗溶液或眼内制剂。
5.根据权利要求2的组合物，其中所述组合物是口服制剂。
6.根据权利要求2的组合物，其中所述组合物是局部眼用、外科冲洗溶液或眼内制剂。
7.治疗青光眼的方法，其包括给予人类患者组合物，所述组合物包含有效量的一种或多种JNK抑制剂和可药用载体。
8.根据权利要求7的方法，其中所述JNK抑制剂是SP600125。
9.根据权利要求7的方法，其中所述组合物是口服制剂。
10.根据权利要求7的方法，其中所述组合物是局部眼用、外科冲洗溶液或眼内制剂。
11.根据权利要求8的方法，其中所述组合物是口服制剂。
12.根据权利要求8的方法，其中所述组合物是局部眼用、外科冲洗溶液或眼内制剂。
13.治疗眼病的方法，所述眼病选自急性缺血性视神经病变、黄斑变性、色素性视网膜炎、视网膜脱离、视网膜破裂或裂孔，以及其他缺血性视网膜病变或视神经病变，所述方法包括给予人类患者组合物，所述组合物包含有效量的一种或多种JNK抑制剂和可药用载体。
14.根据权利要求13的方法，其中所述JNK抑制剂是SP600125。
15.根据权利要求13的方法，其中所述组合物是口服制剂。
16.根据权利要求13的方法，其中所述组合物是局部眼用、外科冲洗溶液或眼内制剂。
17.根据权利要求14的方法，其中所述组合物是口服制剂。
18.根据权利要求14的方法，其中所述组合物是局部眼用、外科冲洗溶液或眼内制剂。
全文摘要
本文公开治疗青光眼及其他眼病的组合物。所述组合物和方法具体针对Jun N端激酶(JNK)抑制剂，例如1，9－吡唑并蒽酮，在治疗青光眼及其他眼病中的用途。
文档编号A61P27/00GK101048156SQ200580036654
公开日2007年10月3日 申请日期2005年10月27日 优先权日2004年10月29日
发明者彭玉豪, A·F·克拉克 申请人:爱尔康公司