治疗和/或诊断用途的含聚磷腈的可负载颗粒和制备方法及其应用的制作方法

专利名称：治疗和/或诊断用途的含聚磷腈的可负载颗粒和制备方法及其应用的制作方法
相关申请的交叉参考本申请根据35 U.S.C.ξ119(e)，要求2005年5月24日提交的临时专利申请60/684,307和2004年10月25日提交的60/621,729的优先权，通过参考将它们的全部内容引入本文。
背景技术：
较小的颗粒，包括微球和毫微球，在诊断和治疗过程中有许多临床应用。在医学应用中使用的大多数现有技术颗粒的特征在于有很多的缺点，包括刺激与它们接触的组织和引发有害的免疫反应。
此外，许多用于制备现有技术的颗粒的物质可以在哺乳动物体内相对快速地降解，因此减损了它们在一些完整颗粒必需较长时间存在的过程中的应用。此外，现有技术物质的降解可以释放出毒性或刺激性的化合物，导致在患者中发生不良反应。
对于一些类型的现有技术的物质，当将颗粒掺入到注射用的递送混悬液中并进入要治疗身体的位点时，其难于实现期望的悬浮性质也是一个问题。许多时候，颗粒在溶液中沉降或趋向于“漂浮”，使得它们不能均匀地悬浮来进行均匀递送。此外，颗粒可以在递送溶液中聚集或团聚，和/或粘附到递送装置的某一部分上，使得必需补偿这些粘附/吸引力。
为了实现稳定的分散，已知可以加入适当的分散剂，其可以包括目标在于破坏吸引颗粒的相互作用的表面活性剂。根据颗粒相互作用的性质，可以使用下列的物质阳离子、阴离子或非离子表面活性剂，例如吐温TM20、吐温TM40、吐温TM80、聚乙二醇、十二烷基硫酸钠、各种天然产生的蛋白质例如血清白蛋白、或任何其他在递送制剂中的大分子表面活性剂。此外，使用增稠剂可以有助于避免通过沉淀作用而沉降，并增加溶液的粘度，这些增稠剂是例如聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、糖类或糊精。也可以加入密度添加剂来实现漂浮性。
而且当在水性混悬液中使用澄清、透明的聚合丙烯酸酯水凝胶小珠时，在溶液中使微粒可视来确定悬浮程度也是困难的。已知人们试图使用颗粒形式的惰性沉淀物、硫酸钡作为添加剂来用于骨粘骨粉、用于硅酮，在X-射线检查中用于使物质可见，和用于为聚合的丙烯酸酯颗粒提供辐射不透性。参见Jayakrishnan等人，Bull.Mat.Sci.Vol.12，No.1，pp.17-25(1989)。也已知硫酸钡可以改善流化作用，经常用作无机填充剂来为潮湿、聚集的颗粒传递抗粘性质。其他的现有技术试图增加颗粒的可视化，包括使用金，例如Embosphere GoldTM用较少量的金为丙烯酸酯微粒提供了红紫色。
因此，在本领域仍然需要较小的颗粒，其可以在一些应用例如各种的治疗或诊断过程中具有一般优选的球形结构，其不会通过哺乳动物系统的自然系统而降解，是生物相容性的，对团聚有抵抗性，当使用时易于在混悬液中可见和/或显示可接受的物理和悬浮性质。
发明简述 本发明包括在治疗和/或诊断过程中使用的颗粒。该颗粒包含聚[二(三氟乙氧基)磷腈]和/或其衍生物。
也包括在哺乳动物中使流向组织的血流最小的方法，包括用至少一个颗粒封闭血管的至少一部分，其中该颗粒包含聚[二(三氟乙氧基)磷腈]和/或其衍生物。
此外，本文描述了递送活性剂至哺乳动物体内的局部区域的方法，包括用至少一个颗粒与该局部区域接触，该颗粒包含聚[二(三氟乙氧基)磷腈]和/或其衍生物和活性剂，以将有效量的活性剂暴露于局部区域中。
在本发明内也包括活性剂的口服持续释放制剂，该制剂包括聚合物胶囊和活性剂，其中该聚合物胶囊包含聚[二(三氟乙氧基)磷腈]和/或其衍生物。
本发明进一步包括示踪颗粒通过哺乳动物中血管的途径的方法，该方法包括向哺乳动物的血流中注射至少一个示踪颗粒，该示踪颗粒包含聚[二(三氟乙氧基)磷腈]和/或其衍生物和造影剂，并使颗粒的途径可见。
此外，本文描述了一种增强的超声成像方法，该方法包括给超声受者在该超声受者的一个区域施用至少一个包含聚[二(三氟乙氧基)磷腈]和/或其衍生物的空心微囊，并用超声将受者的该区域成像。
本发明也包括递送活性剂至哺乳动物体内的局部区域的方法，包括用至少一个颗粒与该局部区域接触，该颗粒包含聚[二(三氟乙氧基)磷腈]和/或其衍生物和活性剂，以将有效量的活性剂暴露于局部区域中，其中，该颗粒包含一种增加密度的试剂。
此外，描述了一种使由基于丙烯酸的聚合物形成的颗粒团聚和/或聚集最小化的方法，该方法包括为该颗粒的核和/或表面提供硫酸钡。
附图中几个视图的简述 当与所附的附图相结合阅读时，将会更好地理解本发明上文的简述以及下文的详述。为了解释说明本发明的目的，在附图中所示的实施方案是目前优选的。但是，应当理解的是，本发明并不限于所示的确切的排列和手段。
在这些附图中， 附

图1显示的是根据本发明的一个实施方案用于制备颗粒的低温萃取方案的图示； 附图2显示的是在本文实施例1的微球的制备中，将聚合物溶液应用于液氮时所采用的手工滴加技术； 附图3A和附图3B显示的是如本文所述通过低温萃取法的一个实施方案制备的无负载的聚磷腈颗粒(微球)。附图3A显示的是4x光学显微镜视图，附图3B显示的是100x扫描电子显微镜视图； 附图4显示的是以100x放大的SEM时根据本发明的一个实施方案形成的颗粒(微球)，其负载有牛胰岛素(20％(wt/wt))； 附图5A和附图5B显示的是无负载的聚磷腈微球的表面形态。附图5A是用原子力显微镜得到的镜像，附图5B是扫描电镜显示的以5000x放大时无负载的聚磷腈微球的表面； 附图6和7显示的是在本发明的一个实施方案中使用的低温萃取装置，其中附图6是低温萃取管，附图7是注射泵； 附图8是在本文实施例14微粒的微导管测试中使用的装置的横断层面视图； 附图9A和9B分别显示的是在水合/脱水循环后样品C微粒表面的1.0KX放大的SEM和由在实施例14的评价中使用的实施例12的样品C形成的微粒膜厚度的50.00KX放大的SEM； 附图10A、10B、10C和10D是在通过导管后在实施例14的评价中使用的实施例12的样品C制成的微粒的SEM，显示的是以1.0KX放大(附图10A、10B和10C)和以5.0KX放大(附图10D)的表面特征；和 附图11A、11B、11C和11D是在实施例14的热应力测试后实施例12的样品C形成的微粒的SEMs。附图11A是在强烈的白色对比部分中较少量分层的50x放大。附图11B是附图11A的微粒的200x放大。附图11C和11D分别是仅显示较小缺陷的其他样品C微粒的200X和1.0KX放大的SEMs。
发明详述 本文所述的是可以用聚[二(三氟乙氧基)磷腈]和/或其衍生物制备的颗粒，及制备该颗粒的方法。此外，本文所述的是使用本文所述的颗粒的治疗和/或诊断方法和过程，包括用该颗粒栓塞的方法，用该颗粒(口服或局部)递送活性剂的方法，用该颗粒使通过身体的血液或其他生物学液体示踪或可见的方法，以及用该颗粒增强超声(超声波检查)的方法。
也包括口服的持续释放的药物递送制剂，包括将活性剂局部递送到胃肠系统和/或将活性剂全身性递送的颗粒，以及可以皮下或静脉注射以局部递送活性剂的持续释放的药物递送制剂。
本发明的所有方法、组合物和制剂都利用了如本文所述的至少一个颗粒。本文使用的“颗粒”和“多个颗粒”是指基本上球形或椭圆形的颗粒、空心或固体，其可以具有适合在下文所述的特定方法和应用中使用的任意直径，包括微球和毫微球，小珠和本领域已知的类似性质的其他物体。
根据本文所述的一个实施方案，本发明的优选颗粒全部或部分地包含特定的聚磷腈聚合物，名称为聚[二(三氟乙氧基)磷腈]或聚[二(三氟乙氧基)磷腈]的衍生物。这些特定聚合物的使用使得颗粒至少部分是无机的，这样它们就包括无机聚合物骨架，并且当引入到哺乳动物(例如人或动物)中时也是生物相容性的，它们不会显著诱导特异性或非特异性免疫系统应答。本发明的范围也包括这些颗粒作为可控的药物递送载体或用于使血管和其他器官可见化的示踪颗粒的应用。
该颗粒在许多治疗和/或诊断过程中是部分有用的，因为它们可以制备成粒径足够大以封闭血管，或足够小以易于通过较小的血管，例如用于可见化或药物递送目的。此外，由于该聚合物的生物相容性，该颗粒有利于避免或消除当将外源性物体引入到哺乳动物体内时一般会遇到的免疫原反应，例如“植入排斥”或“变应性休克”以及免疫系统的其他有害反应。此外，已经发现，本发明的颗粒在体内显示了较低的生物降解，因此，增强了颗粒在生物环境中的长期稳定性。此外，在该颗粒内的聚合物被部分降解的情况下，降解中释放出来的产物仅包括非毒性浓度的磷、铵、和三氟乙醇，有利地，当与哺乳动物组织接触时已知三氟乙醇可以促进抗炎症应答。
本发明中的每一种颗粒都是由聚合物聚[二(2，2，2-三氟乙氧基)磷腈]或其衍生物(此外也称作″聚[二(三氟乙氧基)磷腈]″或″PTFEP″)部分地形成的。优选，聚[二(三氟乙氧基)磷腈]聚合物是由下列通式(I)所代表的重复单体形成的 其中R1到R6都是三氟乙氧基(OCH2CF3)，n可以不同，从至少100到更大的分子量长度，优选n是约4,000到约300,000，更优选n是约4,000到约3,000，最优选n是约13,000到约30,000。可替代地，可以在本发明的颗粒的制备中使用该聚合物的衍生物。″衍生物″是指由具有通式(I)结构的单体形成的聚合物，但其中一个或多个R1-R6官能团或骨架原子被不同的原子或官能团取代，但基本上没有改变聚合物的生物学惰性。示例性的官能团包括乙氧基(OCH2CH3)、2，2，3，3，3-五氟丙氧基(OCH2CF2CF3)，2，2，2，2′，2′，2′-六氟异丙氧基(OCH(CF3)2)、2，2，3，3，4，4，4-七氟丁氧基(OCH2CF2CF2CF3)、3，3，4，4，5，5，6，6，7，7，8，8，8-十三氟辛氧基(OCH2(CF2)7CF3)、2，2，3，3-四氟丙氧基(OCH2CF2CHF2)、2，2，3，3，4，4-六氟丁氧基(OCH2CF2CF2CF3)、3，3，4，4，5，5，6，6，7，7，8，8-十二氟辛氧基(OCH2(CF2)7CHF2)。此外，在一些实施方案中，1％或更少的R1到R6可以是帮助交联的链烯氧基，以提供更有弹性的包括诸如OCH2CH＝CH2、OCH2CH2CH＝CH2或烯丙基苯氧基的磷腈聚合物。
优选用于制备本发明颗粒的聚合物的分子量具有基于上述通式的分子量，更优选分子量至少约70,000g/mol，更优选至少约1,000,000g/mol，更优选分子量是至少约3×106g/mol到约20×106g/mol。最优选分子量至少约10,000,000g/mol的聚合物。
必要地，根据本发明形成的颗粒的直径将会根据颗粒所使用的最终用途而不同。这些颗粒的直径优选约1到约5,000μm，最优选直径约1到约1,000μm。其它常用的尺寸包括直径约200到约500μm，约1到约200μm和大于约500μm，但是应当理解，根据该公开，颗粒尺寸的不同组合和在约1到约5,000μm的较宽范围内的不同范围都在该公开的范围内。在优选使用超过一个颗粒的方法中，所有的颗粒具有相同的直径或形状并不是必要的。但是根据本发明，可以制备具有如下示例性范围的明确校准的颗粒100μm±25μm250μm±50μm400μm±50μm500μm±50μm700μm±50μm900μm±50μm可以制备各种范围例如上述所示的那些以及用于多种用途的组合，例如500到700μm范围内的颗粒也在本发明的范围内。
该颗粒也包括在其制备中或其治疗和/或诊断应用中具有增强、改变或变更聚合物或颗粒性质的功能的其他化合物。例如，活性剂例如肽、蛋白质、激素、碳水化合物、多糖、核酸、脂类、维生素、类固醇和有机或无机药物可以掺入到该颗粒中。赋形剂例如葡聚糖、其他糖、聚乙二醇、葡萄糖和各种盐包括例如谷氨酸壳聚糖也可以包括在该颗粒中。
此外如果需要，除了聚[二(三氟乙氧基)磷腈]和/或其衍生物以外的聚合物可以包括在该颗粒中。聚合物的例子可以包括聚(乳酸)、聚(乳酸和乙醇酸)、聚(己内酯)、聚碳酸酯、聚酰胺、聚酐、聚氨基酸、聚正酯、缩醛树脂、聚腈基丙烯酸酯、和聚氨基甲酸酯。其他聚合物包括聚丙烯酸酯、乙烯-醋酸乙烯酯共聚物、酰基取代的乙酸纤维素及其衍生物、可降解或不可降解的聚氨基甲酸酯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚氟乙烯、聚(咪唑乙烯)、氯磺酸盐化的聚烯烃、和聚氧化乙烯。在制备例如本文所述的颗粒时，可以通过本领域已知的任意技术掺入所选择的化合物，所述技术包括散布、插入或夹带所述其他化合物到已形成的颗粒的基质中，或通过将其他化合物加入到聚合物的熔化物中或加入到聚合物溶剂中。
负载或未负载的颗粒可以用一层或多层其他的聚合物来包被，包括的聚合物是例如上文所述的那些。此外可以使用PTFEP或其衍生物在颗粒上形成包衣，所述颗粒是由已知的或在本领域中待发展的用于形成本文所述颗粒的其他聚合物或共聚物形成的。优选地，当包被颗粒例如微粒时，应用PTFEP作为基于下文进一步详述所列出的丙烯酸酯的聚合物形成的微粒上的包衣。
包衣是有益的，例如，如果将颗粒用于持续释放、口服、药物递送制剂(肠溶衣)，或如果该颗粒负载可能有毒性的造影剂(生物不能降解的包衣)。
可以通过本领域已知的适合制备包含聚[二(三氟乙氧基)磷腈]的颗粒的任意方法来制备微球。在根据一个实施方案的一种方法中，制备“聚合物溶液”包括混合一种或多种聚合物溶剂和PTFEP和/或其衍生物，直至聚合物溶解。
在制备聚合物溶液中使用的适当溶剂包括聚合物PTFEP和/或其衍生物可溶于其中的任意溶剂。示例性的溶剂包括但不限于，醋酸乙酯、醋酸丙酯、醋酸丁酯、醋酸戊酯、醋酸辛酯、丙酮、甲基乙基酮、甲基丙基酮、甲基异丁基酮、四氢呋喃、环己酮、乙酰二甲胺、乙腈、二甲醚、六氟代苯或其组合。
该聚合物溶液所包含的PTFEP和/或其衍生聚合物的浓度是聚合物的约1重量％至聚合物的20重量％，优选聚合物的约5％到10重量％。如果希望在最终颗粒中包含如上述讨论的其他聚合物，那么其它聚合物可以存在于溶液中，或以第二溶液粉末或其他形式加入到管中。
在进行该方法时，接着将聚合物溶液，优选是微滴或气雾剂的形式，分散到包含非-溶剂的管中。“非-溶剂”是指基本上不溶解PTFEP聚合物的任意有机或无机溶剂，并且其熔点相对于可以溶解该聚合物的溶剂(“聚合物溶剂”)的熔点更低，以使得在培养步骤的过程中非-溶剂在溶剂熔化之前熔化。优选地，非-溶剂的熔点和聚合物熔点之间的差异是约10℃，更优选约15℃，最优选大于约20℃。在某些条件下，已经发现如果聚合物溶剂的熔点和非-溶剂的熔点之间的差异大于15℃，可以增强所得颗粒的结构完整性。但是，非-溶剂的熔点只稍微比聚合物溶剂的熔点低就足够了。
将非-溶剂/聚合物溶剂的组合培养约1到5天，或直到从颗粒中完全除去聚合物溶剂。不希望受到任何理论的限制，假设在培养期间，非-溶剂的功能是从颗粒细小的聚合物溶液微滴中萃取出聚合物溶剂，以使得聚合物至少凝胶化。随着培养时间的流逝，微滴将会缩小，并进一步萃取溶剂，生成了包含凝胶化的聚合物核的较硬外部聚合物壳，最后，在完成培养后，完全除去残留的溶剂。为了确保在培养期间基本保持聚合物微滴为球形，它们如果不是在整个培养期中，也需要在大多数时间里必须是冷冻或基本上凝胶化的状态。因此，在低温萃取方法过程中，非-溶剂的温度可以保持在溶剂的熔点以下。
如附图1所示，在标记(a)的管中，用注射器或其他装置以可控速率将聚合物溶液微滴分散在液氮的顶层。氮层位于由所选择的非-溶剂构成的底层之上，其最终用于从冷冻的聚合物溶液微滴中萃取溶剂。在聚合物溶液分散之前先用液氮将非-溶剂层冷冻。该标记(b)的管开始露出冷冻的非-溶剂的雾，冷冻的聚合物微滴沉入到该管中。在培养约3天后，该标记(c)的管显示出低温萃取过程，其中在非-溶剂中培养的聚合物溶液微滴已经排出了基本上所有量的非-溶剂。结果是具有较硬外壳的小珠形式的、凝胶化的聚合物颗粒。通过示例可以看出，由于非-溶剂的部分蒸发，管内的非-溶剂高度稍微降低。在该过程中根据聚合物溶液中的聚合物起始浓度，小珠的尺寸将会极大地缩小。
在根据本发明制备包含PTFEP的颗粒的方法的一个实施方案中，可以使用本领域任意已知的或将要发展出来的方法来形成这些颗粒。实现这一点的两个示例性的优选方法包括，其中(i)在加入聚合物溶液前冷却在上述方法的实施方案中位于管中的非-溶剂至接近其凝点或凝点，以使得聚合物微滴在与预冷却的非-溶剂接触时冷冻；或(ii)通过将聚合物微滴与置于预冷冻的非-溶剂的床上的液化气例如氮接触将其冷冻(见附图2)。在方法(ii)中，在蒸发氮后，缓慢熔化非-溶剂，将处于冷冻态的微球沉入到该液态、冷的非溶剂中，在此将进行萃取法(除去聚合物溶剂)。
通过修改该一般性方法，人们可以制备出空心或基本上空心或多孔的颗粒。例如，如果通过在培养的最后阶段使用真空来快速从小珠中除去溶剂，那么将会得到多孔的小珠。
本发明的颗粒可以制备成任意希望的尺寸，获得“微球”，可以包括用气动或超声喷嘴，例如分别购自Sono[.tek]Corporation，Milton，New York，U.S.A.和Lechler GmbH，Metzingen，Germany的Sonotek 8700-60ms或Lechler US50超声喷嘴将聚合物溶液雾化成聚合物气雾剂。可以通过用注射器或形成微滴的装置将滴分散到非-溶剂中获得较大的颗粒。此外，如本领域技术人员所能理解的，可以通过提高或降低聚合物溶液中聚合物的起始浓度来改变或修饰颗粒的尺寸，如较高的浓度将导致球直径增加。
在本文所述的颗粒的可替代实施方案中，该颗粒可以包括基于丙烯酸聚合物或共聚物的标准和/或优选核和PTFEP壳。在用于栓塞形成的造影剂的混悬液中时，这些颗粒可以提供优选的球形和改善的比重。基于丙烯酸聚合物的聚合物与本文所述的PTFEP壳提供了基本是球形的形状、机械柔性和压缩性、改善的比重性质。可以使用本领域任意可接受的技术，例如如B.Thanoo等人，″Preparation ofHydrogel Beads from Crosslinked Poly(MethylMethacrylate)Microspheres by Alkaline Hydrolysis，″J.Appl.P.Sci.，Vol.38，1153-1161(1990)所述来形成核聚合物，通过参考将其引入本文。这些基于丙烯酸的聚合物优选是由未水解的前体聚合形成的，所述前体包括但不限于丙烯酸甲酯(MA)、甲基丙烯酸甲酯(MMA)、甲基丙烯酸乙酯(EMA)、甲基丙烯酸六甲酯(HMMA)或甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)、和衍生物、这些丙烯酸衍生物的变体或共聚物的聚合得到的。最优选的是MMA。该聚合物可以以水合或部分水合(水凝胶)的形式存在于核中。这些聚合物优选是交联的，以提供适当的水凝胶性质和结构，例如增强的非生物降解性，并通过抵抗水的溶解来帮助保持聚合物结构的机械稳定性。
优选地，核预聚物是可以是通过悬浮或乳液聚合类型的分散聚合作用形成的。乳液聚合产生了约10纳米到约10微米的基本上球形的颗粒。悬浮聚合产生了类似的颗粒，但是更大，为约50到约1200微米。
悬浮聚合可以由在水相或更优选地在单体相中溶解的热引发剂启动。可以在单体相组合物中使用的引发剂包括过氧苯甲酰、过氧月桂酰或其他类似的本领域已知或将要发展出来的基于过氧化物的引发剂，最优选过氧月桂酰。以单体重量为基础，优选引发剂的存在量是约0.1到约5重量％，更优选约0.3到约1重量％。如上所述，交联共-单体优选用于形成水合聚合物。在制备聚合颗粒的核中使用的用于与基于丙烯酸类单体一起的交联共-单体包括各种基于二醇的物质，例如乙二醇二甲基丙烯酸(EGDMA)、二乙二醇二甲基丙烯酸(DEGDMA)或最优选地，三甘醇二甲基丙烯酸(TEGMDA)。如果需要也可以提供链转移剂。可以使用任何适当的MA聚合链转移剂。在本文一个优选的实施方案中，可以使用月桂基硫醇作为链转移剂，其量对于特定的聚合反应是可接受的。
水相组合物优选包括表面活性剂/分散剂以及络合剂，任选的缓冲剂是必要的。表面活性剂/分散剂应当是与本文使用的单体相容的，包括Cyanamer370M、聚丙烯酸和部分水合的聚乙烯醇表面活性剂例如4/88、26/88、40/88。分散剂的存在量应当是分散液中水量的约0.1到约5重量％，更优选是分散液中水量的约0.2到约1重量％。如果需要维持适当的pH，可以使用任选的缓冲剂。优选的缓冲溶液包括磷酸钠(Na2HPO4/NaH2PO4)。适当的络合剂是乙二胺四乙酸(EDTA)，其可以约10到约40ppm EDTA，更优选约20到约30ppm的浓度加入到水相中。优选在水相组合物中，单体与水的比例是约1∶4到约1∶6。
聚合应当是在约环境条件下，优选约60℃到约80℃下进行，时间是至约1到2小时发生胶凝的时间。对于颗粒形成优选的搅拌速率是100到500rpm，较低的速率会产生较大的颗粒，较高的速率会产生较小的颗粒。
一旦形成PMMA颗粒例如微粒时，优选使它们经受本领域典型的水解条件，包括每mol PMMA使用约1-10摩尔过量的氢氧化钾。这些氢氧化钾是以在乙二醇中浓度约1-15％的氢氧化钾提供的。然后将该溶液优选在约150-185℃下加热数小时。可替代地，为了使反应试剂的量和成本最小化，优选使用较少量的氢氧化钾，其中每mol PMMA使用小于约5摩尔过量，更优选约3摩尔过量或更小。对于这种水解反应，优选使用在乙二醇中浓度约10-15％，更优选约14％到15％的氢氧化钾。本领域技术人员应当理解，可以使用在较高温度下加热的条件来减少总反应时间。可以根据所得颗粒的总体直径来改变反应时间。例如，下列的条件能够为颗粒提供约35％的压缩性和需要的稳定性当直径约200-300μm时，应当把溶液加热约7.5到约8.5小时；当直径约300-355μm时，约9.5到约10.5小时；当直径约355-400μm时，约11.5到约12.5小时；和当直径约400-455μm时，约13.5到约14.5小时等等。可以在聚合过程中用各种改变来调节粒径，例如改变搅拌速度和单体与水相的比例。此外，通过提高表面活性剂/分散剂的比例可以获得较小的粒径。
在水解后，从反应混合物中分离颗粒，可以将它们的pH调节到任意适合进一步加工步骤或所期望用途的范围内。如果期望用于生理学用途，颗粒核的pH可以调节到约1.0到约9.4，优选约7.4。由于水凝胶核物质的尺寸、溶胀率和弹性取决于pH值，因此在干燥以防止颗粒团聚和/或结构损害期间，可以使用较低的pH值来获得有益效果。优选根据所期望的用途将颗粒筛选成不同尺寸的部分。优选用任意标准的干燥法进行颗粒的干燥，包括使用温度约40℃-80℃的干燥箱，时间为数小时到高达约1天。
为了给亲水水凝胶颗粒提供需要的表面性质，以便提供粘性用以接受PTFEP包衣，可以用任意适当的离子或非离子表面活性剂来处理水凝胶的表面，所述表面活性剂例如是四烷基铵盐、多元醇和类似的物质。通过用适当的试剂与其聚丙烯酸基团反应可以赋予颗粒的表面疏水性，从而使粘性发生更为持久地改变。适当的试剂包括但不限于疏水性醇、酰胺和羧酸衍生物，更优选地它们包括卤代的醇例如三氟乙醇。当使用包衣时，这些表面处理也能防止包衣从核上分层。优选的表面处理包括但不限于，用亚硫酰氯进行初始处理，然后与三氟乙醇反应。可替代地，通过将颗粒悬浮于硫酸和疏水性醇例如三氟乙醇的混合物中来处理该表面。如果颗粒将被包被，那么优选进行这些处理，因为它们能使包衣的任意分层最小化。
可替代地和最优选地，可以用硫酸钡表面层和/或注入硫酸钡来包被PMA核颗粒。硫酸钡是辐射不可透的，当使用时，其有助于使制成的颗粒可见。它也能为颗粒提供增强的流化性质以使它们特别是在干燥期间降低团聚，并允许用PTFEP的外层包衣为PMA颗粒进行流化床包衣，从而在PTFEP外核与聚合的丙烯酸酯核颗粒之间提供改善的粘性。通过甚至在核颗粒溶胀时也允许流化作用，硫酸钡也改善了所有的包衣和粘性。与在干燥状态下包被颗粒，然后将颗粒暴露于核颗粒在其中溶胀的混悬液中，并在PTFEP壳上施加力相比，通过甚至在溶胀状态下也能用PTFEP包被核颗粒，硫酸钡也降低了PTFEP壳发生裂缝或破裂的可能趋势。在核颗粒上硫酸钡的包衣优选是通过不透明包衣形式的硫酸钡在PMA小珠的水凝胶表面上的粘附而应用的。硫酸钡可以进一步帮助降低限制粒径的静电效应。通过允许吸收额外的湿度，硫酸钡可以抵消静电效应。
仅仅松散地粘附到PMA颗粒上的硫酸钡晶体可以通过在PMA颗粒上喷涂足够量的氨基硅烷粘附促进剂而共价交联或化学植入到颗粒表面。这将有助于在颗粒水合后有效减少溶液中的硫酸钡颗粒物质。示例性的颗粒包括3-氨基丙基-三甲氧基硅烷和类似的基于硅烷的粘附促进剂。
改善如上所述制备的微粒的可见性的进一步可替代的方法包括在水凝胶核颗粒内的水溶性有机染料的吸收。示例性的染料优选是批准人用的那些FDA染料和已知或将要发展出来的在体内安全、无毒性使用的那些，和能提供可接受的对比度的那些。有机染料可以包括染料例如D&C Violet no.2和优选批准在医学设备例如隐形镜片和重吸收缝线中使用的其他染料。鉴于硫酸钡作为无机填充剂和精细分散的色素使用时，其通过由于较小晶体粒径的光衍射，当浸入到颗粒中时该染料吸收可见色谱的补充部分而使颗粒可见。
然后用PTFEP和/或其衍生物包被根据上述方法制备的用于形成核水凝胶聚合物的颗粒，包括微粒。可以使用任何适当的包衣方法，包括溶剂流化床和/或喷雾技术。但是使用流化床技术得到了优选的结果，其中颗粒通过气流，当它们在气流中旋转时通过喷雾将其包被。在稀释溶液中提供PTFEP或衍生的聚合物用于喷雾，以避免喷嘴堵塞。
在这些溶液中使用的示例性溶剂包括乙酸乙酯、丙酮、六氟代苯、甲基乙基酮和类似的溶剂和它们的混合物及组合，最优选是单用乙酸乙酯，或其与醋酸异戊酯的组合。溶液中PTFEP或其衍生物的典型优选浓度包括约0.01到约0.3重量％，更优选约0.02到约0.2重量％，最优选约0.075到约0.2重量％。在此公开内容的基础上，应当理解的是，如用于包被颗粒的技术可变一样，水凝胶核的类型也可以不同，但是优选如本文所述形成在本发明所述的处理技术和应用中有用的核，随后用PTFEP和/或其衍生物进行包被。
如前述讨论，该颗粒可以用于各种医学和治疗用途中，例如栓塞形成、药物递送、成像(超声)和作为示踪颗粒。例如在一个实施方案中，本发明包括一种在哺乳动物中使流向特定组织的血流最小化的方法。该方法通常称作栓塞形成，包括用一个或多个本发明的颗粒封闭或堵塞血管的至少一部分或整个血管。这些方法在治疗涉及不希望的血管化组织例如肿瘤组织的疾病或病状中或涉及某些细胞不受控制的增殖的疾病例如子宫内膜异位症中是特别有用的。在这些方法中，可以根据上述的方法制备颗粒，可以通过本领域已知的或将要发展出来的任意侵入性或非侵入性医疗方法，例如通过导管、注射器或外科切口将颗粒植入到血管中。可以进行栓塞形成以仅封闭血管的一部分，或封闭整个血管。在该方法中，如果需要，可以使用如本文所述的负载的活性剂例如细胞抑制剂、抗炎剂、抗有丝分裂或细胞增殖活性剂、激素或其他任意所需的活性剂的颗粒。根据本发明的栓塞形成颗粒能够显示改善的可见性，附加的辐射不透性和约1.17g/cm3的最适当比重。在本发明中栓塞形成颗粒可以与如上所述不同的作为标记的染料一起使用来显示粒径、用于局部药物递送的包埋的药物和受控药物洗脱性质。
当在栓塞形成的治疗中使用时，优选要考虑颗粒密度，以确保对颗粒递送的有益性质。如果使用密度-错配的递送介质，可能会发生基于导管的递送系统堵塞。此外，需要在递送介质中包括一些最少量的造影剂以便在手术期间达到足够水平的荧光镜对比性。当前，根据平衡水含量，聚甲基丙烯酸酯水凝胶密度在1.05g/cm3到1.10g/cm3之间。最常用的每ml含300mg碘的碘化非离子造影剂介质的密度是1.32-1.34g/cm3。如本文所使用，″漂浮性″是指当颗粒的密度与其所悬浮的介质基本相等时，颗粒基本上在溶液中自由漂浮的能力。当在递送介质中有约30％造影剂时，如本文所述根据本发明形成的包衣颗粒可以实现漂浮，但是可以根据本文所述的技术调节这些水平以用于优选的用途。
增加颗粒密度的一个方法是使用重水或氧化氘(D2O)。当使用重水来使颗粒溶胀时，D2O取代了H2O，因此增加了颗粒的重量，从而达到更好地分散和漂浮水平。典型地，用该技术导致了能够加入更大量的至少约5％造影剂的能力。但是，当颗粒与造影剂的水溶液接触时，会随时间而发生一些平衡效应。因此，优选当为了该目的使用D2O时，保持悬浮时间最小化，或更优选地，在也使用D2O的溶液中提供造影剂。
可替代地，可以使用氢氧化铯中和pH1的颗粒，和/或可以用氯化铯平衡最终的中和颗粒。这些化合物将铯分散到颗粒中，形成了聚甲基丙烯酸的铯盐，或分散聚甲基丙烯酸，因此富含氯化铯。
铯增加了颗粒的密度，因此增强了加入更大量造影剂的能力。用铯技术可以调节典型的漂浮水平，使得如栓塞形成所需的，可以向递送介质中加入约45到约50％的造影剂。铯盐是无毒的，并使颗粒在荧光镜下可见。132.9g/mol的铯的原子量比碘稍高，这可以提供有益效果，包括增加总密度和甚至在没有造影剂时增强X-射线的可见性。对于需要铯的放射性同位素的一些癌症治疗，这些活性剂可以作为替代的铯源使用，使颗粒在栓子溶液中漂浮，以及能作为活性治疗剂来源使用。
上述用于改善颗粒，例如用于栓塞形成或其他用途的微粒密度的技术，其中密度和/或在溶液中的漂浮性是可用的性质，所述技术可以用于本文所述的优选颗粒和/或可以用于其他类似的颗粒。应当理解的是，本公开并不限于本文优选颗粒的铯和/或D2O处理，这些技术在其他颗粒例如其他基于丙烯酸的水凝胶和其他聚合物颗粒中具有较广泛的应用。
如上所述，硫酸钡可以在核颗粒和优选的PTEEP包衣之间使用，或用本领域任意已知或将要发展出来的技术引入到核颗粒的内部。同时，有机染料可以类似地包含在颗粒核中。这些物质，特别是硫酸钡也能促进密度增加并提供辐射不可透性。除了如上述对D2O或铯化合物提供的一般性密度增加外，硫酸钡允许甚至在基本上和/或完全水合时获得这种益处，允许颗粒在混悬液中保持等张。因此，硫酸钡粉末包衣可以提供对生理学克分子渗透压浓度没有影响的惰性沉淀物。
应当理解的是，根据本公开，可以独立使用或联合使用上述的各种漂浮添加剂来为给定的核颗粒和包衣组合提供最大的有益效果。
本发明也包括向哺乳动物体内的局部区域递送活性剂的方法。该方法包括将上述的本发明的至少一个颗粒与局部区域接触，以使得有效量的活性剂局部释放到该区域。可以通过该方法治疗的疾病或病状包括其中与药物的全身吸收相比活性剂的局部或部分应用能达到一些益处的那些。适当的活性剂包括NSAIDS、类固醇、激素、核酸、用于治疗胃肠道疾病例如溃疡、克劳恩病、溃疡性结肠炎、和肠激惹综合征的试剂。其他活性剂可以包括他可莫司、西罗莫司、紫杉醇、顺-/卡铂、抗肿瘤剂、多柔比星和/或受体阻滞剂，例如抑制细胞附着的avβ3整联蛋白阻滞剂。
如果配制的用于将活性剂递送到局部区域的颗粒是约1到约1,000μm的直径，可以用注射器和/或导管作为递送装置将负载药物的微球应用于哺乳动物体内的局部区域，而不会导致非故意性的堵塞。例如，当使用造影剂时，可以把导管插入到腹股沟动脉中，监测其运动直到它到达需要局部给药的区域。可以通过该导管注射在适当注射介质中的颗粒的分散液，确保身体上只有特定的区域用负载药物的小珠(颗粒)治疗。本领域技术人员将会理解，注射介质包括任意本领域已知或将要发展出来的药学可接受的介质，例如盐水、PBS或任何适当的生理性介质。根据本文所述的进一步的实施方案，本发明包括可注射的分散液，其包含颗粒和造影剂，其中该颗粒基本上分散在溶液中。在一个优选的实施方案中，该颗粒也是通过荧光检查可检测的。
本发明的聚合物颗粒可以用于制备活性剂的口服持续释放制剂。该制剂包含如上所述的负载活性剂的颗粒。所利用的聚合物颗粒可以是空心的、基本空心的或固体。在通过喷雾微滴、聚合物熔化的锭剂化或进行低温萃取法制备微小的颗粒前，通过聚合物溶液中的活性剂的分散或溶剂化可以将活性剂负载到颗粒上。可替代地，可以制备未负载的聚合物颗粒，然后浸入到包含活性剂的溶液中。然后将该颗粒在这些溶液中培养足够长的时间，以使活性剂分散到聚合物的基质中。在干燥该颗粒后，将该活性剂保持在聚合物颗粒中。如果利用该负载机制，当已经达到平衡条件时，可以通过调节培养介质的药物浓度和从培养介质中除去颗粒来控制药物负载。
此外，可以设想，可以选择活性剂，以使以协同方式补充颗粒的活性，特别是如果在封闭或栓塞形成方法中使用该颗粒。例如，如果想要使血流最小化的组织是肿瘤组织，可能希望用细胞抑制药或抗有丝分裂药来荷载在该封闭中使用的颗粒。
还提供一种示踪通过哺乳动物体内血管或其他空腔的颗粒的途径的方法。该方法包括向血管、腔或与该腔或血管临近的导管中注射示踪颗粒，其中该示踪颗粒至少是根据上述方法制备的颗粒。
该示踪颗粒可以包括造影剂，当其通过体腔、血管和或其他位置时可以帮助颗粒可见。一般地，在该应用中优选较小的颗粒，例如在约1到约10μm范围内的那些，特别是如果将这些颗粒注射到血流中。但是，颗粒可以是任意尺寸，为此目的，只要它们不是大到封闭血管、体腔、或该方法所应用的临近的腔或血管即可。
如果该颗粒负载有造影剂，根据所使用的造影剂，可以用X-线机或任意其他的造影方法来使它们的运动可见。但是，如果该颗粒不包含造影剂，用基于19F-NMR的计算机X线层扫描术可以使颗粒的流动可见。
如果需要，可以用聚合物包衣包被包含造影剂的示踪颗粒。该聚合物包衣包含任意的本领域已知或将要发展出来的聚合物，包括任意的磷腈聚合物。如果有任何的毒性或造影剂相关的毒性，理想的是一个或多个包衣是生物不可降解的。
本发明也包括进行增强的超声成像(超声波检查)的方法。为了实现这一点，必须给超声受者使用至少一个空心微囊至想要可见的超声受者的该区域。通过本领域已知或将要发展出来的任意方法，包括使用注射器、导管或其他侵入性或非侵入性医疗装置，和/或通过外科切口实现该施用。在这些方法中，优选使用空心或基本上空心的颗粒，即，其具有相当于整个颗粒体积至少约20％，至少约30％，至少约40％，至少约50％，至少约80％，至少约90％的内腔。将空心颗粒施用于想要成像的超声受者的一部分。不希望受任何理论的限制，推测当与周围组织比较时，由于它们密度突然改变，这些颗粒通过增强超声“回音”增强了超声成像。颗粒的空心腔用于反射超声，因此增强了成像。
实施例1 制备直径约500到600μm的微球。首先，制备聚合物溶液，包括将分子量3×106g/mol的PTFEP聚合物溶解于聚合物溶剂乙酸乙酯中，获得2％(wt/v)的聚合物溶液。用5ml注射器将4ml的该聚合物溶液手工滴加到液氮中。该分散液在150ml戊烷的冷冻层上分散(见附图2)。进行3天的低温萃取。随后，从反应管中回收聚合物颗粒，21℃下风干。
实施例2 制备直径约350到450μm的微球。首先，制备聚合物溶液，包括将分子量3×106g/mol的PTFEP聚合物溶解于乙酸乙酯中，获得1％(wt/v)的聚合物溶液。用5ml注射器将4ml的该聚合物溶液手工滴加到液氮中。该分散液在150ml戊烷的冷冻层上分散(见附图2)。进行3天的低温萃取。随后，从反应管中回收聚合物颗粒，21℃下风干。
实施例3 制备直径约500到600μm的微球。首先，制备聚合物溶液，包括将分子量12×106g/mol的PTFEP聚合物溶解于甲基异丁基酮中，获得2％(wt/v)的聚合物溶液。用5ml注射器将4ml的该聚合物溶液手工滴加到液氮中。该分散液在150ml 1∶9(v/v)的乙醇/戊烷混合物的冷冻层上分散(见附图2)。进行3天的低温萃取。随后，从反应管中回收聚合物颗粒，21℃下低压干燥。
实施例4 制备直径约500到600μm的微球。首先，制备聚合物溶液，包括将分子量9×106g/mol的PTFEP聚合物溶解于异戊基酮中，获得2％(wt/v)的聚合物溶液。用5ml注射器将4ml的该聚合物溶液手工滴加到液氮中。该分散液在150ml戊烷的冷冻层上分散(见附图2)。进行3天的低温萃取。随后，从反应管中回收聚合物颗粒，21℃下减压干燥。
实施例5 制备直径约500到600μm的微球。首先，制备聚合物溶液，包括将分子量16×106g/mol的PTFEP聚合物溶解于环己酮中，获得2％(wt/v)的聚合物溶液。用5ml注射器将4ml的该聚合物溶液手工滴加到液氮中。该分散液在150ml 1∶1(v/v)的乙醇/二乙醚混合物的冷冻层上分散(见附图2)。进行3天的低温萃取。随后，从反应管中回收聚合物颗粒，21℃下减压干燥。
实施例6 制备直径约500到600μm的微球。首先，制备聚合物溶液，包括将分子量3×106g/mol的PTFEP聚合物溶解于乙酸乙酯中，获得2％(wt/v)的聚合物溶液。用5ml注射器将4ml的该聚合物溶液手工滴加到液氮中。该分散液在150ml己烷的冷冻层上分散(见附图2)。进行3天的低温萃取。随后，从反应管中回收聚合物颗粒，在21℃下风干。
实施例7 制备直径约500到600μm的微球。首先，制备聚合物溶液，包括将分子量3×106g/mol的PTFEP聚合物溶解于乙酸乙酯中，获得2％(wt/v)的聚合物溶液。用5ml注射器将4ml的该聚合物溶液手工滴加到液氮中。该分散液在150ml乙醇的冷冻层上分散(见附图2)。进行3天的低温萃取。随后，从反应管中回收聚合物颗粒，在21℃下风干。引人注目地，该颗粒是凝胶样的，干燥后形状为椭圆体。
实施例8 制备直径约500到600μm的微球。首先，制备聚合物溶液，包括将分子量3×106g/mol的PTFEP聚合物溶解于乙酸乙酯中，获得2％(wt/v)的聚合物溶液。用5ml注射器将4ml的该聚合物溶液手工滴加到液氮中。该分散液在150ml二乙醚的冷冻层上分散(见附图2)。进行3天的低温萃取。随后，从反应管中回收聚合物颗粒，在21℃下风干。干燥后，所得到的颗粒是致密和均匀的球形。
实施例9 用100ml的二乙醚作为非-溶剂填充到附图6所示的2L冷冻管中。该冷冻管具有的特征和典型尺寸如下表1所示。
表1
缓慢加入液氮，直至非-溶剂冷冻。然后用另外的液氮填充该管，直至当垂直测定上述非-溶剂层时液氮的量上升到约5到10cm。用绝缘的盖封闭该管，通过容器盖上的小开口插入经特氟隆管与注射泵相连的注射器针头。
如附图7所示的注射泵用于分配5到15ml的5到40mg/ml聚合物的乙酸乙酯溶液缓慢进入冷冻管中。该注射泵具有如下特征泵房(J)、注射器(K)和具有相连的特氟隆管(L)的特氟隆分配器。调节泵的速率至约每小时10ml分散体积。用具有1个进口和1到8个出口的特氟隆圆筒将分散体积分布到几个并列的管中。(优选溶剂与非溶剂体积比保持在10％(v/v)以下。除非颗粒可以互相粘附)。在聚合物溶液完全分散在管中以后，再将100ml的非-溶剂缓慢倒入液氮的顶部。
在进行该方法时需要注意，优选用于分散的针头是较小的，例如G33。此外，滴落距离应当超过5cm，以使得在重力下微滴一撞击表面就立即沉入到液氮中。
缓慢蒸发管中的液氮，持续约1天。非-溶剂开始缓慢地熔化，聚合物溶液微滴仍然是冷冻的，沉入到冰冷的非-溶剂中。再培养1天后，通过简单过滤从管中回收现在已凝胶化的聚合物小珠(颗粒)。将它们在室温下干燥约30分钟，然后准备在本文所述的任意用途中使用。
实施例10 通过光学纤维镜、扫描电子显微镜(SEM)和原子力显微镜检查通过实施例1的方法制备的微球的形状和表面形态。这些分析的结果如附图3A和附图3B所示。附图3A显示的是用光学显微镜在4x放大下微球的情况。附图3B显示的是用扫描电子显微镜在100x放大下微球的情况。
可以看到，在玻璃转化温度以上时，未负载的球的表面形态是典型的半结晶聚合物。在整个样品表面，无定型以及结晶区占优势。在自然中表面是微孔性的，孔直径的范围在纳米到数微米之间。
用扫描电子显微镜(100x放大)还分析了负载牛胰岛素的颗粒。这些分析的结果可以参见附图4A和附图4B。
实施例11 进行数个聚合反应以得到优选的核颗粒，使用的是PMMA和三种不同的交联单体(EDGMA、DEGDMA和TEGDMA)、不同的自由基引发剂(过氧苯甲酰(BPO)和过氧月桂酰(LPO))作为络合剂的EDTA，和不同分散剂(Cyanamer 370M、聚丙烯酸(PAA))和各种类型的聚乙烯醇(PVA)的不同组合。在一些聚合反应中，使用磷酸钠缓冲溶液(Na2HPO4/NaH2PO4)。我们观测到，由于所选择的分散剂类型和浓度，一些反应过程进行得并不成功。放热反应的早发，水相和有机相的合并，和玻璃相的过早开始成熟证明了分散剂的失败。显示的仅是成功的例子。下表2显示的是成功的运行，其包括样品(1-6)的组分、浓度和反应条件。
表2

实施例12 评价根据本文所述的方法形成的水凝胶微粒在用于栓塞形成用途时的漂浮性和悬浮性质。该微球包括使用未修饰的聚甲基丙烯酸钾盐水凝胶颗粒的样品(样品A)；使用三氟乙基酯化的聚甲基丙烯酸钾盐水凝胶的样品(样品B)；和使用与样品B相同的水凝胶，但其中用PTFEP包被该颗粒的样品(样品C)。制备含0.05体积％的吐温TM20的等张磷酸盐缓冲盐水溶液，包括将5个磷酸盐缓冲盐水片剂(Fluka)溶解于999.5ml的milliQ超纯水中。向该溶液中加入0.5ml的吐温TM20表面活性剂。然后制备包含20到50体积％的Imeron 300造影剂的等张缓冲盐水溶液用于评价。
然后将制备好的造影剂溶液置于4ml的小瓶中，等分成每份2ml。向该小瓶中加入50-80mg的水合水凝胶样品A-C。首先将每个样品水合，包括向100mg的干水凝胶微球中加入900mg的等张磷酸盐缓冲盐水溶液或D2O，得到1ml溶胀的水凝胶。立即和在其后每10分钟测定漂浮性，直至达到和/或超过漂浮平衡。
在包含30-40％造影剂的造影剂溶液内，所有颗粒在5分钟内达到平衡密度。用D2O溶胀的颗粒在开始的10分钟内是较重的，但在15-20分钟的浸入中D2O并没有随着时间而从颗粒中分散出来。如果不加入可以取代D2O的水，用D2O水合的微粒将能够增加达到适当漂浮时造影剂的百分比至多达5％。当加入的造影剂百分比达到40-50％时，颗粒随着时间开始漂浮在顶部。
溶液中造影剂为31±1体积％时，样品C实现了平衡的漂浮(与密度匹配)。至于样品A和B，溶胀行为和随后的密度典型地取决于交联的含量、pH，离子强度和所使用阳离子的原子价。但是，本文假定，由于聚甲基丙烯酸水凝胶物质的海绵样性质，因此溶胀剂量不会影响漂浮。在样品C中用PTFEP包被这些物质后，观测到溶胀的时间延迟，更慢地达到了漂浮平衡。
实施例13 为了考虑时间延迟和达到更优选的密度，以及增强颗粒的荧光可见性，然后在实施例12的样品B和C使用的微粒类型中进行铯处理。
将100mg的样品C和样品B分别在30重量％的氯化钠溶液中水合10分钟。平衡后倾析上清液，用去离子水彻底洗涤微粒。然后将它们再平衡10分钟，倾析并悬浮于3ml pH 7.4的不含表面活性剂的等张磷酸盐缓冲溶液中。然后用含不同的20到50体积％Imeron300的造影剂溶液评价对漂浮的作用。在该实施例中，使用0.1g的样品B和C的微粒。将3.5ml的Imeron 300造影剂加入到包含4.0ml等张磷酸盐缓冲液/吐温TM20溶液的初始缓冲溶液中。
使用氯化铯的平衡过程得到了密度增加的颗粒。两个微粒样品在造影剂浓度为45-50％的Imeron300的造影剂溶液中显示了最终的漂浮性，而不管是否存在吐温TM20表面活性剂。饱和条件似乎取决于颗粒的初始pH，在过程中所使用的pH和颗粒中甲基丙烯酸基的相应饱和量。当pH小于3.6时，观测到了质子和阳离子之间的不断转换。结果，在pH约3.6以上并低于约6.6时显示了更有益的结果，以调节铯的量。在优选范围内，漂浮性可以不同。在合理的中度水平时，根据在pH 7.4的试验，在造影剂缓冲溶液中保存过夜后，微粒不会失去它们的漂浮性。
实施例14 进一步进行实施例12的样品B和/或C微球的压缩性和机械性质试验。附图8所示的是用于进一步评价的压力试验架。具有可提供0到250mm/小时的可变进料速率的发动机4和齿轮箱6的自动注射器柱塞2，进一步装备能测定0到500N范围内力的Lorenz压力传感器8。如所示，自动注射器柱塞2与注射器体10相通。用个人计算机记录传感器的数字输出。用5ml的造影剂溶液填充注射器体10，其中该溶液是造影剂浓度为约30-32体积％的等张磷酸盐缓冲/表面活性剂(吐温TM20)溶液。向注射器中提供56mg干重的微粒。然后通过与注射器的远端14相连的微导管12注射注射器中的内容物。微导管的腔直径是533μm。测定将微粒通过导管压入到Petri培养皿(用于接收微粒溶液)中的力量，并记录为压力。
为了进行一些计算，根据栓塞形成中微球的典型应用提供下列信息。典型地，这些微球的水含量是约90％，因此使得用于栓塞形成的小瓶中包含在9.8ml的注射液中的0.2mg栓塞形成颗粒(2ml的水合微粒在8ml上清液中)。标准制备过程包括，向单个小瓶的内容物中加入8ml的Imeron300造影剂。这将使注射溶液中8ml/(9.8ml+8ml)造影剂的平衡浓度是＝44.9体积％。典型地将该溶液抽吸到1ml的注射器中用于最后的递送。因此注射液密度等于 p＝VEmb/VTot＝2ml/18ml＝每体积分数0.111栓塞形成剂。
样品C球显示了与典型的栓塞形成球几乎相同的平衡水含量。为了实现典型的手术操作所需的相同注射液密度，取56mg的样品C微球加入到5ml如上所述的31体积％造影剂的等张磷酸盐缓冲液和表面活性剂溶液中。
在pH 7.4下在相同腔直径的不同微导管中评价样品B和C的微球。使用不同的漂浮水平和不同的溶胀水平进行水平和垂直方向的注射(基于pH 6.0，与pH 7.4形成对照)。结果表明，只要微粒的直径小于微导管的内径，微粒就会以与参照溶液相同的方式通过导管，而没有其他的摩擦力。当微粒直径达到与腔直径相同的尺寸时，测定到重力增加到约1.0到1.4kg。当压缩约20％时，需要约1.5-2.3kg的力克服导管内的摩擦力。用超过5kg的力作为从中度到较高注射压力的指标。当颗粒比注射介质更重时，以垂直位注射时观测到了堵塞。当以水平位注射微粒时，观测到减轻了严重的堵塞，随着时间的过去可以注射更大的体积。
当与水平注射联合使用较低的pH(减少溶胀)时可以进一步降低注射压力，使得注射压力与注射介质本身相当。此外，在生理pH时样品C的微粒也显示了良好的注射压力形式。导管进口不会堵塞，而且曲线中每个峰对应于通过导管的单个颗粒或很多颗粒。
不同的导管模拟试验的结果表明，本发明可以用于形成可注射的微粒，其具有与在栓塞形成中应用的注射介质的密度基本匹配的密度。该颗粒的压缩性可以进一步使得它可以不在注射器柱塞上施加超过5kg的力而注射。注射介质的pH可以降低到约6或可以水平注射来使样品B和C的微粒更易于通过导管。当在血流中时，该颗粒可以在pH 7.4环境下膨胀成它们原来的尺寸。
在样品C的微粒上进行其他的溶胀试验，观测到当离子浓度较低时溶胀提高。在较高浓度的溶液中溶胀降低。在缓冲溶液中样品C的微粒连续稀释导致了微粒的尺寸从17％增加到20％。当混合到等张磷酸盐缓冲溶液中时，微粒尺寸开始时增加83.8到97％，其中在去离子水中，尺寸比干燥颗粒增加了约116.2到约136.6％。
在进一步评价样品C微粒的压缩性的试验中，使用附图8的注射压力试验架，但是用光学显微镜来评价通过逐渐狭窄的吸量管的微粒，其中该吸量管附在与包含样品C微粒的磷酸盐缓冲溶液的悬浮液的注射器相连的聚乙烯管上。该吸量管狭窄到内径为490μm，把该吸量管装到Petri培养皿上以使最窄的部分浸入到磷酸盐缓冲溶液中以避免光学失真和在测定期间收集从吸量管中喷出的液体。在压缩前和压缩期间得到了通过吸量管的微粒的光学显微镜图像。当观测该微粒时，它们都没有破裂，也没有在通过狭窄位点后形成碎屑或包衣分层。特意选择的相对于狭窄位点过大的微粒(压缩约40％)没有损坏或破裂，但堵塞了狭窄位点。当仍允许微粒通过导管时，在合理尺寸的力下最大的压缩是约38.7％。根据这些评价，根据样品C的微粒显示了下列性质其允许太大的颗粒堵塞导管而不是破碎，导致对患者可能的损害。该试验结果提供如下表3所示的样品C颗粒用于栓塞形成用途的优选使用参数
表3
用样品C的微粒进行机械和热应力稳定性试验。在通过Terumo Progreat Tracker导管后，用去离子水洗涤该微粒以除去残留的缓冲溶液和造影剂。它们在60℃脱水12小时，然后转移到SEM中进行表面分析。将它们与原批次的微粒相比较，其中后者在milliQ超纯水中经过相同的水合/脱水循环，但是其没有通过导管。附图9A和9B分别显示的是在水合/脱水循环后即刻样品C微粒的表面和示例性的样品C微粒的膜厚度。在通过导管后，不同放大率下的SEMs(附图10A，10B，10C和10D)表明，包衣没有分层(附图10A)。一些微粒没有在包衣膜中显示伸展(附图10B和10C)。但是，附图10D的较近的放大率表明，包衣层的形态仍然是完整的。
用2L的去离子水和10个各含有56mg的样品C微粒的3.3g等张磷酸盐缓冲液/表面活性剂(吐温TM20)的小瓶填充灭菌器，并开启。约15分钟达到水沸点。在灭菌器开始灭菌以后，将温度保持在该点3分钟以通过水蒸气除去气体。然后封闭该管，提高压力和温度至1.2bar和125℃。这用了约10分钟。然后将该温度保持约15分钟并关闭该管以进入冷却阶段。约30分钟后温度达到约60℃，然后给该管开口，收回样品并紧闭该管。打开样品瓶，倾析出上清液。用去离子水洗涤微粒。在脱水后，用SEM测定它们。结果表明，在该热应力下微粒上仅有少量分层的包衣(见附图11A，强烈的白色对照部分)。这些微粒的总百分比仅约5到10％。总之，发生的膜分层是沿着PTFEP包衣的晶体-无定性区界面发生的(见附图11B)。大多数的微粒仅显示了很小的缺损(例如缺失很小的圆斑)，但是微粒的外壳没有损坏(见附图11C和11D)。
实施例15 根据本文一个优选的实施方案形成微粒。用约23g重均分子量约85,000-124,000的PVA，此PVA约87-89％水合，和1000g水制备聚乙烯醇(PVA)的去离子水溶液。用900g去离子水，4.53g磷酸氢二钠，0.26g磷酸二氢钠和0.056g乙二胺四乙酸(EDTA)制备磷酸盐缓冲溶液。在使用前，真空蒸馏甲基丙烯酸甲酯(MMA)单体。
在连接有KPG机械搅拌装置的三颈圆底的2000ml烧瓶中进行聚合。该烧瓶也装配有温度计、回流冷凝器和具有氮气进口的压力缓解阀。该聚合方法进一步利用上述制备的100ml的PVA溶液，900ml的磷酸盐缓冲溶液，0.65g的过氧二月桂酰，200.2g甲基丙烯酸甲酯和2.86g三甘醇二甲基丙烯酸。
将PVA和缓冲溶液置于反应烧瓶中。引入蒸馏过的MMA和三甘醇二甲基丙烯酸，然后向相同的烧瓶中加入过氧二月桂酰，搅动这些组分以确保固体溶解。用氩气冲洗该反应烧瓶，将搅拌器速度设置为150rpm以产生主要在300-355μm范围内的粒径。继续搅拌约5分钟。然后将搅拌器设置为100rpm，停止氩气冲洗。然后将反应烧瓶置于加热到70℃的水浴中，在大约该温度下保持约2小时。然后把水浴的温度提高到73℃，保持1小时，然后再把水浴温度提高到85℃，再保持1小时。停止搅拌和加热。过滤该溶液，在70℃烘箱中将得到的聚甲基丙烯酸酯微粒干燥约12小时。将微粒过筛，并按照100-150；150-200；200-250；250-300；300-355；355-400；和400-450μm的尺寸级数收集，最大的产量是300-355μm。
然后水解因此形成的PMMA微粒。向2000ml烧瓶中加入100g 250-300μm尺寸的微粒，150g氢氧化钾和1400g乙二醇，该烧瓶与具有干燥管的回流冷凝器相连，该混合物在165℃加热8小时以完全水解。将混合物冷却至室温，倾析出溶液，用去离子水洗涤微粒。对其他标明尺寸的微粒重复该方法(提供下面的反应时间300-355微米颗粒10小时；355-400微米颗粒12小时和400-455微米颗粒14小时)。
最后用盐酸将微粒酸化成pH 7.4，并在约7 0℃的干燥箱中干燥。
实施例16 然后在本实施例中将根据实施例15形成的微粒酯化。当进行酯化表面处理时，在具有回流冷凝器的2L反应瓶中将实施例15的800g干燥微粒称重。搅拌下加入250g亚硫酰氯的1.5L二乙醚溶液。继续在室温下搅拌20小时。过滤除去溶剂和挥发性试剂，然后真空干燥。然后引入500g三氟乙醇的1.5L醚溶液，然后在室温下将该混悬液再搅拌20小时。最后真空干燥该颗粒。
实施例17 在实施例16一个可替代的表面处理中，将实施例15的800g干燥微粒与1140g三氟乙醇反应，并加入44g硫酸作为催化剂。然后在室温下将该混合物搅拌20小时，过滤并真空干燥。
实施例18 在MP-1 Precision CoaterTM流化床包衣装置(购自Aeromatic-Fielder AG，Bubendor，Switzerland)中，用PTFEP给如实施例15-16所述用三氟乙醇部分酯化的800g干燥PMMA钾盐微粒喷雾包衣。通过气流(40-60m3/小时，进入温度55℃)扬起颗粒，用来自气-液共轴喷嘴的PTFEP溶液微滴进行喷雾包衣。该溶液组合物是0.835g PTFEP，550g乙酸乙酯和450g乙酸异戊酯。它通过喷嘴的1.3mm宽的内孔以10-30g/分钟的速率进料。在喷嘴头部，用增压气体(2.5bar)雾化。计算喷雾溶液的总量(3kg)以便用150nm厚的PTFEP膜包被颗粒。
实施例19 在可商购的流化床包衣装置(见实施例16)中，用稀释的PTFEP的乙酸乙酯溶液给如上所述用三氟乙醇部分酯化的实施例15-16的干燥钾盐微粒喷雾包衣。取100mg的所述包衣的干燥微粒和用三氟乙醇部分酯化的100mg的未包衣、干燥PMA钾盐微粒浸入到约30％的氯化铯水溶液中，其中该氯化铯水溶液是通过将30.0g氯化铯溶解于100ml去离子水中制备而成的。10分钟的平衡时间后倾析出上清液。用去离子水彻底洗涤微粒，再平衡10分钟，倒出，悬浮在pH 7.4的3ml不含表面活性剂的磷酸盐缓冲溶液中。测定溶液中颗粒的密度以与造影剂溶液的密度匹配。向每种类型的微粒中加入造影剂溶液，其中该造影剂溶液包含3.5ml的Imeron300造影剂(密度1.335g/ml)和4ml磷酸盐缓冲盐水(密度1.009g/ml)的比例。两种水凝胶类型都在溶液中造影剂为45-50％水平时实现了漂浮。这与微粒的密度增加为1.16g/ml相对应。
实施例20 根据实施例15的方法形成微粒，除了中和颗粒后在微粒上制备外层硫酸钡包衣，和在中和后、硫酸钡包衣步骤前不干燥微粒。为制备硫酸钡包衣，取2500ml水合颗粒加入到2000ml的0.5M硫酸钠(Na2SO4)溶液中，并饱和24小时。然后搅拌下于室温向该颗粒混悬液中缓慢加入1950ml的0.5M氯化钡(BaCl2)溶液。用过量去离子水洗涤后，所得到的溶胀状态的颗粒包括包被硫酸钡粉末的表面。然后干燥该颗粒，并用如实施例16所述的方法酯化。然后用下文实施例21的流化床方法包衣。用非粘附性的硫酸钡粉末给所得到的微粒进行外层包被。根据本发明制备的硫酸钡包衣和方法能防止在干燥期间颗粒团聚，也能增加密度。硫酸钡的浓度和比例可以不同，以得到不同的结果，使用过量的硫酸钠可以使残留的氯化钡最少。用热水有效洗涤根据本实施例形成的颗粒，使可以污染试管等等的过量硫酸钡粉末最少。硫酸钡的作用是在干燥前有效防止颗粒粘附，为水合微粒的流化作用提供帮助。
实施例21 用具有在实施例20中形成的硫酸钡表面层的聚甲基丙烯酸小珠进行小珠的硫酸钡粉末流化床包衣，但使用过量的氯化钡以使得钡离子分散到核中并在水凝胶核中形成沉淀。
在颗粒的制备中，重复与实施例20所述的硫酸钡包被颗粒的相同方法，除了加入顺序相反。因此，取2500ml水合微粒缓慢悬浮于2500ml去离子水中，搅拌下缓慢加入5mol％(200ml)的0.5M(BaCl2)。在3分钟的时间内完成加入以防止不可逆地生成丙烯酸钡。然后立即用双倍量(400ml)的0.5M硫酸钠(Na2SO4)溶液在搅拌和室温下加入到该混悬液中使反应立即终止。然后，每次用2L的去离子水将颗粒洗涤3次。该方法将硫酸钡沉淀到颗粒中。
所得到的沉淀物沉淀在水凝胶核的孔中，并且不能通过用水多次洗涤而除去。因此发现与未修饰的颗粒不同，这样形成的颗粒具有永久增加的密度。通过使用的氯化钡的摩尔量可控制密度的增加。该方法在使用0-15mol％范围的氯化钡时具有重现性。在评价该方法时我们观测到，如果加入的时间超过5分钟，根据颗粒内氯化钡的分散速率，水凝胶核的外侧孔不可逆地交联，防止了里面的硫酸钡沉淀浸出。该效果通过光学显微镜是可见的，因为硫酸钡的“扩散前沿”在颗粒中是白色带，清晰可见，而表面则保持澄清。
实施例20和21都提供了具有抗粘性质，不会在干燥过程中团聚的颗粒；因此避免了表面损坏。一般地，这样的优点使流化床方法所需的颗粒的量最小，因为这些颗粒可以流动而不必完全干燥。根据不发生团聚时的干重，残留的水含量可以增加至高达1∶1。本实施例也制备了具有密度增加性质的颗粒，其中密度的改变是永久的。
根据本公开，应当也可以理解，当使用本文所述的方法时，根据本发明引入的硫酸钡的范围可以是0到约100mol％，优选0到约15mol％，以提供具有优选的弹性、密度和机械稳定性的颗粒。
然后根据实施例16酯化本实施例形成的在核中负载硫酸钡的颗粒，并真空干燥。取300g的干燥小珠悬浮于300g水中，其在不到1分钟内被聚甲基丙烯酸核心完全吸收，而硫酸钡粉末的颗粒表面显示干燥状态，颗粒没有显示出团聚的趋势。
根据实施例18在MP-1 Precision CoaterTM流化床包衣装置中，用APTMS/PTFEP给含有50重量％(wt％)水的颗粒(现在是600g)喷雾包衣，除了使用另外的氨基硅烷粘附促进剂。所使用的加工设备与实施例18相同，但是所提供的包衣包括三个不同的层。提供的底层包衣是3-氨基丙基三甲氧基硅烷(APTMS)粘附促进剂，上面是APTMS和PTFEP的混合物的第二包衣层，第三、顶部包衣层是PTFEP。制备所有三种喷雾溶液，包括将包衣物质溶解于乙酸异戊酯和乙酸乙酯的1∶1重量百分比的混合物中。第一溶液包括溶解在200g乙酸混合物中的35μl APTMS。第二溶液包括在150mg乙酸混合物中的25μl APTMS和125mg PTFEP，第三溶液包括在60g乙酸混合物中的50mgPTFEP。喷雾溶液的量和浓度适用于300g批次的350μm颗粒的包衣。以5-10g/分钟的速率蒸发吸收的水。30分钟后当包衣厚度达到100nm时，停止该方法，残留的水含量是18.4wt％。
实施例22 在根据实施例15形成的微粒上试验有机染料的吸收。向包含1ml的水合小珠的2ml磷酸盐缓冲盐水溶液中加入5-10μl量的各个染料作为10mmol乙醇溶液。在室温下，在小瓶中轻柔振荡培养样品30-60分钟。倾析上清液，在用光学和荧光显微镜观察前用2ml的去离子水、盐水或PBS缓冲溶液洗涤颗粒3次。试验的染料包括三苯甲烷衍生的染料例如二乙酸荧光黄和罗丹明6G，将它们与基于碳花青的染料例如DiI一起评价。基于三苯甲烷的荧光黄和罗丹明染料通过离子相互作用显示了对亲水的PMMA水凝胶核的特异性亲和力。它们能容易地抵抗重复洗涤和蒸汽灭菌的严格条件，而基本上不会浸出。
另一方面碳花青染料DiI对疏水的PTFEP壳显示了高度选择性，而不会渗入到亲水的PMAA核物质中。因此，当随后用DiI和二乙酸荧光黄的组合染色时，使用荧光光学显微镜同时可见核和壳。因此，该方法提供了一种PMAA颗粒的快速、敏感的荧光染色分析法，其使核和壳在实际应用中遇到的条件下是同时可见的。它进一步能评价机械-弹性应力或对PTFEP壳的损害。它进-步显示了某些类型的染料对颗粒中不同组分的亲和力。
具有本领域普通技术的人员将会认识到，可以对上述的实施方案进行改变而不脱离本发明的广义概念。因此，应当理解，本发明并不仅限于上述公开的特定实施方案，它试图覆盖在附属的权利要求中定义的本发明的精神和范围内的改变。
权利要求
1.一种在治疗和/或诊断过程中使用的颗粒，该颗粒包含聚[二(三氟乙氧基)磷腈]和/或其衍生物.
2.根据权利要求1的颗粒，其中该颗粒是多孔性颗粒。
3.根据权利要求1的颗粒，其中该颗粒包含核和外层包衣，其中该核包含由基于丙烯酸的聚合物形成的水凝胶，该包衣包含聚[二(三氟乙氧基)磷腈]和/或其衍生物。
4.根据权利要求3的颗粒，其中该核进一步包含硫酸钡。
5.根据权利要求4的颗粒，其中该核由硫酸钡的内层包衣包裹，外层包衣包裹硫酸钡的内层包衣。
6.根据权利要求4的颗粒，其中硫酸钡吸收到核中。
7.根据权利要求3的颗粒，其中该颗粒进一步包含增加颗粒密度的试剂。
8.根据权利要求7的颗粒，其中该试剂选自氧化氘、铯、至少一种有机染料、硫酸钡以及它们的组合。
9.一种在哺乳动物中使流向组织的血流最小化的方法，包括用至少一个颗粒封闭哺乳动物血管的至少一部分，其中该颗粒包含聚[二(三氟乙氧基)磷腈]和/或其衍生物。
10.根据权利要求9的方法，其中该颗粒包含核和外层包衣，其中该核包含由基于丙烯酸的聚合物形成的水凝胶，该外层包衣包含聚[二(三氟乙氧基)磷腈]和/或其衍生物。
11.根据权利要求10的方法，其中颗粒核进一步包含硫酸钡作为包衣和/或吸收到核中。
12.一种递送活性剂至哺乳动物体内的局部区域的方法，包括用至少一个颗粒与该局部区域接触，该颗粒包含聚[二(三氟乙氧基)磷腈]和/或其衍生物和活性剂，以将有效量的活性剂暴露于局部区域中。
13.根据权利要求12的方法，其中该颗粒包含核和外层包衣，通过外层外衣递送活性剂，其中外层包衣包含聚[二(三氟乙氧基)磷腈]和/或其衍生物。
14.根据权利要求13的方法，其中颗粒核进一步包含硫酸钡作为包衣和/或吸收到核中。
15.根据权利要求12的方法，其中该颗粒包含基于丙烯酸聚合物的水凝胶核和外层包衣，在核中递送活性剂并通过外层包衣分散，其中外层包衣包含聚[二(三氟乙氧基)磷腈]和/或其衍生物。
16.活性剂的口服持续释放制剂，该制剂包括聚合物胶囊和活性剂，其中该聚合物胶囊包含聚[二(三氟乙氧基)磷腈]和/或其衍生物。
17.根据权利要求16的持续释放制剂，其中该聚合物胶囊包含核和包裹核的包衣，其中该包衣包含聚[二(三氟乙氧基)磷腈]和/或其衍生物，该核包含基于丙烯酸的聚合物水凝胶。
18.根据权利要求17的方法，其中颗粒核进一步包含硫酸钡作为包衣和/或吸收到核中。
19.一种示踪通过哺乳动物血管的颗粒途径的方法，该方法包括向哺乳动物的血流中注射至少一个示踪颗粒，该示踪颗粒包含聚[二(三氟乙氧基)磷腈]和/或其衍生物和造影剂，并使颗粒的途径成像。
20.根据权利要求19的方法，其中示踪颗粒包含核和包裹核的包衣，其中该包衣包含聚[二(三氟乙氧基)磷腈]和/或其衍生物，该核包含基于丙烯酸的聚合物水凝胶。
21.根据权利要求20的方法，其中颗粒核进一步包含硫酸钡作为包衣和/或扩散到核内。
22.根据权利要求19的方法，其中造影剂选自硫酸钡、钽化合物、钆化合物和含碘的化合物。
23.一种增强的超声成像方法，包括给超声受者在该超声受者的一个区域施用至少一个包含聚[二(三氟乙氧基)磷腈]和/或其衍生物的空心微囊，并用超声将受者的该区域成像。
24.一种递送活性剂至哺乳动物体内的局部区域的方法，包括用至少一个颗粒与该局部区域接触，该颗粒包含聚[二(三氟乙氧基)磷腈]和/或其衍生物和活性剂，以将有效量的活性剂暴露于局部区域中，其中，该颗粒包含一种增加密度的试剂。
25.根据权利要求24的方法，其中该增加密度的试剂选自氧化氘、铯、至少一种有机染料、硫酸钡以及它们的组合。
26.根据权利要求24的方法，其中该颗粒包含外层包衣和核，其中该外层包衣包含聚[二(三氟乙氧基)磷腈]和/或其衍生物，该核包含基于丙烯酸的聚合物水凝胶，其中用氯化铯预处理该颗粒以给颗粒提供铯。
27.根据权利要求24的方法，其中该颗粒包含外层包衣和核，其中该外层包衣包含聚[二(三氟乙氧基)磷腈]和/或其衍生物，该核包含基于丙烯酸的聚合物水凝胶和硫酸钡。
28.根据权利要求27的方法，其中硫酸钡作为核上的包衣存在。
29.根据权利要求27的方法，其中硫酸钡在核内分散。
30.一种使由丙烯酸基聚合物形成的颗粒团聚和/或聚集最小化的方法，包括给该颗粒的核和/或表面提供硫酸钡。
31.根据权利要求30的方法，其中该颗粒包含聚[二(三氟乙氧基)磷腈]和/或其衍生物的外层包衣，该方法进一步包括使对外层包衣的破坏最小。
全文摘要
提供颗粒以在治疗和/或诊断过程中使用。该颗粒包括聚[二(三氟乙氧基)磷腈]和/或其衍生物，其可以存在于整个颗粒中或在颗粒的外层包衣中。该颗粒也可以包括含有基于丙烯酸的聚合物形成的水凝胶的核。也可以在颗粒的核上提供硫酸钡作为包衣或吸收到颗粒的核中。该颗粒可以用于使流向哺乳动物组织的血流最小，包括封闭哺乳动物血管的至少一部分，或通过将至少一个颗粒接触局部区域来递送活性剂至哺乳动物体内的局部区域。进一步地，该颗粒在包含活性剂的口服持续释放制剂中是有用的，还可作为示踪颗粒注射到哺乳动物的血流中，或在增强的超声成像中使用。该颗粒可以包括增加密度的试剂，以在混悬液中实现有用的漂浮水平。
文档编号A61K9/51GK101090710SQ200580036622
公开日2007年12月19日 申请日期2005年10月24日 优先权日2004年10月25日
发明者P·哈德尔, O·弗里茨, U·弗里茨 申请人:宝利策尼克斯有限公司