一种眼用荷正电纳微球药物载体及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于药物载体领域，具体涉及一种眼用荷正电纳微球药物载体及其制备方法，实现眼内定向转运药物。
技术背景
[0002]眼底疾病是极具视觉损伤和致盲风险的眼部病变，并且病种多样，既包括老年黄斑变性、糖尿病视网膜病变、视网膜静脉阻塞、早产儿视网膜病变等常见的视网膜/脉络膜血管性疾病，也包括巨细胞病毒性视网膜炎、急性视网膜坏死等感染性疾病。由于人口老龄化、艾滋病的传播、不健康生活习惯和早产儿的救护水平提升等多种因素，近年来眼底疾病的发病率不断上升，据北京市最新的流行病学调查数据显示，各类眼底疾病的总发病率在1.4%以上，需要通过药物治疗的眼底疾病保守估计在1.2%以上。
[0003]玻璃体腔注射药物是临床治疗眼底疾病的重要方式，尽管如此，玻璃体注射给药在临床应用上仍存在许多缺陷:(I)半衰期短，需要频繁的重复注射;(2)药物在眼内自由弥散，无特异性；(3)无法调控药物进入视网膜的不同亚层。
[0004]眼球存在生理性电势差，有如天然电池，前端为正极，后端为负极。如图1所示，同中性或带负电荷的粒子相比，带正电荷的粒子将更趋向于被眼后段的视网膜表面吸附；同时，带正电的高分子如壳聚糖还被证明可以可逆地打开细胞间的紧密连接，便于进一步进入视网膜深层。因此，如能巧妙利用眼内微电场这一生理特性，通过制备粒径尺寸和表面电荷可调控的纳微球，研究带电粒子在眼内微电场中的运动行为，系统评价纳微球的荷/质比对视网膜定向及进入视网膜不同层次的影响，就有可能筛选出能够用于玻璃体腔注射、可定向视网膜、并能调控进入视网膜不同亚层的纳微球，在此基础上进一步包埋药物，实现对于药物的缓慢释放，解决眼内药物注射存在的一系列问题。因此，开发兼具多级定向和缓释功能的药物载体系统无疑会很大程度上减少玻璃体腔注射药物的频率和副作用，提升治疗效果，无论在医疗价值、社会效益还是市场应用上，都前景广阔。
【发明内容】
[0005]针对现有技术的不足，本发明提供一种可眼内定向转运药物的药物载体，该载体需具有一定的正电荷，经过玻璃体腔注射后可以在眼内微电场的作用下富集于眼底;进一步通过调节电荷量，可以进一步调控载体渗透进入眼底的不同亚层，从而实现对眼底亚层病变部位的多级靶向作用，解决药物生物利用度低，毒副作用大等问题，显著提高治疗效果O
[0006]为达到此发明目的，本发明采用如下技术方案:
一种荷正电纳微球药物载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤:
步骤一、称取一定量的油溶性高分子溶解于有机溶剂中作为油相，与水相混合后制备水包油型乳液；
步骤二、将步骤一的水包油型乳液在室温下搅拌过夜至有机溶剂挥发完毕，用蒸馏水离心洗涤若干次，得到纳微球；
步骤三、将上述制得的纳微球悬浮于不同浓度的亲水性正荷电高分子溶液中，在垂直混悬仪上孵育，进行正电荷修饰；
步骤四、微球的电荷量可以通过高分子的浓度或者电荷基团的取代度来调节；
至此，荷正电纳微球药物载体的制备完成。
[0007]其中，进行药物包埋时，若药物为疏水性药物，则在步骤一中将药物与油溶性高分子一起溶解于油相中进行包埋;若药物为亲水性药物，则先将其溶解为内水相，再采用复乳的形式进行负载，或在步骤三或步骤五中与荷电高分子一起吸附在纳微球上。
[0008]作为本发明的优选技术方案，所述步骤一中，水包油型乳液的制备方法为搅拌法、超声法、沉淀法、均质乳化或微孔膜乳化法，优选能够制备出均一乳液的微孔膜乳化技术。
[0009]优选的，所述步骤三中，采用的电荷修饰方法为吸附法或化学偶联法。
[0010]所述步骤一中，油溶性高分子可以为聚乳酸类高分子或聚酯类高分子。
[0011 ] 所述步骤二中得到的纳微球的粒径范围为Inm?ΙΟμπι，优选10?500nm的纳米球。
[0012]所述步骤三中，其中正电荷的高分子可以为壳聚糖、季铵化壳聚糖、聚乙烯亚胺或聚赖氨酸。
[0013]本发明还保护一种荷正电纳微球药物载体，其特征在于:其利用权利要求1?5任意一项所述的方法制备形成，粒径范围为Inm?ΙΟμπι，优选1nm?500nm;电荷范围为0.1?2 O Omv，优选 5 ?50mv。
[0014]此外，还保护上述荷正电纳微球药物载体作为眼内疾病治疗用药物定向转运载体的应用。其中，所述眼内疾病为老年黄斑变性、糖尿病视网膜病变、视网膜静脉阻塞、早产儿视网膜病变、巨细胞病毒性视网膜炎或急性视网膜坏死。
[0015]所述眼内疾病治疗用药物是小分子化学药物、蛋白质多肽类药物、抗体药物或基因药物等其中的一种或者多种联用。
[0016]与现有技术相比，本发明的技术优势在于:
1、本发明药物载体带正电荷，可以实现在眼内的定向转运，经过玻璃体腔注射后，在眼内微电场作用下富集于眼底;通过调节载体的荷电量，可以进一步调控载体渗透进入眼底的不同亚层，从而实现对眼底亚层病变部位的多级靶向作用，解决药物生物利用度低，毒副作用大等问题，显著提高治疗效果；
2、本发明药物载体可使用的原料来源广泛，可针对不同眼底疾病装载不同的药物，具有普适性。
【附图说明】
[0017]图1是不同荷正电纳微球药物载体在眼内微电场作用下的运动及分布示意图；
图2是不同荷电NP的制备不意图；
图3是NP++的扫描电镜图；
图4是NP—、NP-、NPO、NP+、NP++不同的荷电NP置于稀释的凝胶中在体外模拟微电场作用下的运动情况；
图5a是体外渗透模拟装置示意图；
图5b是不同荷电的NP渗透单层RF/6A视网膜血管内皮细胞的定量数据； 图5c是不同荷电的NP渗透单层RF/6A细胞的激光共聚焦照片；
图5d是不同荷电的NP对离体猪眼视网膜的渗透情况；
图6a是注射不同荷电NP(荧光标记)后的离体眼球荧光成像；
图6b是不同荷电NP的眼内滞留时间；
图6c不同荷电NP在眼底的渗透情况；
图7a为眼底血管造影图片；
图7b脉络膜新生血管铺片；
图7c脉络膜新生血管面积分析；
图7d治疗后眼压数据。
【具体实施方式】
[0018]以下通过【具体实施方式】来进一步说明本发明的技术方案，所述实施例仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。如图1所示，是不同荷正电纳微球药物载体在眼内微电场作用下的运动及分布示意图理论上，本发明药物载体带正电荷，可以实现在眼内的定向转运，经过玻璃体腔注射后，在眼内微电场作用下富集于眼底;通过调节载体的荷电量，可以进一步调控载体渗透进入眼底的不同亚层，从而实现对眼底亚层病变部位的多级靶向作用，解决药物生物利用度低，毒副作用大等问题，显著提高治疗效果。理论上，只要是正电荷的药物载体均具备上述多级靶向的潜力，制备方法和所用材料并不局限于上述内容。
[0019](I)称取一定量的油溶性高分子溶解于二氯甲烷中作为油相，1#%聚乙烯醇(polyvinyl alcohol，PVA)为水相，混合后制备0/W(水包油)型乳液，室温搅拌过夜至二氯甲烷挥发完毕后，用蒸馏水离心洗涤5次，即可得到纳微球。其中油溶性高分子可以为聚乳酸类高分子、聚酯类高分子等;其中制备乳液的方法可以是通过搅拌、超声、均质乳化或者微孔膜乳化的技术，优选能够制备出均一乳液的微孔膜乳化技术;其中纳微球的粒径范围在Inm?ΙΟμπι，考虑到小粒径具有更高的荷质比，有利于在微电场中的运动，优选10?500nm的纳米球(Nanopart icle，NP)。
[0020](2)将上述制得的NP悬浮于不同浓度亲水性的正荷电高分子溶液中，在垂直混悬仪上孵育后，高分子将借助静电作用吸附于负电荷的NP上，用去离子水离心洗涤既得带不同程度正电荷的NP。其中正电荷的高分子可以为壳聚糖、季铵化壳聚糖、聚乙烯亚胺、聚赖氨酸等;其中载体电荷范围在0.1?200mv，优选5-50mv，以兼顾荷电量和生物安全性。
[0021](3)作为对照组，(2)中的NP可以进一步悬浮于不同浓度亲水性的负荷电高分子溶液中，在垂直混悬仪上孵育后，高分子将借助静电作用吸附于正电荷的纳微球上，用去离子水离心洗涤即得带不同程度