一种ros响应的纳米药物递送系统及其制备方法与应用
【技术领域】
[00011本发明涉及药物制剂领域，尤其涉及一种R0S响应的纳米药物递送系统及其制备 方法与应用。
【背景技术】
[0002] 化疗是肿瘤确诊之后常用的治疗方法，但化疗常伴随很多副作用，为了获得最好 的治疗效果同时避免副作用，许多纳米材料用来负载缓释化疗药物。这些药物通常能靶向 于肿瘤，且药物释放是可控制的。比如pH敏感型，还原敏感型，温度敏感型，酶敏感和光敏感 型等等，但活性氧自由基(R0S)应答的药物释放很少有人研究。光控产生的R0S刺激具有能 够精确控制释放的时间和位点的优点。
[0003] 肿瘤细胞的R0S压力比正常细胞要高，一部分原因可能来源于癌基因的刺激增加 了代谢活性和线粒体的功能紊乱。在相同的R0S压力下，正常细胞比肿瘤细胞能处理更多的 R0S。因此，适当提高细胞中R0S的水平能达到选择性杀伤肿瘤细胞的作用。光动力治疗能产 生R0S杀伤细胞，光敏剂二氢卟吩e6(Ce6)作为第二代光敏剂，有较高的R0S产率，常被用于 光动力治疗。
[0004] 近些年来，镧系元素掺杂的上转换发光纳米材料(upconversion nanophosphors， UCNPs)常被用于生物医药领域。在980nm激光的照射下，UCNPs能发射出可见光或近红外的 窄谱荧光。这些可见光或近红外光具有独一无二的光学特性，比如无背景光，抗淬灭效应 好，穿透深度深等。比起含Cd 2+的量子点，上转换材料的毒性要小很多。光动力治疗的光敏剂 通常能被可见光或500_700nm的光激发。当UCNPs和光动力治疗的光敏剂相结合，通过荧光 共振能量转移(FRET)效应，光敏剂能够吸收UCNPs通过转换特性激发出的近红外光。
【发明内容】
[0005] 鉴于现有技术上的缺陷，本发明要解决的技术问题是通过光控产生的R0S刺激如 何协助抗肿瘤化疗药物发挥药效和降低药物副作用。
[0006] 本发明公开了一种R0S响应的纳米药物递送系统，包括UCNPs、与UCNPs连接的羧基 化的聚乙二醇(PEG)、光敏剂、R0S响应的缩硫酮linker(TL)，以及与缩硫酮linker连接的抗 肿瘤化疗药物;光敏剂含有羧基且其激发光谱和UCNPs的发射光谱重合。
[0007] 进一步地，光敏剂和UCNPs的之间的距离能够进行FRET效应。
[0008] 进一步地，缩硫酮linker的结构式是：
[0010]其中，缩硫酮linker通过其羧基与抗肿瘤化疗药物连接。缩硫酮linker是R0S敏感 的，可被R0S切断，从而释放出抗肿瘤化疗药物。
[0011] 进一步地，UCNPs是NaYF4纳米颗粒掺杂Yb3+作为敏感剂，Er3+/Tm 3+作为激活剂，呈 现出上转换特性，980nm激光可激发出645-675nm的窄光谱。
[0012] 进一步地，光敏剂包括二氢卟吩e6(Ce6)和脱镁叶绿酸-A(Pheophorbide A，PheA) 中的一种或者两种，其对应的结构式是：
[0014]其中，左边是二氢卟吩e6,右边是脱镁叶绿酸-A。
[0015]进一步地，抗肿瘤化疗药物包括喜树碱(CPT)、阿霉素(D0X)、伊立替康、紫杉醇中 的一种或者多种。这些抗肿瘤化疗药物可以和羧基反应。
[0016] 进一步地，上述R0S响应的纳米药物递送系统的水合粒径为70_80nm。
[0017] 在一个较佳实施例中，抗肿瘤化疗药物是CPT，光敏剂是Ce6; CPT和Ce6在R0S响应 的纳米药物递送系统中的负载量为4.85% (w/w)和5% (w/w)。
[0018] 本发明还公开了上述R0S响应的纳米药物递送系统的制备方法，包括以下步骤：
[0019] 步骤一、UCNPs的合成；
[0020] 步骤二、缩硫酮linker的合成:无水的3-疏基丙酸和无水的丙酮在干燥的HC1气体 饱和的情况下室温反应2 - 6 h，反应产物结晶过滤，洗涤，真空冷冻干燥得产物缩硫酮 linker；
[0021 ] 步骤三、缩硫酮linker与抗肿瘤化疗药物连接:缩硫酮linker在无水的二甲基甲 酰胺（DMF)中，在先加入三乙胺、2，4,6_三氯苯甲酰氯、二甲氨基吡啶的情况下，搅拌5-20min;将抗肿瘤化疗药物加入，室温搅拌反应20-30h，粗产物过硅胶柱得连接有缩硫酮 linker的抗肿瘤化疗药物纯品；
[0022] 步骤四、装配完整的R0S响应的纳米药物递送系统:连接有缩硫酮linker的抗肿瘤 化疗药物和甲氧基-聚乙二醇-羧基(mPEG-COOH)以摩尔比为2:5~6的比例加入含UCNPs的 有机溶剂中，UCNPs质量为mPEG-COOH的2.5 % -3.3 %，超声，加入摩尔质量为mPEG-COOH的 5%-15%的光敏剂超声，室温搅拌l-3h后高速离心洗涤，收集固体物质后重悬，得到R0S响 应的纳米药物递送系统。
[0023]进一步地，步骤四中的有机溶剂是可同时溶解抗肿瘤化疗药物，mPEG-COOH和光敏 剂的有机溶剂，比如二甲基甲酰胺。
[0024] 进一步地，步骤一具体为:CF3⑶ONa和Ln(CF3COO) 3以摩尔比2:1在油胺中反应，搅 拌加热到110-120°C去除水分和氧气，通氮气搅拌0.5-2h，期间一直为通氮气状态，当反应 液转为透明，升温至320-330Γ搅拌反应l_2h，反应结束，以环氧己烷和氯仿洗去多余油胺， 真空干燥，得到UCNPs ;其中，Ln (CF3C00) 3 中的Ln是78mo 1 % Y+20mo 1 % Yb+1 · 6mo 1 %Er+ 0.4mol%Tm；
[0025] 优选地，步骤一中三种反应物具体的量为4mmol CF3C00Na和2mmolLn(CF3⑶0)3加 入20mL油胺中反应。
[0026] 优选地，步骤一中升温至320°C，且该升温过程中，每分钟升高10°C。
[0027] 优选地，步骤一中反应结束后，需要当温度降到室温之后，再以环氧己烷和氯仿洗 去多余油胺。
[0028] 优选地，步骤三中加入三乙胺的摩尔量为TL的三倍，加入2，4，6_三氯苯甲酰氯的 摩尔质量与TL的摩尔质量相同，加入二甲氨基吡啶(DMAP)的摩尔质量是TL的1/5。
[0029]优选地，步骤四重悬固体物质的溶剂可为水、磷酸缓冲盐溶液(PBS)或4-羟乙基哌 嗪乙磺酸(HEPES)缓冲溶液。
[0030] 本发明还公开了 R0S响应的纳米药物递送系统作为制备抗肿瘤药物制剂的应用。
[0031] 进一步地，980nm激光激发UCNPs发射出645-675nm光谱，通过FRET效应，部分645-675nm光被光敏剂二氢卟吩e6或脱镁叶绿酸-A吸收，光敏剂发射出的荧光或UCNPs发射出的 荧光，用于体内外荧光成像;光敏剂释放出R0S，用于肿瘤的光动力治疗;R0S切割缩硫酮 linker释放抗肿瘤化疗药物，用于肿瘤化疗。
[0032]基本原理:将连接R0S敏感的缩硫酮化疗药、光敏剂都负载在上转换材料UCNPs上， 在980nm激光的照射下，通过UCNPs的上转换效应，发射出500-700nm的光，而光敏剂吸收这 些光可释放出R0S，R0S可用于光动力治疗；同时R0S可切割R0S敏感化学键，释放药物进行化 疗；同时上转换效应发射的荧光或光敏剂发射出的光可进行荧光成像。一个纳米体系可做 到光动力治疗、化疗与荧光成像相结合。
[0033] 其有益效果：
[0034] (1)光敏剂的激发光谱和UCNPs的发射光谱重合，当激光激发UCNPs发光时，UCNPs 的发射光谱可以使得光敏剂发光和释放出R0S。此外，肿瘤细胞往往R0S较多，R0S可以切割 缩硫酮linker释放抗肿瘤化疗药物。因此，使用R0S响应的纳米药物递送系统可以在时间和 空间上对药物释放进行控制。
[0035] (2)此纳米递送系统是980nm激光激发的上转换发光，用于成像具有无背景光，抗 淬灭效应好，穿透深度深的特点。
[0036] (3)光控释放R0S和R0S敏感的化学键的切割释放抗肿瘤化疗药物，使得利用R0S响 应的纳米药物递送系统可进行光动力治疗和化疗联合治疗，一次将肿瘤根除。
[0037] (4)除上述治疗外，UCNPs发射的荧光或光敏剂发射出的光可进行荧光成像，因而 可进行治疗成像一体化。
[0038] (5)此纳米制剂的生物相容性好。
[0039] (6)此纳米制剂粒径均匀，稳定性好。
[0040] UCNPs表面修饰有含R0S敏感linker的化疗药，光敏剂和羧基化的PEG。以980nm激 光照射，UCNPs发射出645-675nm荧光。而光敏剂能吸收645-675nm光产生R0S，R0S不仅能用 于光动力治疗，也能切断R0S敏感的硫醇linker，释放化疗药物，同时此纳米颗粒可用于焚 光成像。此纳米颗粒可以通过光动力治疗和化疗联合治疗根除肿瘤。此纳米颗粒为诊疗一 体化的纳米颗粒提供了一种新的选择。
【附图说明】
[0041]图1是本发明一个【具体实施方式】的R0S响应的纳米药物递送系统结构示意图。
[0042]图2是本发明一个【具体实施方式】的R0S响应的纳米药物递送系统用于光动力治疗 和化疗联合治疗的机理图。
[0043] 图3是本发明具体实施例一的TL-CPT的合成路线图。
[0044] 图4是本发明一个【具体实施方式】的纳米颗粒及表面相关配体的傅立叶红外光谱 图。
[0045] 图5是本发明一个【具体实施方式】的R0S响应的纳米药物递送系统在980nm激光照射 下，通过上转换方式发射的荧光光谱图。
[0046] 图6是本发明一个【具体实施方式】的R0S响应的纳米药物递送系统在510nm激光激发 的发射光谱图。
[0047] 图7是测试缩硫酮linker的R0S敏感性的1H NMR图。
[0048]图8是本发明【具体实施方式】一的R0S响应的纳米药物递送系统用于光动力和化疗 对肺癌细胞NCI-H460的联合治疗的柱状图。
[0049] 图9是本发明【具体实施方式】一的R0S响应的纳米药物递送系统以光敏剂Ce6的荧光 为信号对原位肺癌进行示踪定位的荧光显示图。
【具体实施方式】
[0050] 下面结合附图和具体的实施例，并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，这些 实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制发明的范围。下述实施例中所使用 的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说 明，均可从商业途径得到。
[0051 ] 如图1所示的R0S响应的纳米药物递送系统以UCNPs为内核，其表面包覆PEG、Ce6、 缩硫酮linker连接的喜树碱，表面残留部分油胺，其具体制备方法见实施例一。
[0052] 如图2所示，R0S响应的纳米药物递送系统在980nm激光照射下，UCNPs通过上转换 效应发光，Ce6吸收这些光后释放出R0S，一方面R0S可用于光动力治疗，另一方面R0S可切割 缩硫酮linker释放出结合在缩硫酮linker上的抗肿瘤化疗药物，比如喜树碱，进行化疗。 [0053] 实施例一
[0054] 1.上转换材料UCNPs合成步骤如下：
[0055] 4mmo 1 CF3C00Na 和 2mmo 1 (总量）Ln (CF3C00) 3 (Ln: 78mo 1 % Y+20mo 1 % Yb+1 · 6mo 1 % Er+0.4mol %Tm)加入lOOmL三颈瓶中，加入20mL油胺。搅拌加热至ljl20°C去除水分和氧气，通 氮气搅拌lh。期间一直为通氮气状态，当反应液转为