麻疹-疟疾联合疫苗的制作方法
【专利说明】
[00011 本申请是中国专利申请CN201080024777.1的分案申请，原申请是国际申请号PCT/ IN2010/000287于2011年12月5日进入中国国家阶段的申请。
技术领域
[0002] 本发明涉及含有不同的减毒重组麻疹-疟疾载体的麻疹-疟疾联合疫苗，所述载体 包含编码几种恶性疱原虫(Plasmodium falciparum)抗原的异源核酸。优选地，其涉及包含 核酸的病毒载体，所述核酸编码恶性疱原虫的环子孢子(circumsporozoite，CS)蛋白、恶性 疱原虫的裂殖子表面蛋白l(merozoite surface protein 1，MSP-1)及其糖基化和分泌形 式的衍生物（P-42; p-83-30-38)和锚定或分泌形式的恶性疟原虫的顶膜抗原1 (apical membrane antigen 1，AMA1)。所述病毒载体源自减毒麻疹病毒，其基于用作疫苗并且有效 地递送目的基因还有效地结合并感染相关免疫细胞的毒株。在一个优选的实施方案中，CS、 MSP1和AMA1蛋白从病毒中产生，从而使它们在哺乳动物(优选人）中引发强免疫应答;所述 蛋白的表达因为人密码子优化而升高。另外，本发明涉及所述重组疫苗在疟疾的预防性治 疗中的用途。
【背景技术】
[0003] 麻疹病毒
[0004] 本发明涉及含有重组减毒麻疹病毒(表达恶性疟原虫(Pf)的抗原）的疫苗及其用 于制备重组的麻疹-疟疾疫苗的用途，所疫苗赋予针对麻疹和疟疾抗原两者的免疫力。 [0005] 麻疼病毒(MV)是单分子负链RNA病毒目（Mononegavirales)的成员，即具有非区段 负链RNA基因组的病毒。MV的非区段基因组具有反信使极性(antimessage polarity);因 此，所述基因组RNA不在体内或体外翻译。另外，只有在当其以核糖核蛋白 (ribonucleoprotein，RNP)复合物(见下文）的形式非常特异地与三种病毒蛋白相结合时才 有生物学活性。非区段(_)链RNA病毒的转录和复制及其病毒颗粒的组装已被详细地综述 (1)。麻疹病毒的转录和复制不涉及所感染细胞的核，而是发生在所感染细胞的胞质中。麻 疹病毒基因组包含编码来自六个基因（命名为1?1、？、!1和1^的六个主要结构蛋白以及来 自P基因的另外两个非结构蛋白C和V(涉及对抗基本免疫应答和转录/复制的调节)的基因。 基因顺序是314(包括C和V)、M、F、H和L5'。此外，从末端区转大约50个核苷酸的短前导 RNA。所述基因分别编码病毒的核壳体(ribonucleocapsid，RNP)蛋白，即核蛋白（N)、磷蛋白 (P)和大聚合酶/复制酶蛋白（L)，它们非常紧密地与基因组RNA结合，形成RNP。编码病毒衣 壳蛋白的其他基因包括血凝素(H)、融合蛋白（F)和基质蛋白（MhMV基因的转录遵循递减的 梯度：当聚合酶在基因组模板上操作时，与从下游基因相比其从上游基因合成更多的RNA。 在该不连续的转录模式下，mRNA被加帽和聚腺苷化。相反，在复制模式中，L蛋白产生全长的 反基因组和基因组RNA，其立即被N、P和L蛋白覆盖以形成感染性子代RNP。
[0006] 麻疼病毒已于1954年分离:Enders和Peebles用David Edmoston(感染麻疼的儿 童）的血接种原代人肾细胞，且所得的MV Edmoston毒株(2)随后适于在多种细胞系中生长。 对鸡胚、鸡胚成纤维细胞(chick embryo fibroblast，CEF)和/或犬肾细胞和人二倍体细胞 的适应产生了减毒的Edmonston A和B(3)、Zagreb(EZ)和AIK-C种。1963年，Edmonston B被 批准为第一个MV疫苗。Edmonston A和B在CEF中进一步传代产生了更为减毒的Schwarz和 Moraten病毒(3)，最近证明它们的序列相同（4,5)。因为Edmonston B疫苗是反应原性的，其 于1975年被放弃，并被Schwarz/Moraten疫苗所替代。也使用几种其他疫苗毒株：日本的 AIK-C、Schwarz F88、CAM70、TD97，俄罗斯的Leningrad-16,还有Edmonston Zagreb<XAM70 和TD97中国毒株并不是来自Edmonston。Schwarz/Moraten和AIK-C疫苗是在CEF中生产的。 Zagreb疫苗是在人二倍体细胞(WI-38)中生产的。如今，通常使用Schwarz/Moraten、AIK_C 和EZ疫苗(6)，但原则上说，这些减毒疫苗毒株的任何一种都是同一种被证明安全并且诱导 长期的免疫应答的独特MV血清型，它们可用于本发明的目的。
[0007] 单次或两次低剂量注射之后，MV疫苗诱导终生免疫力。针对麻疹的保护通过抗体 以及⑶4和⑶8T细胞介导。已证明接种后MV特异性抗体和⑶8细胞维持长达25年(7)。
[0008] 在大多数国家，MV疫苗易于大规模生产，并可低成本地分发。因为MV基因组的减毒 来自多种突变的优势组合，所以该疫苗非常稳定并且从未观察到致病性的恢复(6)。
[0009] 对于安全性，MV仅在细胞质中复制，排除了整合进入宿主DNA的可能性。这些特性 使得活减毒MV疫苗成为用作多价接种载体的有吸引力候选。这样的疫苗可被证明针对其他 病原物质与针对载体病毒本身一样有效引发长期免疫保护。
[0010] Martin Billeter及同事克隆了对应于Edmonston MV的反基因组的cDNA，并建立 了独创和高效的反向遗传学方法来拯救所述病毒（8)，如国际专利申请W0 97/06270中所 述。从稳定转染并表达MV的N和P蛋白以及噬菌体T7RNA聚合酶的辅助细胞系293-3-46中回 收重组麻疹病毒。为了拯救任何变体或重组MV，随后用编码L蛋白的表达质粒瞬时转染辅助 细胞系，且最重要的是与任何反基因组质粒一起转染，该反基因组质粒被适合地构建以获 得适于产生子代MV的任何突变的或重组的反基因组RNA。所述瞬时转染的步骤首先引起转 录，优选通过所具有的T7RNA聚合酶引起。所产生的反基因组RNA立即（在新生状态中）被病 毒N、P和L蛋白覆盖，以获得反基因组RNP，从中生产基因组RNP。随后，基因组RNP由所附的L 所转录，产生全部病毒mRNA及其相应的蛋白质。最后，通过复制扩增基因组和反基因组RNP。 [0011]在对本方法稍加变化的方法中，不使用稳定转染的293-3-46辅助细胞，而是瞬时 转染市售的293T细胞，同时使用原专利说明中详述的全部5种质粒，它们编码N、P和T7聚合 酶（以前用于产生辅助细胞系），以及编码L的质粒和反基因组质粒。注意在"完全瞬时转染" 方法中，还可以使用变体表达质粒并且为避免共同使用T7RNA聚合酶，而是使用已具有的 RNA聚合酶II来表达L蛋白和反基因组(9)。
[0012] 为拯救单个的重组MV，所使用的反基因组质粒包含编码麻疹病毒全长反基因组 ( + )RNA的cDNA，结合编码异源目的抗原的核酸序列(异源核苷酸序列），以MV-特异性转录起 始和终止序列为侧翼，从而形成额外的转录单位(ATU)。该MV Edmonston毒株载体已由最初 的MV拯救发明者开发用于外源基因的表达（10)，并已证明其大的插入容量（多达5kb)和表 达转基因（例如乙型肝炎病毒表面抗原、猿或人免疫缺陷病毒(SIV或HIV)、腮腺炎病毒和人 IL-12)的高稳定性（11 ;12)。特别地，早期就已产生单独或联合表达乙型肝炎病毒表面和核 心抗原的重组麻疹病毒，并被证明在遗传修饰的小鼠中诱导体液免疫应答。
[0013] 通过对麻疹病毒的特性的发现，尤其是其在体内引发高滴度的中和抗体的能力和 其作为长期细胞免疫应答的强诱导剂的特性，本发明人提出它可能是生产表达来自恶性疟 原虫抗原的重组病毒以诱导针对所述疟原虫的中和抗体的良好候选物，其优选可适合在动 物中并且更优选在人中实现至少一定程度的保护。
[0014] 特别地，本发明已经选择MV毒株并且尤其是所疫苗毒株在已暴露的婴儿群体（因 为他们没有MV免疫性）中作为诱导针对麻疹和恶性疟原虫(其组分表达在设计的重组MV中） 的免疫力候选载体。
[0015] 然而成人人群甚至已被MV免疫的个体也可从MV重组免疫中获益，因为再施用本发 明的重组形式MV病毒引起抗-MV抗体的加强（13)。
[0016] 本发明尤其涉及具有来自恶性疟原虫之异源基因的重组麻疹病毒的制备。
[0017] 本发明的重组麻疹病毒的有利免疫特性可在动物模型中显示，所述动物模型选自 对麻疹病毒易感的动物，并且在其中测定针对异源抗原和/或针对麻疹病毒的体液和/或细 胞免疫应答。在适合用作表征免疫应答的模型的那些动物中，技术人员尤其可使用表达 ⑶46(MV的一种特异性受体)的转基因小鼠。可随后在猴中测试最有希望的重组体。
[0018] 重组麻疹病毒的核苷酸序列必须包含总数为6的倍数的核苷酸。遵从这一"六规则 (rule of six)"是必要要求，不仅适用于MV，也适用于属于副粘病毒亚科的所有病毒。显 然，N蛋白分子(每个接触六个核苷酸）必须从5'至3'末端精确地覆盖基因组的和反基因组 RNA，。
[0019] 值得注意的是，ATU可在反基因组cDNA的不同位置。因此，利用上述MV mRNA的天然 表达梯度，插入的ATU的表达水平可被改变为适合的水平。ATU优选的位置为L-基因的上游、 Μ基因的上游和N基因的上游，它们分别导致异源蛋白的低、中和强表达。
[0020] 疟原虫
[0021 ]疟疾目前是世界上最普遍的感染性疾病之一，尤其是在热带和亚热带地区。在世 界范围内，疟疾感染每年导致数亿个体的严重疾病，杀死1至3百万人，主要是发展中国家和 新兴国家的婴儿。疟疾的广泛发生和升高的发生率的原因是广泛禁用DDT和耐药寄生虫以 及耐杀虫剂寄生虫载体数目的增加。其他因素包括环境和气候改变、社会动乱和增加的人 口流动性。
[0022] 疟疾由蚊子传播的血液原生动物寄生虫引起，该寄生虫属于顶复合器门 (Apicomplexa)疱原虫属（Plasmodium)。疱原虫属中的四个种感染人：三日疱原虫 (卩.11^131436)引起三日症(]\^131^3 91^1^3113);间日症原虫（？.￥；^3叉）和卵形症原虫 (P.ovale)，二者都引起间日症(Malaria tertiana);和恶性症原虫(P.falciparum)，其为 热带疱(Malaria tropica)的病原体并且是几乎全部致命感染的原因。很多其他种在动物 中引起疾病，例如小鼠中的约氏疟原虫(P.yoelii)和伯氏疟原虫(P.berghei)。
[0023] 疟原虫具有由几阶段组成的生活周期。每个阶段能诱导针对相应发生阶段特异性 抗原的特异性免疫应答。疱原虫通过几种雌性疱蚊(Anopheles mosquitoe)传播至人。感染 的蚊子将"子孢子(sporozoite)"形式的疟原虫注入哺乳动物血流。侵入肝细胞之前子孢子 在循环中存留几分钟。在这个阶段，寄生虫位于细胞外环境中并且暴露于抗体的攻击，该攻 击主要针对子孢子表面的主要组分"环子孢子"（CS)蛋白。一旦进入肝中，寄生虫复制并发 育成所谓的"裂殖体(schizont)"。这些裂殖体的存在比率为每个感染细胞多至20,000。在 寄生虫的该细胞内阶段，宿主免疫应答中主要起作用的是T-淋巴细胞，尤其是CD8+T-淋巴 细胞。在约一周的肝感染后，数千个所谓"裂殖子"被释放进入血流。顶膜抗原1(AMA1)和裂 殖子表面蛋白1 (MSP1)都存在于感染的肝细胞产生的裂殖子上:它们是负责侵入红细胞的 无性血液阶段裂殖体的基本组分。一旦进入红细胞，它们成为抗体介导的免疫应答和T-细 胞分泌的细胞因子的靶标。侵入红细胞后，裂殖体进行几个阶段的复制，产生所谓的"营养 体"和裂殖体与裂殖子，它们可感染新的红细胞。有限量的营养体可演变成为构成寄生虫有 性阶段的"配子体"。当易感的蚊子消化红细胞时，配子体从红细胞中释放，产生几个雄性配 子体和一个雌性配子体。这些配子受精导致合子形成并随后转化成为动合子，之后成为卵 囊，并最终成为唾液腺子孢子。针对配子体阶段的特异性表面抗原的靶向抗体可在蚊子的 中肠 (mid gut)中阻断该周期。这样的抗体不会保护哺乳动物宿主，但会通过降低感染的蚊 子及其寄生虫负荷的数目来降低疟疾的传播。
[0024] MSP-1以190-200kDa (d-190)前体合成，其在裂殖过程中被蛋白水解加工成为83、 30、38和42kDa(d-42)的片段（14)。在侵入红细胞时，42kDa被进一步地切割产生从复合物剩 余部分脱落的33kDa片段和含有两个表皮生长因子(EGF)样结构域的19kDa片段，其在侵入 过程中与裂殖子膜保持连接。该继发切割是成功侵入红细胞的先决条件(15)。
[0025] MSP-1基本上是双态蛋白，在以KI和MAD20原型为特征的双态等位基因中表现出高 保守性。
[0026] AMA-1(16)是结构上保守的I型膜内在蛋白质，在恶性疟原虫中其包含622aa(Pf/ AMA-1)，组成为胞质区（50aa)、跨膜区和胞外结构域，其折叠为N-末端前序列（pro-sequence)和三个结构域(01、011、0111)。所述蛋白的表达在裂殖后期最多：蛋白水解加工 AMA-1的前体(83kDa)以切去前序列，将所述蛋白转化成为66kDa的形式，这允许裂殖子的重 新定位。抗体主要识别DI和DII，并且似乎与几个等位基因变体有同样好的反应性。对Dili 应答的抗体一般较低，在成人中水平增加(17，18)。
[0027] PfAMA-Ι含有64个多态性位置(所述前序列中9个，胞外结构域中52个，胞质区3 个），其中多数是双态的，它们是宿主免疫应答的重要表位。为开发基于PfAMA-Ι的疫苗，覆 盖多态性应是重要的：多样性覆盖(Diversity Covering) (DiCol、2和3)PfAMA-l是人工序 列，它以可能的最大程度代表PfAMAl胞外结构域的天然多态性。已证明它们诱导针对多种 携带不同PfAMAl等位基因的寄生虫有功能的免疫应答。该方式可提供这样的手段，通过它 可产生靶向PfAMAl的疫苗，从而可诱导针对大范围的天然PfAMAl等位基因的强且具有功能 性的保护（19)。
[0028] CS蛋白（CSP)具有约420个aa和58kDa的分子量。它是子孢子的主要表面蛋白：对于 从卵囊成熟为子孢子和侵入肝细胞（由带正电荷的氨基酸的保守基序介导)来说，其功能是 必不可少的。CSP的组成为5'和3'末端的两个非重复区和由多个重复的4残基长的基序组成 的可变物种特异性中央区，其是CSP中的主要表位。因为CSP至少在裂殖前3天还可以检测 到，所以无论是抗体介导的针对细胞外子孢子的免疫应答还是细胞介导的针对裂殖体的免 疫应答，它都被认为是吸引人的疫苗靶点(20)。
[0029] 目前，开发疟疾疫苗的途径可根据上文所述的寄生虫可存在的不同阶段来分类。
[0030] 疫苗可以分为三种可能类型：i)红细胞前疫苗，其针对子孢子和/或裂殖体感染的 细胞。这些类型疫苗主要基于CS，并应当理想地赋予由体液和细胞免疫应答介导的无虫免 疫，阻止疟疾感染;ii)无性血液期疫苗，其针对裂殖子感染的细胞:MSP1和AMA1是主要的疟 疾疫苗候选物，设计用于将临床严重程度最小化。这些疫苗应降低发病率和死亡率，并旨在 阻止寄生虫进入红细胞和/或在其中发育；iii)传播阻断疫苗，其设计用于阻止寄生虫在蚊 子宿主中的生长。这类疫苗应当有利于降低大量人群的疟疾感染率。除了这些疫苗，正在研 究所谓的多组分和/或多阶段疫苗以来寻求开发靶向寄生虫生命周期的多个阶段的疟疾疫 苗的可行性。
[0031]目前的全球疟疾疫苗形势看起来很有希望，有47个新的疫苗候选物，31个在临床 前开发，在临床试验中缩小至16个。这些中的一个，GSK Biologicals和PATH-MVI开发的 RTS，S疫苗应当在2008年进入最终的III期临床试验(21)。其他令人感兴趣的疫苗候选物是 基于使用活重组病毒作为载体，例如国际专利申请US2006127413中描述的Modified Vaccinia Ankara(MVA)、痘病毒（US6214353、AU7060294、AU1668197、W09428930和 US5756101)、腺病毒（US2007071726、US2005265974、US2007088156 和 CA2507915)、冷适应减 毒流感病毒或基于酵母（例如毕赤酵母(Pichia pastoris)和酵母属（Saccharomyces spp ·))或基于细菌（例如沙门氏菌属（Salmonella spp ·) (US5112749)和大肠埃希氏菌 (Escherichia coli)(EB0 191748))表达系统的疫苗(22)。
[0032]尽管针对疟疾的疫苗开发在30多年前就已开始，但是当前还没有上市的针对疟疾 的疫苗。很多因素使得疟疾疫苗的开发困难并具有挑战。首先，该寄生虫的大小和遗传复杂 性意味着每次感染向人免疫系统呈现数千种抗原。理解其中哪些可成为疫苗开发的有用靶 标是复杂的，到现在为止，已经鉴定出了至少40个不同的有希望的抗原。第二，该寄生虫经 过几个生命阶段的改变，甚至在人宿主中也是如此，在生命周期的每个阶段，其向免疫系统