增强的疟疾msp-1亚单位疫苗的制作方法

专利名称：增强的疟疾msp-1亚单位疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及重组亚单位蛋白，其已经被设计用作疫苗来针对疟疾进行保护。具体地，所述重组亚单位蛋白源自恶性痕原虫(Plasmodium falciparum)的裂殖子表面蛋白I (Merozoite Surface Protein 1,“MSP_1”)的C-端区域,且被进一步修饰以增强免疫原性潜力。MSP-IC-端区域的核心是pl9。pl9核心区域含有表位，所述表位是寄生生物生长抑制抗体的靶标；但是，P19核心区域自身具有较差的免疫原性。已经证实，在pl9核心区域之前紧邻处的MSP-I的p33区域含有T细胞表位。已经假定，这些T细胞表位可以增强针对P19核心区域的抗体应答。这些潜在T细胞表位在重组蛋白的背景下能够引起增强的且稳定的免疫应答的功能性和实用性尚未完全证实。在目前的应用中，通过选择性地添加源自MSP-I的p33区域的片段，增强了 pl9核心区域的免疫原性潜力。将这些选定的片段连接至P19核心区域，以生产具有增强的免疫原性潜力的新颖蛋白。这些新颖的蛋白在自然界中没有发现。在细胞生产系统中生产具有增强的免疫原性潜力的重组亚单位蛋白，并且在纯化以后，将其配制为疫苗，以生成适当的免疫应答。经证实，与生成不稳定的或减少的寄生生物生长抑制抗体的其它MSP-IC-端亚单位相比，所述增强的重组亚单位蛋白会诱导强寄生生物生长抑制抗体。所述增强的亚单位蛋白具有用作人用疫苗来保护免于疟疾的潜力。
背景技术：
据估计，疟疾的每年发病率是约2. 5亿病例，每年导致大于100万人死亡(WH0，2008)。大多数病例发生在非洲，尽管该威胁扩大至世界上的许多其它热带和亚热带区域。全世界有大约30亿人处于感染风险中。为此，非常需要控制该疾病的传播，因为蚊子载体和疟原虫属寄生生物已经形成对以前的控制措施的抗性。在过去的10至15年中，主要焦点已经放在针对寄生生物的不同发育阶段的疟疾疫苗的开发上。尽管已经有大量工作来建立重组亚单位疟疾疫苗的技术，并且几种候选亚单位已经进入临床试验，然而尚未完全实现基于重组亚单位蛋白技术的有效疟疾疫苗。一种靶向疟疾的环子孢子阶段的候选疫苗仍然在临床试验中进行评价，尽管关于它进一步成为被许可疫苗的潜力存在不同意见。迄今为止，在临床试验中的靶向于寄生生物的裂殖子阶段的疫苗候选物已经失败。因此，尚不存在被许可的可用于疟疾的疫苗。存在许多疟疾寄生生物物种，每个物种具有确定的宿主范围。存在多个感染人类的物种。恶性疟原虫是在人类中造成疾病的主要物种。除非另外指出，术语“寄生生物”在本文中是指疟原虫属物种。疟疾寄生生物的生命周期是复杂的。所述寄生生物在它的生命周期的许多阶段发生众多发育的和形态的变化。当被感染的蚊子给它的宿主接种子孢子时，该周期开始。所述子孢子快速地渗入肝细胞中，它们然后在这里发育成肝裂殖体。在成熟后，裂殖子被释放进血流中。所述裂殖子接着侵入红细胞中，并在红细胞中无性地繁殖，直到受感染的细胞破裂，导致释放出额外的裂殖子，随后所述额外的裂殖子侵入额外的红细胞中。裂殖子的繁殖和红细胞的裂解与疟疾的临床症状有关。有些裂殖子继续发育成雄性和雌性配子母细胞，他们然后被以受感染个体为食的蚊子摄入。一旦进入蚊子中，雄性配子对雌性配子的受精会导致进一步发育成所述寄生生物的子孢子阶段。因而，所述周期再次开始。所述生命周期被分成3个阶段前红细胞阶段、无性红细胞阶段和有性阶段。关于疫苗开发，所述3个阶段经常被称作子孢子或肝阶段(前红细胞阶段)、血液阶段(无性红细胞阶段)和传播阻断(有性阶段)。过去十年的工作已经证实，尽管这样的疫苗存在开发疟疾疫苗的潜 力，但疫苗的开发是一项艰难的任务。在鉴别和开发作为疟疾疫苗候选物的蛋白中，已经取得了进展。选择用于疟疾疫苗中的蛋白的主要方法是，筛选对人免疫血清具有反应性的那些蛋白。以此方式，已经将在每个生命周期阶段中的许多蛋白鉴别为疫苗候选物。可作为疫苗候选物的蛋白中，大多数是在寄生生物的表面上表达的蛋白。因为较难培养寄生生物来作为抗原的来源，疟疾疫苗的开发必须依赖于替代方法，诸如重组DNA。该技术已经成功地用于确定重要的肽序列、表达亚单位抗原和开发基于DNA的疫苗。尽管靶向所述寄生生物的每个发育阶段的疟疾疫苗的开发工作正在进行中，靶向血液阶段的疫苗可能具有最大影响，因为这是导致疾病表现的阶段(Good等人，1998)。在已经鉴别出的许多血液阶段的抗原中，主要的裂殖子表面蛋白l(Merozoite SurfaceProtein, MSP-1)是已经被充分研究的一种。天然的MSP-I蛋白具有大约195kD的分子量。它是一种主要出现在裂殖子表面上的膜锚定分子。它被加工成4个主要片段,根据它们的相对分子量,将它们称作p83、p28、p38和p42(Hall等人，1984，Lyon等人，1986和Holder等人，1987)。所有片段的功能是未知的。已经确定，C-端p42片段(它锚定在裂殖子表面上)被进一步加工成叫做p33和pl9的2个片段,并且该加工是红细胞侵入的必要条件(Blackman等人，1990,1991及Blackman和Holder，1992)。FUP菌株的MSP_lp42的氨基酸序列显示在图I中。许多发现都支持MSP-I作为重要的疟疾疫苗候选物。已经证实，当用源自培养的寄生生物的MSP-I进行免疫时，可以保护猴免受恶性疟原虫攻击(Hall等人1984，Siddiqui等人1987，和Etlinger等人1991)。另外，在攻击研究中也已经证实，代表MSP-I的不同部分的重组肽或合成肽会引起不同水平的保护(Hall等人，1984, Cheung等人，1986,Patarroyo 等人，1987, Herrera 等人，1990, Kumar 等人，1995,和 Chang 等人，1996, Kumar 等人，2000, Stowers等人,2001, Darko等人,2005)。另外,从生活在病区的人中收集的血清的分析结果已经证实，针对MSP-IC-端区域的IgG抗体的生成与对抗疟原虫疟疾的临床免疫的形成有关(Riley 等人，1992，Shai 等人，1995，Al-Yaman 等人，1996，和 Shi 等人，1996)。最后，已经证实，针对MSP-I的单克隆抗体能够在体外防止寄生生物侵入红细胞中(Pirson和 Perkins, 1985 和 Blackman 等人，1990)。已经将MSP-IC-端p42片段和它的pl9加工片段鉴别为源自MSP-I蛋白的主要亚单位疫苗候选物。P19核心区域的序列(在图I中显示为粗斜体)在不同的恶性疟原虫菌株中是高度保守的。图2提供了来自3个恶性疟原虫菌株FUP、3D7和FVO的MSP-lp42蛋白的氨基酸序列的比对。P33区域在FUP和3D7菌株之间是保守的，但是，FVO菌株的p33稍微不同于其它2个恶性疟原虫菌株。pl9核心区域在3个菌株之间是高度保守的，且也含有6个二硫键，所述二硫键导致高度折叠的结构，所述结构表现为2个表皮生长因子样结构域(Blackman等人,1991)。已经证实,针对pl9核心区域的多克隆和单克隆抗体会在体外抑制寄生生物发育(Blackman 等人，1990, Chang 等人，1992, Chappel 和 Holder, 1993)。开发基于MSP-I的p42或pl9片段的重组亚单位疫苗的工作中，已经利用了几种不同的异源蛋白表达系统。在下面总结了这些亚单位在大肠杆菌、酵母和杆状病毒载体系统中的表达。在大肠杆菌中表达抗原的早期工作，在免疫接种以后仅诱导了低水平的可与天然蛋白反应的抗体(Holder等人，1988, Burghaus等人，1996)。因此,大多数工作目前聚焦于具有引导MSP-I亚单位的天然样折叠的能力的表达系统上，以尝试生产更多的具有更大的诱导相关免疫应答潜力的相关产物。 尽管能够表达更多的具有更大抗原潜力的天然样MSP-IC-端重组亚单位蛋白，迄今为止的所有工作却导致了不稳定的和/或不相关的抗体应答。例如，Kumar等人(1995)能够证实，当用在酵母中表达的pl9亚单位进行免疫时,会在夜猴(Aotus Monkey)中产生保护作用；但是，没有在免疫的所有猴中实现保护，这证实了使用P19亚单位的免疫应答的不稳定性。此外，来自受保护的猴的血清不能在体外抑制寄生生物生长，这表明，免疫应答的质量(抗体特异性)不如预期。在另一组实例中，Chang等人(Infect. Immun. (1996)64 253-261和美国专利6，855，316)能够证实使用在杆状病毒系统中生产的p42产物对夜猴的保护作用；但是，所述保护是不稳定的，因为并非所有动物都受到保护。这违背来自受保护的猴的血清能够在体外抑制寄生生物生长的事实。在另一个实例中，Darko等人(2005)评价了杆状病毒表达的P42产物在攻击夜猴模型中的效力。尽管有相对高水平的抗体应答，但该杆状病毒表达的P42产物对于攻击提供了非常少的保护作用。最后，由于免疫应答水平较低而且不稳定，现在已经放弃了在大肠杆菌中生产并用于II期临床试验的P42产物(Ogutu等人，2009)。从这些实例显而易见，尚未实现从作为有效的疫苗候选物的MSP-IC-端区域生产重组亚单位蛋白的解决方案。如以前所述，MSP_lp42片段由p33和pl9片段组成。锚定在裂殖子表面上的MSP-I的pl9核心区域是裂殖子在红细胞侵入过程中裂殖子的必要元件，其中在裂殖子与红细胞结合以后，所述P33片段被释放进血浆中。所述pl9片段除了在红细胞侵入中的作用以外，还是体外寄生生物生长抑制抗体的靶标。P33片段的作用不明。在p33区域内已经鉴别出许多T细胞表位(Udhayakumar等人，1995 ;Lee等人，2001 ;Malhotra等人，2008)，且有人建议p33在引起保护性免疫中起间接作用，这通过提供在pl9中缺少的T辅助表位来实现(Tian等人，1996 ;Lee等人，2001)。临床研究已经证实，MSPI-42疫苗接种会引起记忆T细胞应答，并且这些应答位于MSP1-33片段(Huaman等人，2008)。尽管如此，在重组亚单位蛋白和主动免疫的背景下，尚未证实T细胞表位的对pl9特异性地增强抗体应答的能力。为了实现重组MSP-IC-端亚单位蛋白作为可行候选疫苗的潜力，存在需要进一步研究的关键问题。第一个问题涉及到，关于引起特异性的保护性抗体应答，要鉴别出MSP-IC-端区域的有关的免疫原性片段。特异性的保护性抗体是能够在体外抑制寄生生物生长的那些抗体。第二个研究领域涉及到，鉴别出无关的免疫原性片段，所述片段产生的应答不会引起所需的适当的特异性应答。第三个研究领域涉及到，以生产具有增强的免疫原性潜力的重组亚单位蛋白产物并作为疫苗候选物的方式，评价来自MSP-IC-端区域的不连续序列的连接。MSP-IC-端亚单位蛋白被定义为这样的任意重组蛋白包括MSP_lpl9核心区域和来自MSP-lp33区域的额外序列，无论p33序列是否是连续的(像在自然界中一样)或不连续的(产生新颖的蛋白)。在开发增强的MSP-IC-端亚单位蛋白的初期工作中，基于p33区域的N-端截短制备了 3种构建体。截短点是基于p33中的假定的T细胞表位。在一种构建体中，将来自p33区域的额外表位连接至截短处。来自这3种构建体的初步数据没有证实增强序列的存在， 因为不存在寄生生物抑制抗体方面的免疫增强。这前3种构建体A、B和C的序列如图3所示。意外的是，随后在构建体C上得到的数据显示，在该构建体中的31个氨基酸的p33片段含有抑制免疫应答的序列(以寄生生物生长抑制性抗体的方式)，除了强烈的总抗体应答以外。因此，基于MSP-IC-端区域的应用而进一步开发可行的疟疾重组亚单位疫苗，需要鉴别在P33区域内的适当序列，所述序列可以与pl9核心区域相组合以产生具有增强的免疫原性的组合序列。更具体地，所述增强的免疫原性是指，诱导稳定的且特异性的抗体的能力，所述抗体能够在体外抑制寄生生物生长，并针对由疟疾造成的疾病提供保护。此外，为了完全实现增强序列的潜力，去除这样的序列也是重要的所述序列抑制具有增强性质的那些序列的免疫原性潜力。最终的目的是选择“增强性”p33序列，选择性去除“抑制性”p33序列，以及将“增强性”序列连接至P19核心区域，以产生能够在灵长类动物模型和人类中引起稳定的且增强的保护性免疫应答的新颖的重组蛋白。但是，以前尚未报道“增强性”和“抑制性”序列的鉴别。因此，要解决的技术问题是(I)鉴别P33区域中含有假定T细胞表位的序列，所述序列当与P19核心区域相组合时，会产生增强的免疫应答(“增强性序列”)，(2)鉴别和去除P33区域中的抑制pl9表位的免疫原性潜力的序列(“抑制性序列”)，和(3)证实能够通过将来自P33区域的不连续增强性序列与pl9核心区域连接来生产重组亚单位蛋白产物的能力，所述连接的方式使得所述产物可以在基于细胞的系统中有效地表达。以此方式生产的重组亚单位蛋白具有下述潜力克服使用以前的基于P42的疫苗所出现的问题，并稳定地诱导特异性的抗-裂殖子抗体，所述抗体会在动物模型和人类中提供针对疟疾的保护性免疫。因此，要解决的总技术问题是基于源自MSP-IC-端区域的序列，设计、构建和表达一种新颖的重组亚单位蛋白，以产生增强的免疫原性和提高的保护效力。

发明内容
本发明提供了一种具有增强的免疫原性的重组亚单位蛋白，所述性质使所述蛋白适合作为疫苗来在动物模型和人类中针对疟疾提供保护。重组亚单位蛋白包含所述蛋白的MSP-IC-端pl9核心区域和选自MSP-IC-端p33区域的选定片段。添加选定的p33片段导致增强的免疫原性。具体地，所述增强的免疫原性潜力在于，引起稳定的且保护性的抗体应答的能力。所述增强的抗体应答具有在体外和在体内抑制寄生生物生长的潜力，针对由疟疾寄生生物造成的疾病提供保护。本发明的重组亚单位蛋白是由转化的昆虫细胞表达，所述昆虫细胞含有整合在所述细胞基因组内的适当表达盒的拷贝。所述昆虫细胞表达系统会提供具有天然样构象的重组亚单位蛋白的高产率。具体地，所述重组亚单位蛋白由转化的昆虫细胞分泌，并表现为在自然界中未发现的疟疾MSP-IC-端区域的新颖形式。更具体地，所述重组亚单位蛋白是新颖的衍生物，它们已经被制备以提供提高的免疫原性潜力，针对由疟疾寄生生物造成的疾病提供保护。在动物模型中，在具有增强的免疫原性潜力的重组亚单位蛋白的疫苗接种中所产生的抗体能够在体外抑制寄生生物生长。本发明也提供了使用所述重组亚单位蛋白作为疫苗来诱导抗体生产的方法，所述抗体能够在哺乳动物宿主中赋予针对疟疾的保护作用。


图I示出了来自MAD型的恶性疟原虫菌株FUP (Uganda Palo Alto (乌干达帕洛阿 尔托))的MSP-lp42的氨基酸序列；p33区域以正常字体显示，pl9核心区域以粗斜体显示；图2示出了来自3个恶性疟原虫菌株FUP、3D7和FVO的MSP_lp42氨基酸序列的比对；用+符号指示在3D7和FVO中与FUP菌株相同的氨基酸，显示了与FUP菌株不同的氨基酸，pl9核心区域中的氨基酸以粗体显示；用-符号指示在比对中的间隙；P19核心区域以粗斜体显示；图3示出了来自3个N-端截短的亚单位即构建体A、构建体B和构建体C的氨基酸序列相对于FUP p42序列的比对；在p33序列中的CT、C72和p33_7表位显示为粗体，并带有下划线；P19核心区域以粗斜体显示；图4示出了来自所有MSP-IC-端亚单位蛋白构建体的氨基酸序列相对于FUPMSP-lp33序列的比对；图5示出了所有MSP-IC-端亚单位构建体的简图按照据名称排序；图6示出了所有MSP-IC-端亚单位构建体的简图，按照组排序；图7示出了第2组MSP-IC-端构建体的ELISA抗体滴度；图8示出了第I组和第2组MSP-IC-端亚单位的ELISP0T分析。
具体实施例方式本发明提供了疟疾MSP-IC-端重组亚单位蛋白，所述蛋白包含pl9核心区域和p33区域的选定片段。从已经用适当的表达质粒转化的稳定的昆虫细胞系，生产和分泌得到这种重组亚单位蛋白。用本发明的重组亚单位蛋白免疫接种动物，可以有效地诱导稳定的抗体应答。具体地，这些抗体应答能够抑制恶性疟原虫的生长。选定的P33片段与pl9核心的组合，对于诱导特异性的且稳定的免疫应答是至关重要的，所述免疫应答会产生这样的抗体所述抗体能够抑制寄生生物生长，并最终提供免受疟疾的保护。在本发明的优选实施方式中，证实了本文所述的重组疟疾MSP-IC-端亚单位蛋白能够引起比MSP-lp42重组蛋白(在自然界中发现的形式)增强的且稳定的免疫应答。更优选地，所述增强的重组MSP-IC-端亚单位蛋白能够引起稳定的寄生生物抑制性的抗体应答。优选地，所有的免疫受试者具有大于50%的体外生长抑制性的抗体滴度。更优选地，所有的免疫受试者具有大于60%的体外生长抑制性的抗体滴度。甚至更优选地，免疫受试者具有大于70%的体外生长抑制性的抗体滴度。甚至更优选地，免疫受试者具有大于80%的体外生长抑制性的抗体滴度。在本发明的优选实施方式中，“增强性”序列选自MSP_lp33区域，并与pl9核心区域相连，以产生新颖的MSP-IC-端重组亚单位蛋白。除了选择“增强性”序列以外，还从MSP-lp33区域去除了“抑制性”序列，以进一步增强新颖的MSP-IC-端重组亚单位蛋白的免疫原性潜力。在更优选的实施方式中，与MSP-I的pl9核心区域相连的选自p33区域的选定片段含有T细胞辅助表位。这些T细胞辅助表位负责引导针对P19核心区域的增强的免疫应 答，所述P19核心区域自身具有较差的免疫原性。更优选地，选定的p33片段不含有抑制或遏制引起增强的抗体应答(以针对P19核心区域的抑制性抗体的形式)的能力的序列和/或表位。因此，得到的重组蛋白与天然的P33区域的差别仅在于，提供益处的片段被保留，并且具有不利影响的那些片段被去除。在本发明的另一个优选的实施方式中，所述重组疟疾MSP-IC-端亚单位蛋白包含MSP-I的pl9核心和选定的p33片段，pl9核心和选定的p33片段以使重组蛋白可以在基于细胞的表达系统中表达为分泌产物的方式相连。然后纯化分泌的重组亚单位蛋白，并用作免疫原。当用于使动物免疫时，所述纯化的蛋白会产生增强的免疫应答。在另一个优选的实施方式中，使用果蝇(Drosophila) S2细胞作为宿主细胞来表达“MSP-1C-端亚单位蛋白”。“MSP-1C-端亚单位蛋白”是指这样的任意重组蛋白其含有MSP-lpl9核心区域和来自MSP-lp33区域的额外序列，无论p33序列是否是连续的(像在自然界中一样)或不连续的(产生新颖的蛋白)。这些“MSP-1C-端亚单位蛋白”可以源自任意恶性疟原虫菌株。图4提供了在本申请所提及的所有“MSP-1C-端亚单位蛋白”中使用的P33序列的片段。在本发明中，如下采用稳定转化的果蝇S2细胞表达和分泌亚单位蛋白，所述亚单位蛋白包含MSP-IC-端pl9核心区域和源自MSP-IC-端p33区域的片段，所述表达和分泌使用标准的重组DNA方法，将这些蛋白的编码序列可操作地连接至功能性的分泌信号上，并使这些蛋白由经证实在果蝇细胞中功能性的启动子来控制。本文所述的重组MSP-IC-端亚单位蛋白代表源自恶性疟原虫物种的3个不同菌株。编码MSP-IC-端亚单位蛋白的序列来自2个恶性疟原虫菌株，S卩，MAD型的FUP (UgandaPalo Alto (乌干达帕洛阿尔托))、威尔卡姆(Wellcome)型的NF-54 (克隆3D7)和Kl型的FVO (Vietnam-Oak Noll)。将所有序列克隆进果蝇表达质粒中，然后用于转化果蝇S2细胞。因而，本发明的MSP-IC-端亚单位都是相关的，因为它们都含有图5所示的MSP-IC-端pl9核心区域。此外，尽管每个构建体中的p33序列存在差异，但是所有构建体都被设计成引导和增强针对P19核心区域的免疫应答的能力和特异性。针对pl9核心区域的抗体应答增强多少与针对由疟疾感染造成的疾病提供保护作用的能力增加有关。所述MSP-IC-端亚单位蛋白由所述选定的S2细胞系表达和分泌，并首次通过免疫亲和色谱法进行纯化。所述抗-MSP-I单克隆抗体5. 2 (Chang等人，1992) (“5. 2抗体”或“MAb5.2”)被用于纯化。将 5. 2 抗体通过生产商(NHS-Sepharose, Pharmacia, Piscataway (皮斯卡塔韦)，NJ(美国新泽西州))推荐的标准方法，化学结合至适当的柱基质上，以制备合适的柱。
优选地，所述MSP-IC-端亚单位源自恶性疟原虫裂殖子表面蛋白的部分，即p42 ；在FUP和3D7菌株中，p42包含MSP-I的氨基酸Ala1333至Ser17(l5。如本文所述，从稳定转化的昆虫细胞重组地生产和分泌MSP-IC-端亚单位蛋白。所述MSP-IC-端亚单位可能含有MSP-I的整个p42区域或部分p42区域。更优选地，所述MSP-IC-端亚单位含有与MSP_lp33序列相连的MSP-IplO核心区域，MSP-IplO核心区域相对于天然p42而言是连续的或不连续的，但是所有MSP-IC-端亚单位蛋白的长度比FUP和3D7菌株的天然p42短了至少28个氨基酸。所述MSP-IC-端亚单位可以源自恶性疟原虫的3个等位基因类型中的任一个；诸如，K、MAD20和威尔卡姆型，以及间日疟原虫(P. vivax)、三日疟原虫(P. malariae)和卵形疟原虫(P. ovale)的等位基因类型。在所有实施方式中，MSP-IC-端亚单位蛋白的分泌由功能性分泌信号来引导，所述分泌信号能够引导表达产物穿过昆虫细胞分泌途径并进入培养基中。在本文中，使用tPA 前/原分泌前导物和合成的分泌信号，证实MSP-IC-端亚单位蛋白的分泌。令人惊讶地是，且与以前描述的MSP_lpl9和MSP_lp42重组亚单位的报道(其中认为，非常高的抗体滴度是寄生生物生长活性的关键指示物)不同，在本申请中描述的几种重组MSP-IC-端亚单位的引起显著的寄生生物生长抑制活性的能力，不依赖于对产生高滴度抗体应答的需要。经发现，引起中等抗体滴度的几种MSP-IC-端亚单位蛋白也产生显著的寄生生物生长抑制活性。因而，所述MSP-IC-端蛋白是新颖的，因为它们在功能上不同于以前描述的基于MSP-I的重组蛋白之处在于，它们具有引起显著的寄生生物生长抑制活性的能力。本发明因而考虑并提供了重组亚单位蛋白，所述蛋白可以用于疫苗制剂中，作为用于预防或减弱疟原虫属物种感染的措施。所述重组亚单位蛋白可以与佐剂联合使用，作为针对由痕疾感染造成的疾病提供保护的措施。尽管上面提供的描述和下面的实施例主要涉及从恶性疟原虫表达MSP-IC-端亚单位，但所述方法也可以应用于其它疟原虫属物种。例如也危害人类健康的间日疟原虫、三日疟原虫(P. malariae)和卵形疟原虫物种也可以用于人类的健康治疗。可以分别为间日疟原虫、三日疟原虫和卵形疟原虫开发与本文所述的恶性疟原虫的那些构建体类似的构建体，用作预防由疟疾感染造成的疾病的疫苗。
实施例下面的实施例证实了可以从MSP_lp33区域选择并去除序列，以及将选定序列的与MSP_lpl9核心区域相连从而产生新颖的、具有增强的免疫原性潜力的重组亚单位蛋白，以作为疫苗候选物。还使用稳定转化的昆虫细胞，证实了所述新颖的MSP-IC-端亚单位蛋白的表达和分泌。也证实了表达的亚单位蛋白的纯化。提供了证实所述新颖的MSP-IC-端亚单位蛋白的增强的免疫原性的实施例。下面显示的结果表明，增强的免疫原性潜力的选择和证实，会产生高度可变的结果，所述结果可以是缺少特异性免疫应答，也可以是高度集中的免疫应答。因而，为了是免疫应答集中而从P33区域选择的增强性序列即pl9核心区域，并不是完全可预测的，必须以经验为依据来测定。几种MSP-IC-端亚单位蛋白意外地能够引起增强的显著的免疫原性，即大于50%的寄生生物抑制活性，尽管实际上所述新颖的重组蛋白产生中等的普遍抗体应答。因此,本文所述的发明在所述重组亚单位蛋白的组成以及由此得到的免疫原性方面是独特的。下面的实施例旨在示意性说明，而不是限制本发明。实施例IMSP-lp42的p33区域中的T细胞表位的评估为了开发疟疾疫苗，在许多研究中都使用了 MSP-I的pl9或p42亚单位。已有报道记载每一种这些MSP-I亚单位的成功以及失败，如上面所述的和在下面进一步讨论的。因为结果互相矛盾，因此不清楚这些亚单位的哪些区域在它们作为抗原时的下列能力最相关所述抗原引起能够在体外抑制寄生生物生长的抗体应答或所述抗原保护动物免受攻击。已经存在的理论是，针对pl9核心区域的生长抑制性抗体的诱导是由p33区域中的T 辅助表位的特异性决定。支持该理论的一项研究直接对比了重组的P19和p42亚单位的诱导寄生生物生长抑制性抗体的能力(Hui等人，1994)。使用相同的佐剂(FCA)，基于ELISA测定，P19和p42重组体都引起高滴度的抗体。但是，由p42抗原产生的抗体对寄生生物生长是抑制性的，由P19产生的抗体不能抑制寄生生物生长。尽管pl9产生的抗体不能抑制寄生生物生长，但是经证实，P42产生的抗体能够结合寄生生物衍生的MSP-I，使用所述pl9抗原可以交叉吸附所述p42产生的抗体。Udhayakumar等人(1995)的一项研究也支持了该理论，所述研究对于生活在肯尼亚(Kenya)(疟原虫疟疾非常流行的地区)的个体的免疫应答，表征了在p42区域的B和T细胞表位。该研究揭示，B细胞表位主要在pl9核心区域中，并且能够提供增殖应答的T细胞表位位于p33区域中。Lee等人(2001)和Malhotra等人(2008)的研究也已经鉴别出在p33区域中的其它潜在的T细胞表位，这些T细胞表位可能关系到MSP-IC-端区域的保护性免疫应答的增强。尽管没有确定在这些研究中鉴别出的T细胞表位会直接地提供T细胞辅助功能，但是已经提出，这些T细胞表位可能负责使针对重要的寄生生物生长抑制性表位P19的抗体应答集中。尽管这些结果支持了在P33区域中的T细胞辅助功能的理论，但是没有关于重组亚单位的表达的数据，其中所述重组亚单位被设计用来增强动物模型中诱发寄生生物生长抑制性抗体或保护性应答的能力。使用计算机程序来辅助分析，以引导P33的适当片段的选择，保留相关的T细胞表位。首先，分析与为T细胞表位建立的模式拟合的序列在p33区域中的存在(Margalit等人，1987)。所述算法是Menendez-Arias和Rodriguez (1990)的为了选择潜在T细胞表位而编写的计算机程序的一部分。该分析得到14个T细胞表位的预测。含有最高两亲性分数的表位，是在P33的N-端处的保守区域中的表位，LKPLAGVYRSLKKQ。该表位被称作CT (保守的T)。鉴别出的下一个表位位于pl9序列起点之前72个氨基酸处，AHVKITKLSDLKAID，并被称作C72。第三个T细胞表位的鉴别是使用计算机程序ΤΕΡΙΤ0ΡΕ，且所述鉴别基于在p33区域中的 MHC II 类表位的进一步分析(Sturniolo T.等人,Nat. Biotechnology (1999) 17 555-561 ；Singh,H.和 Raghava，G. P. S. (2001) Bioinformatics, 17 (12), 1236-37) 该表位位于pl9序列起点之前22个氨基酸处，LVQNFPNTIISKLIEGK,并被称作p33_7。下面的表I列出了在恶性疟原虫的MSP_lp42的p33区域中的潜在MHC II类T细胞表位。这些表位通过计算机算法预测得出，或基于上述的公开报道得出。表I.在MSP_lp42的p33区域中的潜在T细胞表位
权利要求
1.一种具有增强的免疫原性的MSP-IC-端重组亚单位蛋白，包括 C-端区域的恶性疟原虫MSP-I蛋白的P19核心区域，所述P19核心区域添加有p33区域的选定片段； 所述重组亚单位蛋白在基于细胞的表达系统中表达和分泌。
2.根据权利要求I所述的重组亚单位蛋白，其特征在于，所述增强的免疫原性通过增加的且稳定的寄生生物生长抑制活性来测量。
3.根据权利要求2所述的重组亚单位蛋白，其特征在于，所有被免疫的动物产生大于50%的寄生生物生长抑制活性。
4.根据权利要求I所述的重组亚单位蛋白，其特征在于，通过删除在SEQID NO=USEQID N0:2、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :7 和 SEQ ID NO :17 中所示的所述 p33 区域的 N-端，从而衍生出所述亚单位。
5.根据权利要求I所述的重组亚单位蛋白，其特征在于，通过连接在SEQID N0:8、SEQID NO =IUSEQ ID NO :14和SEQ ID NO : 18中所示的选定的p33区域片段，从而衍生出所述亚单位。
6.一种根据权利要求I所述的重组亚单位蛋白的表达，其特征在于，所述表达系统是真核细胞培养系统。
7.根据权利要求6所述的重组亚单位蛋白的表达，其特征在于，所述细胞培养表达系统使用昆虫细胞。
8.根据权利要求7所述的重组亚单位蛋白的表达，其特征在于，所述昆虫细胞是果蝇S2细胞。
9.一种疫苗制剂，其特征在于，包括能够针对疟疾感染提供保护的MSP-IC-端亚单位蛋白。
10.根据权利要求9所述的疫苗制剂，其特征在于，所述MSP-IC-端亚单位蛋白示于SEQID NO: I、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID NO: 11、SEQ IDNO: 14、SEQ ID NO :17 和 SEQ ID NO :18。
全文摘要
本发明提供一种源自寄生虫恶性疟原虫的MSP-1C-端区域的重组亚单位蛋白，所述重组亚单位蛋白具有增强的免疫原性。将p33的选定区域与p19组合，以增强p19核心区域的免疫原性潜力。由于所述构建体表现为不连续片段融合以建立独特的蛋白，因此所表达的重组蛋白在自然界中没有发现。本发明揭露的重组蛋白的增强的免疫原性潜力会带来强烈的、稳定的且特异性的抗体应答。本发明所揭露的重组亚单位蛋白是用于保护免受疟疾感染的疫苗候选物。
文档编号A61K39/002GK102648209SQ201080052479
公开日2012年8月22日 申请日期2010年11月18日 优先权日2009年11月18日
发明者D·E·克莱门茨, G·S·N·辉, K·M·普斯克 申请人:夏威夷大学, 夏威夷生物技术公司