牛病毒性腹泻病毒e2蛋白亚单位疫苗制备方法
【专利摘要】本发明涉及牛病毒性腹泻病毒E2蛋白亚单位疫苗制备方法。其优点如下：(1)建立了高效获取BVDV E2蛋白的表达方法；(2)用BVDV的E2蛋白表达上清免疫兔子，证明有良好的免疫反应，可用于制备BVDV亚单位疫苗。CGMCC No.1254520160601
【专利说明】
牛病毒性腹泻病毒E2蛋白亚单位疫苗制备方法
技术领域
[0001] 本发明所设及的牛病毒性腹泻病毒(BVDV化2蛋白表达及其亚单位疫苗制备方法， 属兽用生物制品领域。
【背景技术】
[0002] 牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)可引起的牛的腹泻及 繁殖失败。怀孕母牛感染BVDV后，可引起死产、流产W及胚胎崎形，或是分娩出持续感染辖 牛。运种持续感染的辖牛虽不表现任何临床症状，但可终身带毒，持续排毒，成为重要传染 源，在我国广泛存在，给我国养牛业造成重大的经济损失。
[0003] BVDV属于黄病毒科攝病毒属，其基因组为单股正链RNA，全长约12.5肺，仅含有一 个能编码约4000个氨基酸多聚蛋白大的0RF，多聚蛋白经翻译和加工后，可形成11种成熟的 蛋白，其中C、化ns、El、E2是病毒的结构蛋白。E2是BVDV的囊膜蛋白，免疫原性最强，能同时 诱导机体产生体液免疫和细胞免疫，并产生中和抗体，是制备检测抗原和疫苗的首选基因， 对BVDV E2表达和免疫原性的研究已经进行了很多。Marzocca MP等将E2基因在黑腹果蛹里 进行表达，重组的E2蛋白表现出良好的抗原性（Truncated E2of bovine viral diarrhea virus(BVDV)expressed in Drosophila melanogaster cells:a candidate antigen for a BVDV ELISA. J Virol Methods，2007,144(1-2) :49-56) ;Ferrer F等用Rachiplusia nuperos杆状病毒蛋白表达体系获得E2重组蛋白，经实验证明，该蛋白可诱导中和抗体的产 生，可用于审Ij备疫苗抗原（Induction of virus neutralizing antibodies by immunization with Rachiplusia nuperos infected with a recombinant baculovirus expressing the E2glycoprotein of bovine viral diarrhea virus.J Virol Methods， 2007，146( 1-2): 424-427)。国内已采用了多种方式对其进行表达(如:徐兴然等，牛病毒性 腹泻病病毒化angchunl84株E2基因的克隆及在大肠杆中的高效表达），但原核表达产物为 包涵体，无正确结构，活性差。因此，需进一步研究E2蛋白的表达方法，W获取可溶的高活性 蛋白。
[0004] 研究发现，不同物种对氨基酸密码子的使用频率有很大差异，因此，本发明中将 BVDV E2基因密码子优化为昆虫杆状病毒偏好密码子，W提高BVDV E2的表达量。
[0005] 本发明的目的是建立BVDV E2蛋白及其亚单位疫苗制备方法。
【发明内容】
[0006] 本发明的技术方案
[0007] 1.牛病毒性腹泻病毒E2蛋白亚单位疫苗制备方法，其特征在于该疫苗是由构建的 已被命名为首猜银蚊夜蛾核型多角体病毒(简称杆状病毒)BacVDMoptiE2株作为生产毒株 制备而成，该毒株已于2016年06月Ol日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微 生物研究所中国微生物保藏委员会普通微生物保藏中屯、，保藏号分别为:CGMCC No. 12545。 [000引2.权利要求1所述牛病毒性腹泻病毒E2蛋白亚单位疫苗制备方法，其特征在于其 构建的杆状病毒BacVDMoptiE2株中携带MoptiE2-l(序列I)和MoptiE2-2(序列2)。
[0009] 3.如权利要求1所述牛病毒性腹泻病毒(BVDV化2蛋白亚单位疫苗制备方法，其特 征在于用其构建的杆状病毒BacVDMoptiE2株进行表达获得可溶性E2蛋白，经灭活，加入适 宜佐剂乳化后制备成亚单位疫苗。
[0010] 本发明的主要技术原理
[0011]参考BVDV E2基因序列，采用全基因合成的手段，合成优化的BVDV E2基因序列 (optiE2);再通过重叠延伸PCR技术分别将优化的BVDV E2基因序列(optiE2)与分泌信号肤 Mels基因融合，获得转移载体；
[0012] 将转移载体通过转座技术克隆至杆状病毒基因组中，构建重组杆状病毒，获得 BVDV E2蛋白；
[0013] 将获得的BVDV E2蛋白加上适宜佐剂，乳化后免疫动物，分析其做为亚单位疫苗的 可行性；
[0014] 本发明【具体实施方式】
[0015] 1.BVDV E2基因序列的获得
[0016] 采用全基因合成的手段，合成优化的BVDV E2基因序列(optiE2)，克隆至pMD 18载 体，命名为:质粒p〇ptiE2。
[0017] 2.E2基因与信号肤序列融合
[0018] 提取popt iE2，设计引物并加上合适酶切位点，通过重叠延伸PCR技术（重叠延伸 PCR技术及其在基因工程上的应用[J].分子植物育种，2006，05 : 747-750)获得与信号肤 16 13基因融合，克隆至口10 18载体。构建的融合基因质粒分别命名为口1〇口*162-1、 pMoptiE2-2〇
[0019] 融合基因质粒pMoptiE2-l中携带的序列，即:MoptiE2-l(序列1):
[0020] 上游添加 BamHI酶切位点，下游添加终止密码子及化ndn I位点
[0021]
[0022] 融合基因质粒pMoptiE2-2中携带的序列，即:MoptiE2-2(序列2):
[0023] 上游添加 SmaI酶切位点，下游添加终止密码子及KpnI位点
[0024]
[0025] 3.亚克隆至杆状病毒转移载体
[0026] 将pMoptiE2-l和载体pFastBacDual分别进行双酶切，纯化回收，酶切片断 MoptiE2-l与pFastBacDual线性质粒连接，转化，鉴定，获得的新质粒命名为pFB-MoptiE2; 再将pMoptiE2-2和载体pFB-MoptiE2分别进行双酶切，纯化回收，酶切片断MoptiE2-2与 pFB-MoptiE2线性质粒连接，转化，鉴定，获得的新质粒命名为pFB-DMoptiE2(D表示双表 达)。
[0027] 4.转座获得重组杆粒DNA
[0028] 分别将pFB-MoptiE2、pFB-DMoptiE2转化DHlOBac构建出的杆粒DNA分别命名为： bMoptiE2、bDMoptiE2。
[0029] 5.重组病毒的获得
[0030] 分别将重组杆粒61〇91:162、601〇91:162用转染试剂〔61"6(31:;[]1转染3'9细胞，扩大 培养，收集培养上清进行PCR鉴定。分别获得重组杆状病毒命名为杆状病毒BacVMoptiE2株 和杆状病毒BacVDMoptiE2,该两毒株建议的分类命名均为首猜银蚊夜蛾核型多角体病毒， 其中杆状病毒BacVDMoptiE2已于2016年06月Ol日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中 国科学院微生物研究所中国微生物保藏委员会普通微生物保藏中屯、，保藏号分别为:CGMCC No.12545。
[0031] 6.表达分析
[0032] 将鉴定好的病毒传代扩大培养，第二代记为P2Stock，第S代记为P3Stock。前S代 均做为种毒，取第3代培养上清接种48孔板中的sf9细胞，同时设不接毒对照。60小时后弃上 请，用预冷的固定液(丙酬：甲醇=I: I)固定。弃固定液，力邮VDV McAb (来自AHVLA)，37 °C解 育50min，用PBS洗3遍，加門TC标记的羊抗鼠抗体，37 °C解育50min，用PBS洗3遍，巧光显微镜 下观察。结果表明，接毒sf9细胞孔出现明显的亮绿色巧光（图1中图A，图B)，而未接毒sf9细 胞孔未显巧光(图1中的图E)。说明重组杆状病毒能表达BVDV E2蛋白。
[0033] 7.乳化配苗
[0034] WBacVDMoptiE2表达蛋白配苗为例。
[0035] 将鉴定正确的种毒用sf9细胞扩增至P6代，测定病毒滴度。用E邱ressFive培养基 (Invitrogen公司）悬浮培养Hi曲Five昆虫细胞（Invitrogen公司）（27°C，ISOr/min震荡培 养），待化曲Five昆虫细胞长至对数生长期时，更换新的E邱ressFive培养基，调整细胞浓 度为2~5 X l〇-6/ml，将重组杆状病毒BacVDMoptiE2 WIMOI剂量感染细胞，96小时后收获。 200化/min离屯、IOmin，取上清，进行SDS-PAGE电泳，计算目标产物含量。将肥I加入抗原中， 终浓度为1mmol/L，置37 °C灭活4她，即可将重组病毒灭活。
[0036] 8. BVDV亚单位疫苗的制备及动物免疫
[0037] WBacVDMoptiE2为例，将BacVDMoptiE2表达上清浓缩10倍后按l:l(v/v)比例加入 ISA206佐剂，乳化后免疫大耳白兔，皮下多点注射，每只Iml，28天后加免一次。加免14天后 采血，分离血清，56°C灭活30min。用分离的血清做中和试验。方法:稀释BVDV 0regonC24至 300TCID5〇/ml，将血清用MEM按2X、4X、8X、16X、32X、64X、128X、256X稀释，37°C作用 60min，然后接种于准备好的48孔MD服细胞板中，37°C吸附90min。然后吸干，每孔加入含2% FBS的MEM培养液0.5ml，37 °CC〇2培养箱培养72h。吸干，用PBS漂洗3遍，吸干，用BVDV巧光抗 体液染色。有典型绿色巧光信号的孔表示未中和。
[0038] 结果表明，血清中和效价可达1:128,说明BVDV亚单位疫苗免疫兔子后能诱导产生 中和抗体，可W做为候选疫苗使用。
[0039] 本发明设及的微生物资源信息
[0040] 本发明构建获得的重组杆状病毒BacVDMopt iE2株，父本为来自DHlOBac菌 (Invi化Ogen公司）中的杆状病毒基因组，通过将外源基因 BVDV E2基因与分泌信号肤Mels 的融合基因全序列克隆入炸astBacDual质粒2个读码框后，与DHlOBac菌中的杆状病毒基因 组重组后获得的新杆状病毒BacVDMoptiE2株，该毒株建议的分类命名均为首猜银蚊夜蛾核 型多角体病毒，并于2016年06月Ol日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生 物研究所中国微生物保藏委员会普通微生物保藏中屯、，保藏号分别为:CGMCC No. 12545。
【附图说明】
[0041 ] 图1其中图A-D显示接毒sf9细胞孔出现明显的亮绿色巧光，图A.为BacVME2，图B. 为BacVDME2，图C.为BacVMoptiE2，图D.为BacVDMoptiE2;E.为未接毒Sf9细胞的对照未显巧 光
[0042] 图2本发明的技术路线
[0043] 本发明的优点
[0044] 本发明设及牛病毒性腹泻病毒E2蛋白亚单位疫苗制备方法。其优点如下：1.建立 了高效获取BVDV E2蛋白的表达方法;2.用BVDV的E2蛋白表达上清免疫兔子，证明有良好的 免疫反应，可用于制备BVDV亚单位疫苗。 实施例
[0045] 实施例1
[0046] --重组杆状病毒的构建
[0047] 按照本发明同样的原理，已同时构建出含天然BVDV E2基因的重组杆状病毒。
[004引 1.BVDV E2基因序列的获得
[0049] BVDV BA株(CVCC AV69)感染材料中提取病毒RNA，通过常规RT-PCR技术，获得BVDV E2基因，克隆至pMD 18载体，命名为:质粒祀2。
[0050] 2.E2基因与信号肤序列融合
[0051] 提取pE2,设计引物并加上合适酶切位点，通过重叠延伸PCR技术获得与信号肤 Mels基因融合，克隆至pMD 18载体。构建的融合基因质粒分别命名为pME2-l、pME2-2。
[0052] 融合基因质粒PME2-1中携带的序列，即:ME2-U序列3):
[0053] 上游添加 BamHI酶切位点，下游添加终止密码子及化ndn I位点 [00541
[0055] 融合基因质粒PME2-2中携带的序列，即:ME2-2(序列4):
[0056] 上游添加 SmaI酶切位点，下游添加终止密码子及KpnI位点
[0化7]
[005引3.亚克隆至杆状病毒转移载体
[00别将PME2-1和载体pFastBacDual分别进行双酶切，纯化回收，酶切片断ME2-1与 pFas巧acDual线性质粒连接，转化，鉴定，获得的新质粒命名为PFB-ME2;再将PME2-2和载体 PFB-ME2分别进行双酶切，纯化回收，酶切片断ME2-2与PFB-ME2线性质粒连接，转化，鉴定， 获得的新质粒命名为pFB-DME2(D表示双表达）；
[0060] 4.转座获得重组杆粒DNA
[0061 ] 分别将pFB-ME2、pFB-DME2转化DHlOBac构建出的杆粒DNA分别命名为：bME2、 bDME2〇
[0062] 5.重组病毒的获得
[0063] 分别将重组杆粒bME2、bDME2用转染试剂Cellfectin转染sf9细胞，扩大培养，收集 培养上清进行PCR鉴定。分别获得重组杆状病毒命名为杆状病毒BacVME2株和BacVDME2株， 该两毒株建议的分类命名均为首猜银蚊夜蛾核型多角体病毒。
[0064] 实施例2
[00化]--重组病毒表达分析
[0066]将鉴定好的病毒传代扩大培养，第二代记为P2Stock，第S代记为P3Stock。前S代 均做为种毒，取第3代培养上清接种48孔板中的sf9细胞，同时设不接毒对照。60小时后弃上 请，用预冷的固定液(丙酬：甲醇=1:1)固定。弃固定液，力邮VDV McAb(来自AHVLA)，37°C解 育50min，用PBS洗3遍，加門TC标记的羊抗鼠抗体，37 °C解育50min，用PBS洗3遍，巧光显微镜 下观察。结果表明，接毒sf9细胞孔出现明显的亮绿色巧光（图1中图C和图D)，而未接毒sf9 细胞孔未显巧光（图I中的图E)。说明重组杆状病毒能表达BVDV E2蛋白。
[0067]结果表明，血清中和效价可达1:128,说明BVDV亚单位疫苗免疫兔子后能诱导产生 中和抗体，可W做为候选疫苗使用。
【主权项】
1. 牛病毒性腹泻病毒E2蛋白亚单位疫苗制备方法，其特征在于该疫苗是由构建的已被 命名为苜蓿银蚊夜蛾核型多角体病毒（简称杆状病毒)BacVDMoptiE2株作为生产毒株制备 而成，该毒株已于2016年06月Ol日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物 研究所中国微生物保藏委员会普通微生物保藏中心，保藏号分别为:CGMCC No. 12545。2. 权利要求1所述牛病毒性腹泻病毒E2蛋白亚单位疫苗制备方法，其特征在于其构建 的杆状病毒BacVDMoptiE2株中携带MoptiE2-l(序列1)和MoptiE2-2(序列2)。3. 如权利要求1所述牛病毒性腹泻病毒E2蛋白亚单位疫苗制备方法，其特征在于用其 构建的杆状病毒BacVDMoptiE2株进行表达获得可溶性E2蛋白，经灭活，加入适宜佐剂乳化 后制备成亚单位疫苗。
【文档编号】C12N15/40GK105924506SQ201610517156
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年7月4日
【发明人】范学政, 赵启祖, 姚文生, 丁家波, 宁宜宝, 徐璐, 王芳, 王琴, 邹兴启, 朱元源, 朱良全, 蒋卉
【申请人】中国兽医药品监察所