用于检测赤羽病毒、牛病毒性腹泻病毒和蓝舌病毒的GeXP多重快速检测用引物和检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术应用领域，尤其是用于三种进境奶牛病毒病的同时检测与鉴 定。
【背景技术】
[0002] 赤羽病（Akabane Disease，AKA)、牛病毒性腹泻（Bovine Viral Diarrhea，BVD)和 蓝舌病(Bluet〇ngue，BT)是国家规定的进境奶牛需要隔离检疫的3种病毒性疾病。近几年， 随着国民对优质奶制品需求的提升，进境奶牛数量逐年攀升，给奶牛进境口岸动物疫病检 测实验室带来一定的工作压力和经费负担。因此，建立一种可以同时鉴别诊断多种奶牛疫 病的高通量快速检测方法对减轻奶牛进境口岸检测实验室工作负担、降低检测经费及开展 进境奶牛携带疫病的流行病学调查具有重要意义。
[0003] 目前，针对进境奶牛的多种病毒性疾病，口岸动物检疫实验室普遍应用病毒分离、 血清学方法和分子生物学方法进行检测。病毒分离培养是诊断的金标准，但存在测周期长、 操作繁琐等问题;病毒中和试验需要特异性的标准血清或病毒毒株，在实际应用中具有一 定的局限性;进口的酶联免疫试剂盒普遍价格昂贵;普通PCR、荧光定量PCR等分子生物学方 法皆为针对单一病毒检测，无法满足多种病原混合感染鉴别诊断的检测需求。多重PCR技术 已经应用于多种病原的鉴别诊断，但由于扩增偏爱性问题无法实现真正意义上的高通量检 测 。
【发明内容】
[0004] 近几年由于进口奶牛数量的逐年增多，承担进境奶牛疫病检测任务的动物检疫工 作人员亟需一种灵敏度高、特异性好的检测方法以满足降低外来动物疫病传入风险和实现 快速通关的工作需求。目前，大多口岸动检实验室所应用的血清学(酶联免疫法)实验，每种 检测试剂盒只能检验单一动物疫病，无法鉴别多种动物疫病的混合感染，并且进口检测试 剂盒昂贵的价格而给检测实验室带来很大的经济压力。因此，建立一种高通量、快速、特异 性好的检测方法对于降低动物疫病传入风险，加速进境动物通关，促进贸易便利化以及降 低动物疫病检测成本均有重要的意义。
[0005] GeXP多重基因表达分析系统将多重PCR技术和毛细管电泳技术结合起来，不仅具 有多重PCR扩增高通量检测的优点，而且具有毛细管电泳灵敏性高的特点。GeXP的技术特 点是在特异性引物的5'端加入通用引物序列，组成特异性嵌合引物。在PCR反应过程中，特 异性嵌合引物先分别与对应的模板结合，保证后续扩增的特异性，经过多个循环以后，由通 用引物主导后续的扩增，这样可以减少同一反应体系中不同引物之间的干扰，实现每对引 物扩增效率趋于一致，从而有效解决了常规多重PCR技术的扩增偏爱性问题。
[0006] 本研究根据3种进境奶牛检疫性病毒的基因保守序列，分别设计了多对特异性引 物和通用引物，优化反应条件，通过对单一病毒模板、混合病毒模板的检测验证了 GeXP多重 RT-PCR体系中每对引物扩增的特异性和准确性，建立了同时检测3种奶牛病毒病的GeXP高 通量方法，检测灵敏度至少可达1〇2拷贝/yL。该方法可为进境奶牛病毒病的分子诊断及境 外奶牛疫病的流行病学调查提供技术支持。今后，还需要大量的阳性样本或病毒毒株对本 方法做进一步的验证和优化。
【附图说明】
[0007] 图1-图4 GeXP多重RT-PCR特异性验证结果（图1，AKAV;图2，BVDV;图3，BTV;图4， 50bp-800bp Marker)，图中Y轴为相对荧光单位，表示扩增产物的荧光强度，X轴为毛细管电 泳过程中扩增产物的大小。
[0008] 图5-图10 GeXP多重RT-PCR对3种病毒模板的灵敏度结果（图5，106copiesAiL;图 6，10 5copies/yL;图7，lC^copies/yL;图8，103copies/yL;图9，10 2copies/yL;图10，50bp-800bp Marker)〇
【具体实施方式】
[0009] GeXP启动试剂盒、DNA size standard Kit、分离缓冲液、上样缓冲液购自美国贝 克曼公司，一步法RT-PCR试剂盒、RNA提取试剂盒、基因纯化试剂盒购自德国QIAGEN公司，T7 体外转录试剂盒、Spe I限制性核酸内切酶和RNA酶抑制剂均购自大连宝生物公司，pGEX-T 载体购自Promega公司。
[0010] 参考文献选择各病毒基因保守区并从GenBank数据库中下载3种病毒的基因序列， 通过DNASTAR软件分析序列同源性，并用GeXP express Profiler工具设计多重特异性引 物。在正、反向特异性引物5'端分别连接一段非同源性序列作为通用引物(Tag)，组成特异 性嵌合引物。引物由Invitrogen公司合成，HPLC纯化。
[0011] SEQ ID NOd-AKASJ'-AGGTGACACTATAGAATACACTGCCTTTACGCTCCATC-S' 5'端用 cy5标记；
[0012] SEQ ID N0：2-AKA4：5/-GTACGACTCACTATAGGGACGGTGCATGTCGATAACCAG-3 /：
[0013] SEQ ID NOd-BTSJ'-AGGTGACACTATAGAATAGTTCTCTAGTTGACCACCXy 5'端用cy5 标记；
[0014] SEQ ID N0：4-BT4：5/-GTACGACTCACTATAGGGAAAGCCAGACTGTTTCCCGAT-3 /；
[0015] SEQ ID NO^-BVDVS^^AGGTGACACTATAGAATA A GCGAA GGCCGAAAA GA GGCTA-37 5'端用cy5标记；
[0016] SEQ ID N0：6-BVDV4：
[0017] 57-GTACGACTCACTATAGGGAAACTCCATGTGCCATGTACAGCAG-3 7 ；
[0018] SEQIDN0:7-通用引物l:5/-AGGTGACACTATAGAATA-3 /5/端用cy5标记；
[0019] SEQ ID如:8-通用引物2:5/-6丁八06八(：1^八(7^丁八666八-3灭活的八1^￥、8￥0￥、81'毒株 均为本实验室保存。病毒RNA的提取使用QIAGEN公司RNA提取试剂盒，洗脱体积为40yL，于-80°C保存。
[0020] 以不含通用引物的特异性引物分别扩增含有目的基因区域的病毒RNA，扩增后的 PCR产物连接到pGEX-T载体进行单克隆构建质粒，提取克隆质粒，Spe I酶切线性化，并用基 因纯化试剂盒对线性化后质粒进行纯化，用T7转录试剂盒进行体外转录，利用紫外分光光 度计测量RNA浓度并计算各病毒RNA的拷贝数。
[0021] 将通用引物稀释至工作浓度ΙΟμ mol/L，特异性引物稀释至工作浓度Ιμπιο?/L。提取 3种病毒RNA作为模板，按照一步法RT-PCR试剂盒配制反应体系：10 X RT-PCR缓冲液2.5yL， dNTP预混液2yL，RT-PCR Enzyme Mix lyL，RNA酶抑制剂O.lyL，上下游嵌合引物（Ιμπιο?/L) 各取lyL，上下游通用引物（ΙΟμ mol/L)各取lyL，模板RNA2yL，用不含核酸酶的水补足25yL。 经过条件优化后，最终确定反应条件为:45°C30min，94°C15min逆转录;然后:94°C30s，55°C 30s，72°C30s，10个循环；94°C30s，65°C30s，72°C30s，10个循环；94°C30s，50°C30s，72°C 30s，20个循环;72°C10min，1个循环。反应产物进行GeXP system毛细管电泳分析。
[0022] 将各病毒对应的嵌合引物分别取等量进行混合，配制成多重混合引物，使各引物 浓度为lOwnol/L，并在反应体系中的终浓度为50nmol/L，反应体系中其它成分同单重RT-PCR，取3种病毒灭活样本核酸验证多重RT-PCR检测体系中各引物的特异性。
[0023] 将体外转录病毒RNA梯度稀释至105、104、103、102、10 1拷贝AxL，各取lyL作为模板， 检测多重体系的灵敏度。
[0024] 根据多引物单模板灵敏度试验结果调整各对引物浓度。将3种病毒体外转录RNA等 浓度混合并梯度稀释为1〇6、1〇 5、1〇4、1〇3、1〇2拷贝/^以乍为模拟混合样品，其余反应条件不 变，进行多引物多模板灵敏度分析。实验非同日重复三次，记录检测结果并计算各基因检测 的变异系数CV。
【具体实施方式】
[0025]
[0026] 实施例1引物验证
[0027]单重RT-PCR产物经GeXP系统毛细管电泳分析，各目的基因扩增片段大小分别为 BTV: 306~308bp，AKAV: 267~269bp，BVDV: 349~353bp，扩增片段大小与设计相符。
[0028] 实施例2多重检测体系建立及单模板特异性验证结果
[0029] 多引物检测体系中，每个反应只扩增出单一病毒模板的特异片段，无交叉反应，提 示此方法特异性强，可根据扩增片段大小鉴别区分各病毒，结果见图1-图4。
[0030] 实施例3多重检测体系单模板灵敏度试验结果
[0031] 利用克隆质粒体外转录RNA为模板，各种病毒的检测下限均为100拷贝AiL。
[0032] 实施例4多重检测体系多模板灵敏度结果
[0033] 优化反应条件后，多重检测体系可在106、105、104、10 3、102拷贝/VL水平同时检测3 种病毒RNA的模拟混合模板，结果见图5-图10。实验非同日三次重复，在10 4拷贝/VL时，各病 毒基因变异系数介于1.4 %~5.8 %之间。
【主权项】
1. 一种同时检测赤羽病（Akabane Disease，AKA)、牛病毒性腹泻（Bovine Viral Diarrhea，BVD)、蓝舌病(Bluetongue，BT)的引物组合：其特征在于特异性引物和通用引物 序列如SEQ N0:1至8所示。2. 权利要求1所述的引物组合在制备赤羽病(Akabane Disease，AKA)、牛病毒性腹泻 (Bovine Viral Diarrhea，BVD)、蓝舌病(Bluetongue，BT)诊断试剂中的应用。3. -种同时检测赤羽病（Akabane Disease，AKA)、牛病毒性腹泻（Bovine Viral Diarrhea，BVD)、蓝舌病(Bluetongue，BT)的试剂盒，其特征在于其特异性引物和通用引物 序列分别为：SEQ NO: 1-8所示的引物;GeXP启动试剂盒、分离缓冲液、上样缓冲液，一步法 RT-PCR试剂、RNA提取试剂、基因纯化试剂； 将通用引物稀释至工作浓度ΙΟμ mol/L，特异性引物稀释至工作浓度lymol/L，提取3种 病毒RNA作为模板，按照一步法RT-PCR试剂盒配制反应体系：10 X RT-PCR缓冲液2.5yL，dNTP 预混液2yL，RT-PCR Enzyme Mix lyL，RNA酶抑制剂O.lyL，上下游嵌合引物（Ιμπιο?/L)各取1 yL，上下游通用引物（lOymol/L)各取lyL，模板RNA 2yL，用不含核酸酶的水补足25yL;经过 条件优化后，最终确定反应条件为:45°C30min，94°C 15min逆转录;然后:94°C30s，55°C30s， 72°C30s，10 个循环；94°C30s，65°C30s，72°C30s，10 个循环；94°C30s，50°C30s，72°C30s，20 个循环;72°C10min，1个循环，反应产物进行GeXP system毛细管电泳分析。
【专利摘要】本研究拟建立基于GeXP多重基因表达遗传分析系统的多种奶牛疫病检测方法，解决多种奶牛疫病检测时血清学方法灵敏度低，常规PCR只能针对单一病原体检测，基因芯片方法成本较高等问题，构建3种奶牛疫病RNA阳性样本参考品；以参考品RNA的10倍连续稀释参考品为检测对象，灵敏度为检测至100拷贝；与其他奶牛疫病无交叉反应，无假阴性；检测实际样本600份，满足大量奶牛多种疫病的监控筛查要求。
【IPC分类】C12R1/93, C12Q1/70, C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105567868
【申请号】CN201510784139
【发明人】王乃福, 刘洋, 吴冬雪, 黄晨, 陈小金, 王万骞, 董志珍, 赵祥平
【申请人】天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心
【公开日】2016年5月11日
【申请日】2015年11月17日