Cdk18在制备诊断冠心病产品中的用图
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子诊断领域，涉及一种用于冠心病诊断的分子标志物，具体涉及血 液中的分子标志物-CDK18基因在制备诊断冠心病的产品中的应用。
【背景技术】
[0002] 动脉粥样硬化性心脑血管病已成为世界范围关注的主要健康问题。2004年的世界 卫生组织(WHO)报告显示，全世界每年心血管疾病以冠心病和脑卒中为主导致的死亡人数 达高达1720万，占所有死亡人数的三分之一。预计2020年这一数字将进一步增加50%，高达 2500万，心血管疾病是全球人类的"头号杀手"。在中国进行的一项大规模前瞻性研究也显 示，心脏疾病已经成为中国人群的主要死亡原因，分列男、女性死亡原因的第2位和第1位。 我国每年新发心肌梗死50万人，随着生活方式的改变以及动脉粥样硬化相关的危险因素持 续增加，冠心病与心肌梗死发病也还将呈持续上升趋势。
[0003] 大量的研究资料表明，冠心病是一种复杂疾病，是由多个微效基因与环境因素长 期相互作用所致。因此鉴定出与冠心病相关的易感基因或致病基因，在人群中进一步筛选 增加疾病风险的易感基因确定易感个体，将有助于冠心病的发病风险预测、新药开发、诊断 和个体化治疗。
【发明内容】
[0004] 为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种可用于冠心病早期诊断的 分子标志物。相比传统的冠心病的诊断方法，使用基因标志物来诊断冠心病具有及时性、特 异性和灵敏性，从而使患者在疾病早期就能知晓疾病风险，针对风险高低，采取相应的预防 和治疗措施。
[0005] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0006] 本发明提供了检测CDK18基因表达的产品在制备诊断冠心病的工具中的应用。
[0007] 进一步，上面所提到的检测CDK18基因表达的产品包括：通过RT-PCR、实时定量 PCR、免疫检测、原位杂交、芯片或高通量测序平台检测CDK18基因表达水平以诊断冠心病的 产品。
[0008] 进一步，所述用RT-PCR诊断冠心病的产品至少包括一对特异扩增⑶K18基因的引 物;所述用实时定量PCR诊断冠心病的产品至少包括一对特异扩增CDK18基因的引物;所述 用免疫检测诊断冠心病的产品包括:与CDK18蛋白特异性结合的抗体;所述用原位杂交诊断 冠心病的产品包括:与CDK18基因的核酸序列杂交的探针;所述用芯片诊断冠心病的产品包 括:蛋白芯片和基因芯片;其中，蛋白芯片包括与CDK18蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包 括与CDK18基因的核酸序列杂交的探针。
[0009] 在本发明的具体实施方案中，所述用实时定量PCR诊断冠心病的产品至少包括一 对特异扩增CDK18基因的引物的序列如SEQIDN0.3和SEQIDN0.4所示。
[0010] 优选地，所述诊断工具包括芯片、试剂盒、试纸或高通量测序平台。其中，高通量测 序平台是一种特殊的诊断工具，检测CDK18基因表达的产品可以应用于该平台实现对CDK18 基因的表达情况的检测。随着高通量测序技术的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成 为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的 异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知CDK18基因的异常与冠心病相关也属于CDK18 基因的用途，同样在本发明的保护范围之内。
[0011] 本发明还提供了一种诊断冠心病的工具，所述诊断工具包括芯片、试剂盒、试纸、 或高通量测序平台。
[0012] 其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片;所述基因芯片包括固相载体以及固定 在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测CDK18基因转录水平的针对 CDK18基因的寡核苷酸探针;所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的CDK18蛋 白的特异性抗体;所述基因芯片可用于检测包括CDK18基因在内的多个基因（例如，与冠心 病相关的多个基因）的表达水平。所述蛋白质芯片可用于检测包括CDK18蛋白在内的多个蛋 白质(例如与冠心病相关的多个蛋白质）的表达水平。通过将多个与冠心病的标志物同时检 测，可大大提高冠心病诊断的准确率。
[0013] 其中，所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒;所述基因检测试 剂盒包括用于检测CDK18基因转录水平的试剂;所述蛋白免疫检测试剂盒包括CDK18蛋白的 特异性抗体。进一步，所述试剂包括使用RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片 方法检测CDK18基因表达水平过程中所需的试剂。优选度，所述试剂包括针对CDK18基因的 引物和/或探针。根据CDK18基因的核苷酸序列信息容易设计出可以用于检测CDK18基因表 达水平的引物和探针。
[0014] 与CDK18基因的核酸序列杂交的探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它 衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合， 任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的 长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂 交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超 过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序 列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。
[0015] 所述高通量测序平台包括检测CDK18基因表达水平的试剂。
[0016] 所述试纸包括试纸载体和固定在试纸载体上的寡核苷酸，所述寡核苷酸能够检测 CDK18基因的转录水平。
[0017]进一步，所述⑶K18蛋白的特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体。所述⑶K18蛋 白的特异性抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰（例如，，嵌合抗体、scFv、 Fab、F(ab'）2、Fv等。只要所述片段能够保留与CDK18蛋白的结合能力即可。用于蛋白质水平 的抗体的制备时本领域技术人员公知的，并且本发明可以使用任何方法来制备所述抗体。
[0018] 在本发明的具体实施方案中，所述针对CDK18基因的引物序列如下:正向引物序列 如SEQ ID N0.3所示，反向引物如SEQ ID N0.4所示。
[0019] 用于诊断冠心病的⑶K18基因及其表达产物的来源包括但不限于血液、组织液、尿 液、唾液、脊髓液等可以获得基因组DNA的体液。在本发明的具体实施方案中，用于诊断冠心 病的CDK18基因及其表达产物的来源是血液。
[0020] 在本发明的上下文中，"⑶K18基因"包括⑶K18基因以及⑶K18基因的任何功能等 同物的多核苷酸。CDK18基因包括与目前国际公共核酸序列数据库GeneBank中⑶K18基因 (%_000001.11)0嫩序列具有70%以上同源性，且编码相同功能蛋白质的0嫩序列；
[0021] 优选地，CDK18基因的编码序列包括以下任一一种DNA分子：
[0022] (1)序列表中SEQ ID N0.1所示的DNA序列；
[0023] (2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码相同功能蛋白质的DNA序列；
[0024] (3)与（1)或(2)限定的DNA序列具有70%、优选地，90%以上同源性，且编码相同功 能蛋白质的DNA分子。
[0025]在本发明的具体实施方案中，所述⑶K18基因的编码序列是SEQ ID NO. 1所示的 DNA序列。
[0026] 在本发明的上下文中，CDK18基因表达产物包括⑶K18蛋白以及⑶K18蛋白的部分 肽。所述CDK18蛋白的部分肽含有与冠心病相关的功能域。
[0027] "CDK18蛋白"包括⑶K18蛋白以及⑶K18蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物 包括CDK18蛋白保守性变异蛋白质、或其活性片段，或其活性衍生物，等位变异体、天然突变 体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与CDK18的DNA杂交的DNA所编码的蛋白质。
[0028] 优选地，CDK18蛋白是具有下列氣基酸序列的蛋白质：
[0029] (1)由序列表中SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0030] (2)将SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺 失和/或添加且与SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列具有相同功能的由SEQ ID N0.2所示的氨 基酸序列衍生的蛋白质。取代、缺失或者添加的氨基酸的个数通常为1-50个，较佳地1-30 个，更佳地1-20个，最佳地1-10个。
[0031] (3)与SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列具有至少80%同源性(又称为序列同一性）， 更优选地，与SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列至少约90%至95%的同源性，常为96%、97%、 98 %、99 %同源性的氨基酸序列构成的多肽。
[0032]在本发明的具体实施方案中，所述CDK18蛋白是具有SEQ ID N0.2所示的氨基酸序 列的蛋白质。
[0033]通常，已知的是，一个蛋白质中一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能。 本领域技术人员会认可改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸或对氨基酸序列的个别添加、 缺失、插入、替换是保守修饰，其中蛋白质的改变产生具有相似功能的蛋白质。提供功能相 似的氨基酸的保守替换表是本领域公知的。
[0034]通过添加一个氨基酸或多个氨基酸残基修饰的蛋白质的例子是CDK18蛋白的融合 蛋白。对于与CDK18蛋白融合的肽或者蛋白质没有限制，只要所得的融合蛋白保留CDK18蛋 白的生物学活性即可。
[0035]本发明的⑶K18蛋白也包括对SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列的非保守修饰，只要 经过修饰的蛋白质仍然能够保留CDK18蛋白的生物学活性即可。在此类修饰蛋白质中突变 的氨基酸数目通常是10个或者更少，例如6个或者更少，例如3个或者更少。
[0036]在本发明的上下文中，"诊断冠心病"既包括判断受试者是否已经患有冠心病、也 包括判断受试者是否存在患有冠心病的风险。
[0037]本发明的优点和有益效果：
[0038] 本发明首次发现了⑶K18基因表达与冠心病相关，通过检测受试者中⑶K18的表 达，可以判断受试者是否患有冠心病、或者判断受试者是否存在患有冠心病的风险，从而指 导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案。
[0039] 本发明发现了一种新的分子标记物-CDK18基因，相比传统的检测手段，基因诊断 更及时、更特异、更灵敏，能够实现冠心病的早期诊断，从而降低冠心病的死亡率。
【附图说明】
[0040] 图1显示利用QPCR检测CDK18基因在冠心病患者和正常人中的表达差异。
[0041] 具体的实施方式
[0042] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本 发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0043]实施例1筛选冠心病患者和正常人中差异表达的基因 [0044] 1、研究对象：
[0045]收集冠心病患者5例，正常人5例。
[0046] 冠心病组的纳入标准：按照世界卫生组织制定的缺血性心脏病的诊断标准，选择 经冠状动脉造影证实有一支或多支血管狭窄程度2 50%的冠心病患者。对照组的入选标准 为：1)在流行病学调查时筛选年龄、性别、民族均与CAD组相