一种判定萧山鸡中b21血型的方法以及鉴定萧山鸡b21血型的试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及动物育种学、分子遗传学和分子生物学领域。具体涉及一种判定萧山 鸡中B21血型的方法以及鉴定萧山鸡B21血型的试剂盒。
【背景技术】
[0002] 由于B21血型类别与鸡的抗病力、生产性能具有密切联系，在遗传育种工作中具有 较好的参考价值并且已应用于生产实践中。目前，大多数对于家禽血型的确定均采用免疫 学方法。由于鸡血型系统多而复杂、血清中自然抗体弱，不易被检出，且特异性的抗血清制 备技术比较复杂使得一些地方鸡品种的血型难以确定。然而，分子标记技术具有特异性高、 操作相对简单等优势，能解决传统技术上的存在问题，可以实现对血型的快速、准确判定。 应用分子标记进行血型判定将为鸡血型的判定打开一个新局面。由于微卫星DNA具有高度 的个体专一性和多态性，使得微卫星DNA标记技术能有效反映群体内和群体间的遗传变异， 是分析畜禽遗传多样性最理想的分子标记。国外有相关研究表明鸡MHC基因的多态性与血 型有一定的关联，其中B血型由MHC基因的I、IV区共同决定，MHC基因具有丰富的多态性，而 LEI0258是MHC基因上的一个微卫星位点，此微卫星位点在不同鸡种及同一鸡种的不同个体 之间表现出丰富的多态性，利用这一分子标记技术可以更方便快捷的对血型进行判定，而 这一技术也还未得到充分有效的利用。因此我们可以利用LEI0258位点标记对中国地方鸡 种的B类血型进行分型；另外，国内鸡的育种多为现场育种，分子标记技术无法进入现场，目 前，急需一种现场简单的血型判定方法，来提高育种现场中血型分型的准确性和可靠性，从 而加速鸡抗病育种进展。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是运用简单分子标记技术和红血球凝聚反应判定萧山鸡B21血型并 可以运用试剂盒进行快速鉴定。
[0004] 本发明的技术方案是：利用引物设计及微卫星测序技术分析萧山鸡MHC基因的 MHC-IV座位遗传多态性，根据等位基因大小对萧山鸡进行血型分型。首先根据GeneBank中 MHC基因(AL023516)序列，经Primer 3设计特异性较好的PCR引物，进行扩增条件的优化，并 以此为基础设计试剂盒，PCR产物送生物公司进行分型分析。根据微卫星位点LEI0258的重 复序列结构数目的不同对萧山鸡进行血型初步判定，然后通过同种免疫、纯化等步骤制备 B21血型特异性抗体血清，最后根据红血球凝集反应结果迅速判别出B21血型个体。
[0005] -种判定萧山鸡中B21血型的方法，包括以下步骤：以萧山鸡个体DNA作为模板，以 SEQ ID NO. 1和2的序列为引物进行PCR扩增;对扩增产物测序并根据微卫星LEI0258重复序 列结构单元数目对不同萧山鸡个体进行判型，具有1个R13和17个R12重复结构的序列为B21 血型序列 ；确定B21血型个体;所述R13的序列如SEQIDN0.4所示，所述R12的序列如SEQID N0.3所示。
[0006] 为了进一步快速检测，在已确定B21血型个体的情况下，本发明还包括以下步骤： 采集已确定为B21血型个体的血液，通过同种免疫、纯化步骤制备抗B21血清;采用得到的抗 B21血清，根据平板红血球凝集反应方法检测萧山鸡B21血型。
[0007] 所述制备抗B21血清的方法是常规的，例如:采集B21血型个体血液2ml，抗凝处理 后1200RPM离心10分钟，去上清，用roS洗红血球3遍，制成免疫用红血球，采集2ml免疫红血 球注射非B21血型萧山鸡第一受体翅静脉，7天后再以此方法注射1次，13天后采集受体1个 体的抗凝血液6ml，1200RPM离心20分钟，获取上清，初步得到抗B21血清；在群体中采集非 B21血型且与第一受体不同血型的个体血液，与初步得到抗B21血清1:1进行等体积混合，30 度水浴10分钟后，1200RPM离心10分钟后，采集上清，获得纯化的抗B21血清。
[0008] 所述平板红血球凝集反应方法是常规的，例如：采集被检个体新鲜血液，1200RPM 离心10分钟后，去上清，用PBS制成2%的红血球悬液，然后与等体积抗B21血清混合，阴性对 照加入PBS，室温下静止30分钟后观察红血球凝集状态，红血球凝集，下沉程网状，则判定为 阳性，即B21血型;如无凝集，红细胞呈点状分布，则为阴性。
[0009] 本发明还公开了一种鉴定萧山鸡B21血型的试剂盒，该试剂盒包括：
[0010] 1)引物：上游引物量为lyLdOp molAiL)，上游引物序列如SEQ ID N0.1);下游引 物量为lyL(10p molAiL)，下游引物序列SEQ ID N0 2。
[0011] 2)常规PCR试剂（2yL 10XPCR Buffer，1.5yL dNTP(10m mol/L)，0.2yL(5UAiL) Taq酶，13.3yL ddH20)
[0012] 本发明根据微卫星位点LEI0258的重复序列结构数目的不同对萧山鸡进行血型初 步判定，然后通过同种免疫、纯化等步骤制备B21血型特异性抗体血清，最后根据红血球凝 集反应结果迅速判别出B21血型个体。本发明得出判定萧山鸡B21血型的简便方法，具备特 异性高、操作相对简单且重复性高特点，为地方鸡血型的判定提供了技术支撑和应用参考。
【附图说明】
[0013] 图1萧山鸡LEI0258PCR产物电泳图
[0014] 注：图中1，2泳道产物为288bp，对应血型为B5血型；3，4泳道产物为300bp，对应血 型为B10血型；5，6泳道产物为360bp，对应血型为B21血型。
【具体实施方式】
[0015] 1.1采集血样
[0016] 萧山鸡基础群中翅静脉采血2ml，酚/氯仿法提取DNA，-20°C保存备用。
[0017] 1.2引物设计
[0018] 根据GeneBank中MHC基因 (AL023516)序列，经Primer 3设计两对特异性较好的PCR 引物，TE溶解后于4°C保存备用。引物序列分别为：
[0019] 表1微卫星引物信息及最终反应条件
[0020]
[0021] 1.3 PCR扩增和检测
[0022] PCR扩增总体积为20yL:lyL DNA模板（100ng/yL)，2yL 10XPCR Buffer，1.5yL (1犯13(10111111〇1/1)，上下游引物各叫以1(^111〇1/4^)，了39酶为0.24以51]/^〇，(1诎20 13.34匕 PCR扩增程序:95°C预变性5min，94°C变性40s，适宜退火温度40s，72°C延伸40s，35个循环， 最后72°C延伸10min，4°C保存备用。通过琼脂糖凝胶电泳检测，并进行初步判型（图1)。 [0023] 1.4 PCR产物克隆测序
[0024]对扩增的PCR进行TA克隆后送入上海生工生物工程有限公司进行测序。
[0025] 1.5个体基因型的判别
[0026]对得到的PCR产物测序结果进行分析，根据微卫星LEI0258重复序列结构单元数目 以及其他序列信息来对不同个体进行判型，判定规则如下:在LEI0258位点上，检测到介于 182-552bp大小的26个等位基因，序列包含由12bp(下称R12) "AAAGAAGGAAAG"（SEQ ID NO. 3)和13bp (下称）"AAAGAAGACATAG"（ SEQ ID NO. 4) 2种结构组成的复合重复单元，其中 12bp序列的重复单元重复次数在2-20次之间，13bp序列的重复单元重复次数在1-28次之 间。不同鸡种以及同一鸡种不同个体之间，LEI0258微卫星重复序列结构数目及微卫星长度 是不同的，其中B21血型包含1个R13(SEQ ID N0.5中385-387bp)和17个R12(171-374bp)重 复结构（B21血型微卫星LEI0258序列如SEQ ID勵.5，对应的产物是图1中的5、6泳道），810 血型则是由1个R13和12个R12重复结构组成，B5血型由1个R1313bp和11个R12重复结构组 成，等等。因此我们可以根据此微卫星重复序列结构单元数目对萧山鸡群体内的不同个体 进行B血型的判定。
[0027] 1.6同种免疫
[0028] 根据测序分型结果，确定B21血型个体(供体），采集该个体血液2ml，抗凝处理后 1200RPM离心10分钟，去上清，用roS洗红血球3遍，制成免疫用红血球，采集2ml免疫红血球 注射非B21血型萧山鸡个体(受体1)翅静脉，7天后再以此方法注射1次，13天后采集受体1个 体的抗凝血液6ml，1200RPM离心20分钟，获取上清，初步得到抗B21血清。
[0029] 1.7纯化血清
[0030] 在群体中采集非B21血型且与受体1不同血型的个体血液，与初步得到抗B21血清 1:1进行等体积混合，30度水浴10分钟后，1200RPM离心10分钟后，采集上清，获得纯化抗B21 血清。
[0031] 1.8判定血型
[0032]平板红血球凝集试验，采集被检个体新鲜血液，1200RPM离心10分钟后，去上清，用 PBS制成2%的红血球悬液，然后与等体积抗B21血清混合，阴性对照加入roS，室温下静止30 分钟后观察红血球凝集状态，红血球凝集，下沉程网状，则判定为阳性(B21血型），如无凝 集，红细胞呈点状分布，则为阴性。
[0033] 通过微卫星位点MHC-IV (LE10 2 5 8)对萧山鸡进行多样性评估表明萧山鸡在MHC基 因座位上遗传多样性丰富而且均呈现高度多态。其中B21血型个体的免疫性状(H/L比值、血 液中IgM、IgG和IL-Ιβ、IFN- γ含量)均优于其他血型个体。
[0034]因此，本发明中的MHC-IV也可作为地方鸡种血型判定的候选分子标记，从而为家 禽品种资源的正确保存和合理利用增添了新的科学依据。
【主权项】
1. 一种判定萧山鸡中B21血型的方法，其特征在于包括以下步骤：以萧山鸡个体DNA作 为模板，以SEQ ID NO. 1和2的序列为引物进行PCR扩增；对扩增产物测序并根据微卫星 LEI0258重复序列结构单元数目对不同萧山鸡个体进行判型，具有1个R13和17个R12重复结 构的序列为B21血型序列；确定B21血型个体;所述R13的序列如SEQ ID勵.4所示，所述尺12 的序列如SEQ ID NO.3所示。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括以下步骤:采集已确定为B21血型个 体的血液，通过同种免疫、纯化步骤制备抗B21血清;采用得到的抗B21血清，根据平板红血 球凝集反应方法检测萧山鸡B21血型。3. -种鉴定萧山鸡B21血型的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括： 1) 引物:序列如SEQ ID N0.1和2; 2) 常规PCR试剂。
【专利摘要】本发明涉及动物育种学、分子遗传学和分子生物学领域。具体涉及一种判定萧山鸡中B21血型的方法以及鉴定萧山鸡B21血型的试剂盒。该方法是以萧山鸡个体DNA作为模板，以SEQ？ID？NO.1和2的序列为引物进行PCR扩增；对扩增产物测序并根据微卫星LEI0258重复序列结构单元数目对不同萧山鸡个体进行判型。然后通过同种免疫、纯化等步骤制备B21血型特异性抗体血清，最后根据红血球凝集反应结果迅速判别出B21血型个体。本发明具备特异性高、操作相对简单且重复性高特点，为地方鸡血型的判定提供了技术支撑和应用参考。
【IPC分类】C12Q1/68, G01N33/80
【公开号】CN105567858
【申请号】CN201610137476
【发明人】常国斌, 鲁伟, 王洪志, 任立辰, 仇玲玲, 张扬, 陈国宏, 徐琪, 袁青妍, 张康宁, 许盛海
【申请人】扬州大学
【公开日】2016年5月11日
【申请日】2016年3月10日