Top2a基因检测探针及其制备方法和试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术，特别是涉及T0P2A基因检测探针及其制备方法和试剂盒。
【背景技术】
[0002] T0P2A基因是DNA拓扑异构酶IIa(Topoisomerase II alpha，TOPIIc〇的编码基因， DNA拓扑异构酶的生物学作用，一是调节控制DNA的超螺旋状态及打结或解结DNA的环连体 状态，从而间接地影响细胞内核酸代谢过程;二是直接参与那些需打断并重新连接DNA分子 链的细胞过程，DNA的重组、修复、转录及复制过程。存在T0P2A基因异常的患者预后差，无复 发生存期缩短，尤其是T0P2A基因缺失的患者预后更差。基因扩增提示肿瘤有复发的可能， 或者远期的疗效下降。
[0003] 蒽环类药物是乳腺癌术后辅助化疗的基石，研究证实T0P2A基因与蒽环类疗效相 关【Brase，JC，Schmidt，M，Fischbach，T，Sul tmann，H，Bojar，H，Koelbl，H(2010)ERBB2 and T0P2A in breast cancer:a comprehensive analysis of gene amplification，RNA levels，and protein expression and their influence on prognosis and predict ion.Clin Cancer Res 16:pp·2391-2401，Fountzilas，G，Christodoulou，C，Bobos，M， Kotoula，V，Elef theraki，AG，Xanthakis，I (2012)Topoisomerase II alpha gene amplification is a favorable prognostic factor in patients wi th HER2-positive metastatic breast cancer treated with trastuzumab.J Transl Med 10: pp·212，Bartlett J M S，McConkey C C，Munro A F，et al.Predicting Anthracycline Benefit:T0P2A and CEP17一Not Only but Also[J].Journal of Clinical Oncology, 2015:兀0.2013.54.7869.】，1'0?2八基因状态改变与肿瘤复发风险、患者生存相关。
[0004] 因此正确检测和评定乳腺癌的T0P2A状态至关重要J0P2A基因定位于17号染色体 17q21区域，T0P2A的异常情况分为扩增和缺失两种情况，FISH检测可对于这两种情况作出 明确判断。
[0005] 焚光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization FISH)是20世纪80年代末 期在原有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术。目前这 项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、 人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究待许多领域。FISH的基本原理是用已知的标 记核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行异性结合，形成可 被检测的杂交双链核酸。由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以 探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。与传统的放射性标记原位 杂交相比，荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特异性高和可以多重染色等特点，因 此在分子细胞遗传学领域受到普遍关注。
[0006] 杂交所用的探针大致可以分类三类：1)染色体特异重复序列探针，例如α卫星、卫 星III类的探针，其杂交靶位常大于1Mb，不含散在重复序列，与靶位结合紧密，杂交信号强， 易于检测；2)全染色体或染色体区域特异性探针，其由一条染色体或染色体上某一区段上 极端不同的核苷酸片段所组成，可由克隆到噬菌体和质粒中的染色体特异大片段获得;3) 特异性位置探针，由一个或几个克隆序列组成。
[0007] 探针的荧光素标记可以采用直接和间接标记的方法。间接标记是采用生物素标记 DNA探针，杂交之后用藕联有荧光素亲和素或者链霉亲和素进行检测，同时还可以利用亲和 素-生物素-荧光素复合物，将荧光信号进行放大，从而可以检测500bp左右的片段。而直接 标记法是将荧光素直接与探针核苷酸或磷酸戊糖骨架共价结合，或在缺口平移法标记探针 时将荧光素核苷三磷酸掺入。直接标记法在检测时步骤简单，临床使用方便。
[0008] 而目前对于T0P2A基因 FISH方法检测，还缺少特异性高的检测试剂盒。
【发明内容】
[0009]本发明的目的之一是提供一种T0P2A基因检测探针及其制备方法，所制备的探针 可用于检测T0P2A基因状态，即检测T0P2A基因的指拷贝数变化，具有很好的特异性。
[0010] 实现上述目的的技术方案如下。
[0011] -种T0P2A基因检测探针的制备方法，包括以下步骤：
[0012] (1)选取BAC克隆为1^11-1152六10、(^0-321705中至少一种，或选取从(：克隆为 1^11-73706、01)-3087022、1^11-48010、01)-21341(5中的至少一种 ；
[0013] (2)对克隆分别提取质粒，得到质粒DNA，定量；
[0014] (3)用荧光素标记质粒DNA，不同来源的质粒DNA所标记的荧光素相同，即得。
[0015] 在其中一个实施例中，所述BAC克隆为RP11-1152A10和CTD-3217C5。
[0016] 在其中一个实施例中，所述BAC克隆为RPll-737D6、CTD-3087022、RPll-48010jP CTD-2134K5。
[0017] 在其中一个实施例中，标记荧光素选择本领域已知的荧光染料，优选地，荧光素为 ΛI exa FI uor?488、F I T C、Λ1 exa FI uor?555、Rh〇damine、Texas Red、 pacific blue?、DEAC。
[0018] 在其中一个实施例中，基因探针的标记可以采用现有技术中的方法将相应荧光素 标记至双链核酸上，所述方法包括但不限于：随机引物法、切口平移等，标记基因探针可以 使用市售的缺口平移标记试剂盒和/或随机引物标记试剂盒，优选abbott和/或Roche公司 的Nick Translation Kit。本发明步骤(3)优选采用随机引物法、切口平移法对质粒DNA进 行荧光素标记。
[0019] 在其中一个实施例中，所述标记的温度为24°C_26°C，标记的时间为4-6小时。
[0020] 本发明的另一目的是提供一种T0P2A基因检测试剂盒。
[0021] 实现该目的技术方案如下。
[0022] 一种T0P2A基因检测试剂盒，包括有上述T0P2A基因检测探针。
[0023] 在其中一个实施例中，包括有用于内控的17号染色体鉴别探针(CSP17)探针，该鉴 别探针与T0P2A基因检测探针标记的荧光素的颜色不相同。
[0024] 在其中一个实施例中，还包括有用于封闭重复序列的COT Human DNA，和DAPI复染 剂。
[0025]本发明具有以下有益效果：
[0026] 1 .本发明通过筛选到最优的T0P2A基因检测探针及其组合，采用FISH (Fluorescence In-Situ Hybridization)方法对T0P2A基因拷贝数检测，
[0027] 2.本发明优选克隆检测特异性好，灵敏度高。并通过调整标记温度和时间，限制长 度探针为500bp左右，提高杂交效率和降低杂交背景。
[0028] 3.信号计数行准确、快速，且结果的重复性好;补充了临床中T0P2A突变检测的不 足，有利于筛选更多受益于靶向药物的患者，提高乳腺癌患者生存率和总生存期。
[0029] 4.通过本发明所述的T0P2A试剂盒，从基因水平了解T0P2A状态改变，多种信号类 型表现出实体组织的肿瘤细胞遗传多样性，可以实现在肿瘤生物学、细胞遗传学等领域的 应用，有助综合评价各分子标志物，辅助乳腺癌临床靶向治疗用药及治疗方案选择。
【附图说明】
[0030]图1为是实施例1中检测探针序列的示意图。
[0031 ]图2为实施例1中人外周血培养细胞片FISH检测结果图。
[0032]图3为实施例4中乳腺癌