行杂交，需注意温度准确及保持杂 交湿度）。
[0090] 3、杂交后洗涤及复染(避光操作）
[0091] 3.1洗涤前30分钟，将配制好的洗液I，洗液II，放入37± 1°C的水浴中，测量以确保 温度合适；
[0092] 3.2关闭杂交仪电源，将玻片取出，轻轻撕去橡皮胶，移去盖玻片(若盖玻片难以去 除，可以将其放入洗液I中微微摇晃，以利于其脱落；
[0093] 3 · 3玻片放入37 ± 1°C洗液I (2 X SSC)中10分钟；
[0094] 3.4取出玻片，再将其放入37 ± 1°C洗液11(0.1 %NP-40/2 X SSC)中5分钟；
[0095] 3.5取出玻片，室温70%乙醇中3分钟；
[0096] 3.6取出玻片，暗处自然干燥玻片；
[0097] 3.7室温，滴加10μ1 DAPI复染剂到22 X 22mm的盖玻片，载玻片目标区域朝下，轻放 于盖玻片上，轻压，避免产生气泡，在暗处存放，待观察。
[0098]上述所列举试剂均在圆形染色缸中配制(每种试剂体积均为40ml)，每个染色缸最 多可放入5片切片。非室温溶液，在操作开始前需提前预热反应试剂至指定温度。在洗涤过 程中，可间隔2~3分钟轻轻晃动染色缸，提高洗涤效果。
[0099] 4、结果分析
[0100] 相关荧光和DAPI需用合适的滤块观察。其中，CSP17探针显示绿色信号;GSP T0P2A 探针为红色信号。
[0101] 4.1使用合适的滤镜，在40 X物镜下寻找，在100 X物镜下计数；
[0102] 4.2调整合适的焦距，对信号和背景有明确的概念;信号点因位于细胞内；当细胞 外存在荧光信号点时，要注意与细胞内信号点区分，最好能避开该区域进行计数；
[0103] 4.3扫视几个肿瘤细胞区域，选择至少4个有很好核分界的区域，要求细胞核边界 完整，DAPI染色均匀、核无重叠，CSP17探针(绿色信号点)信号清晰；
[0104] 4.4从选择区域的左上角开始分析，从左到右扫视，观察多个视野；
[0105] 4.5组织计数的要求：
[0106] a.只计数肿瘤组织(在FISH检测前，使用HE染色片进行对照观察）
[0107] b.避免在坏死区域及核边界不清的区域计数
[0108] c.需要主观辨别的核不计数
[0109] d.跳过信号弱及没有特定信号或高背景的核计数；
[0110] 4.6转至100X物镜，调整焦距，在核的不同层次找到所有信号点；
[0111] 4.7在每个核内计数信号点；调焦找到每个核内的所有信号点，计数一个区域内的 两种信号，只计数每种颜色有1个或更多FISH信号的，没有信号或只有一种颜色信号的核不 计数;记录观察到的细胞总数(信号正常及异常）；
[0112] 4.8计数方法
[0113] 在5个清晰的肿瘤区域，共计数40~100个肿瘤细胞核内GSP T0P2A(红色)和CSP17 (绿色)信号，分别计数单个细胞核内GSP T0P2A和CSP 17的信号数。
[0114] 实施例4:T0P2A基因检测试剂盒临床使用评价
[0115] 使用实施例1所述两组检测探针，实施例2所述检测试剂盒对20份临床样本(其经 过病理检测确诊，具体见下表），进行检测。根据实施例3的检测方法重复检测3次，结果相 符，检测结果的重复性好;两种探针组合的检测一致性佳。与市售商品化试剂比较，检测结 果完全一致，试剂的特异性和灵敏度高。图3和图4为探针组1的检测结果图。探针组2的结果 与探针组1的结果相同，图省略。图3为阴性样本检测结果，典型信号类型为2R2G，结果判断 为T0P2A基因未发生扩增；图4为阳性样本检测结果，信号类型为2~6R/2G，结果判断为 T0P2A基因扩增。图中的红色信号示GSP T0P2A，绿色信号示CSP 17(用于定位17号染色体着 丝粒探针）。
[0116]
[0117]
[0118] 本发明中，分别各使用T0P2A基因中的一种探针也能实现相应的检测，具体结果省 略，但相对探针组合使用而言，组合探针的使用，检测信号会更好。理论上探针长度越长，实 际检测时获得的荧光信号亮度越明亮，但因为可能涉及到更多基因序列，所得到的信号复 杂性可能性增多，对检测实现的难度也增强。本发明所述针对T0P2A基因的组1和组2的检测 探针的BAC克隆总长度分别为：353Kb和576Kb，均为包含T0P2A基因及其两端序列的核酸混 合物。
[0119] 发明人在对本发明所述探针验证中发现，较长的检测探针确实获得更强的荧光信 号，并且在对临床样本的检测验证中也获得了相同的结果。因此，在荧光探针的设计中，可 以通过适当延长荧光探针长度增加信号亮度，但具体如何组合使用，存在的一定的技术困 难，要实现很好的检测结果，除了设计中的经验之外，还需通过临床样本验证评估信号类型 差异。
[0120]所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例 中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛 盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0121 ]以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并 不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来 说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护 范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
【主权项】
1. 一种T0P2A基因检测探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 选取从(：克隆为1^11-1152410、(^)-321705中至少一种，或选取从(：克隆为1^11-73706、01)-3087022、1^11-48010、01)-21341(5中的至少一种 ； (2) 对BAC克隆分别提取质粒，得到质粒DNA，定量； (3) 用荧光素标记质粒DNA，不同来源的质粒DNA所标记的荧光素相同，即得。2. 根据权利要求1所述T0P2A基因检测探针的制备方法，其特征在于，所述MC克隆为 RPl 1-1152A10、和 CTD-3217C5;或所述 BAC 克隆为 RPl 1-737D6、CTD-3087022、RP11-48010、和 CTD-2134K5。3. 根据权利要求1所述T0P2A基因检测探针的制备方法，其特征在于，所述荧光素为 Alexa Fluor?488.、FITC、Alexa FI u〇r?555、Rhodamine、Texas RecUpacific blue?、或 DEACo4. 根据权利要求1-3任一项所述T0P2A基因检测探针的制备方法，其特征在于，步骤(3) 采用随机引物法或切口平移法对质粒DNA进行荧光素标记。5. 根据权利要求4所述T0P2A基因检测探针的制备方法，其特征在于，所述标记的温度 为24°C_26°C，时间为4-6小时。6. 根据权利要求1-5任一项所述的制备方法得到的T0P2A基因检测探针。7. -种T0P2A基因检测试剂盒，其特征在于，包括有权利要求6所述的T0P2A基因检测探 针。8. 根据权利要求7所述T0P2A基因检测试剂盒，其特征在于，还包括有用于内控的17号 染色体鉴别探针，该鉴别探针与T0P2A基因检测探针标记的荧光素的颜色不相同。9. 根据权利要求7或8所述T0P2A基因检测试剂盒，其特征在于，还包括有用于封闭重复 序列的COT Human DNA，和DAPI复染剂。
【专利摘要】本发明涉及TOP2A基因检测探针及其制备方法，该方法包括以下步骤：选取BAC克隆为RP11-1152A10、CTD-3217C5中至少一种，或选取BAC克隆为RP11-737D6、CTD-3087O22、RP11-48O10、CTD-2134K5中的至少一种，对克隆分别提取质粒提取，得到质粒DNA，定量；用荧光素标记。本发明还公开了包含有TOP2A基因检测探针的试剂盒。本发明通过筛选到最优的TOP2A检测探针，信号计数行准确、快速，且结果的重复性好；补充了临床中TOP2A突变检测的不足，有利于筛选更多受益于靶向药物的患者，提高患者生存率和总生存期。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105483255
【申请号】CN201511030984
【发明人】陈绍宇, 何瑰, 席影
【申请人】广州安必平医药科技股份有限公司
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2015年12月30日