Bcr基因和abl基因检测探针及其制备方法和试剂盒的制作方法
【技术领域】
[00011本发明属于生物技术，特别是涉及BCR基因和ABL基因检测探针及其制备方法和试 剂盒。
【背景技术】
[0002] 慢性粒细胞白血病（chronic myelogenous leukemia,CML)是一种起源于造血干 细胞的克隆性骨髓增殖性肿瘤，主要累及粒细胞系，表现为持续、进行性外周血白细胞数量 增加。CML起病缓慢，初期症状不明显。其自然病程是由慢性期进展为加速期，最后发展为急 变期，急变后患者常在3~5个月内死亡。
[0003] 90%以上患者白血病细胞中有恒定的、特征性的Ph染色体及其分子标志BCR/ABL 融合基因。Ph染色体绝大多数为以9;22)^34^11)典型易位，少数患者有变异易位，包括22 号染色体与非9号染色体间简单变异易位，3条或更多条染色体间的复杂易位(隐匿易位）。 Ph染色体存在于CML的整个病程中，治疗缓解后，仍持续存在，因此采用骨髓移植，消除Ph阳 性克隆，才能达到最终治愈。
[0004] 因此，通过对初诊患者进行BCR/ABL检测，可以诊断CML，进行酪氨酸激酶抑制剂受 益人群筛查。
[0005] 焚光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization FISH)是20世纪80年代末 期在原有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术。目前这 项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、 人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究待许多领域。FISH的基本原理是用已知的标 记核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行异性结合，形成可 被检测的杂交双链核酸。由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以 探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。与传统的放射性标记原位 杂交相比，荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特异性高和可以多重染色等特点，因 此在分子细胞遗传学领域受到普遍关注。
[0006] 杂交所用的探针大致可以分类三类：1)染色体特异重复序列探针，例如α卫星、卫 星III类的探针，其杂交靶位常大于1Mb，不含散在重复序列，与靶位结合紧密，杂交信号强， 易于检测；2)全染色体或染色体区域特异性探针，其由一条染色体或染色体上某一区段上 极端不同的核苷酸片段所组成，可由克隆到噬菌体和质粒中的染色体特异大片段获得;3) 特异性位置探针，由一个或几个克隆序列组成。
[0007]探针的荧光素标记可以采用直接和间接标记的方法。间接标记是采用生物素标记 DNA探针，杂交之后用藕联有荧光素亲和素或者链霉亲和素进行检测，同时还可以利用亲和 素-生物素-荧光素复合物，将荧光信号进行放大，从而可以检测500bp左右的片段。而直接 标记法是将荧光素直接与探针核苷酸或磷酸戊糖骨架共价结合，或在缺口平移法标记探针 时将荧光素核苷三磷酸掺入。直接标记法在检测时步骤简单，临床使用方便。
[0008]而目前对于BCR/ABL基因 FISH检测，还缺少特异性高的检测试剂盒。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的之一是提供一种BCR基因和ABL基因检测探针及其制备方法，所制备 的探针可用于检测BCR基因和ABL基因状态，即检测BCR基因和ABL基因检测，检测的融合类 型包括典型易位、变异易位和隐匿易位，具有很好的特异性。
[0010] 实现上述目的的技术方案如下。
[0011] -种BCR基因和ABL基因检测探针的制备方法，包括以下步骤：
[0012] (1)选取针对 BCR 基因的 BAC 克隆为 RP11-1026A5、RP11-165G5、CTD-2079I4 中至少 一种，和选取BAC克隆为CTD-2302P22、CTD-2037J11、CTD-2509L4中的至少一种；和选取针对 ABL 基因的 BAC 克隆为 01)-20371^19、1^11-21610、01)-2526620中至少一种；
[0013] (2)对克隆分别提取质粒，得到质粒DNA，定量；
[0014] (3)用荧光素标记质粒DNA，针对BCR基因和针对ABL基因的检测探针标记的荧光素 的颜色不相同，且针对BCR基因中，来源于BAC克隆RP11-1026A5、RP11-165G5、CTD-2079I4的 探针与来源于BAC克隆CTD-2302P22、CTD-2037J11、CTD-2509L4的探针的荧光素的颜色不相 同，即得。
[0015] 在其中一个实施例中，针对ABL基因的所述BAC克隆为CTD-2037L19、RP11-21G10、 和CTD-2526G20。
[0016] 在其中一个实施例中，针对BCR基因的BAC克隆为RP11-1026A5、RP11-165G5、和 CTD-2079I4,和 BAC 克隆为 CTD-2302P22、CTD-2037JlUPCTD-2509L4。
[0017] 在其中一个实施例中，标记荧光素选择本领域已知的荧光染料，优选地，荧光素为 AlexaF]U〇r?488、FITC、AlexaFlu〇l'(§)555、Rhodamine、Texas Red、pacific blue?、DEAC〇
[0018] 在其中一个实施例中，基因探针的标记可以采用现有技术中的方法将相应荧光素 标记至双链核酸上，所述方法包括但不限于：随机引物法、切口平移等，标记基因探针可以 使用市售的缺口平移标记试剂盒和随机引物标记试剂盒，优选abbott和Roche公司的Nick Translation Kit。本发明步骤(3)优选采用随机引物法、切口平移法对质粒DNA进行焚光素 记 D
[0019] 在其中一个实施例中，所述标记的温度为15°c-l8°C，标记的时间为8-12小时。
[0020] 本发明的另一目的是提供一种BCR基因和ABL基因检测试剂盒。
[0021] 实现该目的技术方案如下。
[0022] 一种BCR基因和ABL基因检测试剂盒，包括有上述BCR基因和ABL基因检测探针。 [0023] 在其中一个实施例中，还包括有用于封闭重复序列的COT Human DNA，和DAPI复染 剂。
[0024]本发明具有以下有益效果：
[0025] 1.本发明通过筛选到最优的BCR基因和ABL基因检测探针及其组合，采用FISH (Fluorescence In-Situ Hybridization)方法实现对已知或未知类型的BCR/ABL融合基因 检测;可实现对BCR断裂类型的鉴定。
[0026] 2.通过本发明所述的检测探针进行准确、快速的信号计数、且结果重复性好;通过 FISH方法对BCR/ABL融合检测，补充了临床中BCR/ABL融合检测的不足，有利于准确确诊 CML，提高患者生存率和总生存期。
[0027] 3.本发明优选克隆检测特异性好，灵敏度高。通过对大片段重排的直观检测，不易 遗漏复杂变异类型，对未知融合类型也有很好的鉴别性。
[0028] 4.通过本发明所述的BCR基因和ABL试剂盒，实现在肿瘤生物学、细胞遗传学等领 域的应用，有助综合评价各分子标志物，辅助临床靶向治疗用药及治疗方案选择。
【附图说明】
[0029]图1A为是实施例1中ABL基因检测探针序列的示意图。
[0030]图1B为是实施例1中BCR基因检测探针序列的不意图。
[0031 ]图2为实施例1中人外周血培养细胞片BCR基因和ABL基因检测探针FISH检测结果 图。
[0032] 图3为实施例4中临床骨髓样本FISH检测结果图，结果显示2R2GA，未见BCR/ABL融 合。
[0033] 图4为实施例4中临床骨髓样本FISH检测结果图，结果显示1R1GA/1RG1RA，发现 BCR/ABL 融合。
[0034] 图5为实施例4中临床骨髓样本FISH检测结果图，结果显示1R1GA/1RG1RGA，BCR/ ABL基因融合，且为次要断裂类型。
【具体实施方式】
[0035]为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不 同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本 发明的公开内容的理解更加透彻全面。
[0036 ]下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等 人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所 述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售 产品。
[0037]除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域 的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实 施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语"和/或"包括一个或多个相关的所列 项目的任意的和所有的组合。
[0038] 实施例1 BCR基因和ABL基因检测探针的制备
[0039]所述ABL检测探针(GSP ABL)的制备方法，包括以下步骤：
[0040]克隆筛选:挑选包含目的基因 ABL及两端序列的克隆，如图1A所示。
[0041] GSP ABL1包括第一探针、第二探针、第三探针、第四探针、第五探针，可以是其中的 一个、几个，或者是多个组合。
[0042] 本实施例选择5种探针的组合，具体如下表，其购买于Invitrogen RP11BAC及CTD BAC克隆库。
[0043] ABL1 基因 chr9:133，589，268-133，763，062，173，795bp
[0044]
[0045]所述BCR检测探针(GSP BCR)的制备方法，包括以下步骤：
[0046] 克隆筛选:挑选包含目的基因 BCR Μ-BCR位点外的两端序列的克隆制备GSP BCR探 针，如图1B所示。GSP BCR包括两组探针，这两组探针分别位于BCR主要断裂点的3'端和5' 端。
[0047] BCR 基因 chr22:23，522，552-23，660，224，137，673bp
[0048]
[0051 ] (2)GSP BCR和GSPABL基因检测探针制备：使用Qiagen公司的Plasmid Maxi Kit， 按照说明书要求的操作方法对不同BAC克隆分别进行超低拷贝质粒DNA提取，通过测定 260nm和280nm处的吸光度对质粒DNA定量;采用高压灭菌的超纯水稀释为200ng/ul，采用 1.5ml的离心管分装，最后将得到的对应BCR基因或ABL基因的3种或5种相应组合的质粒DNA 混合，-20°C密封保存。
[0052] (3)通过切口平移方法对质粒DNA混合物进行荧光标记，针对GSP BCR基因的组2探 针标记的荧光素为green-dUTP，组3探针标记的荧光素 Aqua-dUTP，针对GSP ABL基因每种探 针标记的焚光素为:red-dUTP。采用abbott的Nick Translation Kit，按如下方案，严格避光 条件下在冰上配制PCR反应体系。
[0053]
[0054] 配完后震荡混匀，在16UC标记10小时，再80UC孵育10分钟灭活酶。取5ul使用2%琼 脂糖凝胶做电泳，分别在50-500bp左右存在弥散的条带。
[0055] 对标记产物进行乙醇沉淀和浓缩，按如下方案在1.5ml离心管中依次加入醋酸钠 和无水乙醇，避光、冰上配制：
[0056] 标记产物 45ul
[0057] 醋酸钠（3mol/L) 5ul
[0058] 无水乙醇 125ul
[0059] 混匀后置于-70°C冰箱中至少2小时，4°C13000rpm离心