30分钟，小心去上清，勿搅 动沉淀，加入lml的70%乙醇，4°C13000转/分钟离心15分钟，小心去上清，勿搅动沉淀，避光 干燥。使用1 u 1纯化水溶解沉淀，获得GSP BCR和GSPABL基因探针，避光、-20°C储存。
[0060] 4.GSP BCR和GSPABL基因探针验证:分别使用ABL探针组1+BCR探针组2+BCR探针组 3制备的杂交液，使用人类正常分裂中期淋巴细胞滴片进行探针验证(检测方法参考实施例 3)。培养细胞包含中期或间期染色体DNA，荧光原位杂交时，染色体DNA表现为形态上可识别 的染色体或是细胞核。如图2(应用于探针组1+探针组2+探针组3的实验结果)所示：中期染 色体的FISH杂交结果图。图中可见BCR/ABL融合基因检测探针信号明亮，人外周血培养细胞 片中在中期染色体上可观察到灵敏度、特异性100%;使用骨髓样本片进行杂交检测，可以 清楚的记录BCR和AB合基因信号情况。红色信号表示GSPABL1，绿色信号和青色信号分别表 示GSP BCR主要断裂点两端探针。
[0061] 实施例2:BCR基因和ABL基因检测试剂盒制备方法
[0062] BCR基因和ABL基因检测试剂盒包括有BCR/ABL杂交液和DAPI复染剂两个组分，其 中BCR和ABL杂交液包含实施例1所述的一组GSPABL基因探针和两组GSP BCR基因探针的组 合。BCR基因有两组检测探针，ABL基因有一组检测探针，本实施例中，所述BCR基因和ABL基 因检测试剂盒，为:BCR(组2+组3)+ABL(组1)的组合、用于杂交环境(促进杂交）的缓冲液组 分、封闭重复序列的COT Human DNA等DAPI复染剂主要用于杂交后的细胞复染，其中的DAPI 会与DNA结合，使得细胞核显示出蓝色荧光，含有对苯二胺的复染剂可以保持荧光的稳定。 [0063] 具体配方如下：
[0064] (1)杂交液配制
[0065]
[0066] (2)DAPI复染剂配制
[0067] 10mg的对苯二胺溶于lml的PBS中，调节pH为9 · 0，加入9ml甘油，反复震荡混匀，-20 °C储存。取2.5μ1的DAPI溶液(0. lmg/ml)溶于lml抗褪色液中，避光条件下反复震荡混匀，-20°C避光密闭保存。
[0068] (3)成品组装
[0069]
[0070]实施例3:BCR基因和ABL基因检测试剂盒的检测方法 [0071] 1、样品处理
[0072] 1.1取待检测外周血或骨髓2~3ml(肝素钠抗凝)2000rpm离心5min，小心去上清。
[0073] 1.2加入10ml的低渗液(0.075mol/L KC1)，吹打混匀，静置3min。
[0074] 1.3 37±1°C水浴箱低渗30min。
[0075] 1.4加新鲜固定液lml，吹打混勾，室温预固定lOmin。
[0076] 1 · 5吹打混勾，2000rpm 离心5min。
[0077] 1 · 6去上清，沉淀加新鲜固定液5~10ml，吹打混匀，室温静置lOmin。
[0078] 1.7 2000rpm离心5min，去上清。
[0079] 1.8可重复以上洗涤步骤，直至细胞沉淀洗白洗干净（此步骤不需室温静置 lOmin)〇
[0080] 2、制片
[00811 2.1取一张干净的载玻片；
[0082] 2.2重悬细胞后取3μ1悬液滴加到载玻片上；
[0083] 2.3室温下晾干；
[0084] 2.4用10 X物镜在相差显微镜下观察细胞密度，要求细胞无重叠，且单视野细胞数 量在100~200个为宜。
[0085] 3、玻片预处理
[0086] 3.1将滴好的玻片置于室温2 X SSC(PH7.0)溶液中浸泡2min;
[0087] 3.2依次在室温70 %，90%，100%的乙醇中浸泡2min脱水;然后取出玻片，室温晾 干。
[0088] 4、样品和探针同时变性
[0089] 4.1加10μ1的杂交液到杂交区域，迅速盖上18 X 18mm盖玻片，轻压使杂交液均匀分 布，避免产生气泡；
[0090] 4.2用橡皮胶沿盖玻片边缘封片，完全覆盖盖玻片和载玻片接触的部位；
[0091 ] 4.3将玻片放入杂交仪中，湿润原位杂交仪湿度条，插入湿条，盖上杂交仪上盖，设 置"Denat&Hyb"程序，变性78°C2分钟，杂交37°C10~18小时。
[0092] 5、杂交后洗涤及复染
[0093] 5 · 1玻片放入72± 1°C 洗液1( 1 X SSC/0 · 3%NP-40)中 2 分钟；
[0094] 5.2取出玻片，再将其放入室温洗液11(0.1 %NP-40/2 X SSC)中30秒；
[0095] 5.3取出玻片，再将其放入室温70%，90%，100%乙醇中各2分钟；
[0096] 5.4取出玻片，暗处自然干燥玻片；
[0097] 5.5滴加1(^10六?1复染剂，待观察。
[0098] 6、结果分析
[0099] 相关荧光和DAPI需用合适的滤块观察。计数50~200个细胞，出现RG融合、RA融合、 RGA融合信号的细胞记为异常细胞；出现2R2GA信号类型的细胞记为正常细胞。
[0100]实施例4:BCR基因和ABL基因检测试剂盒临床使用评价
[0101]使用实施例1所述BCR基因和ABL基因检测探针组合，实施例2所述检测试剂盒(ABL (组1 )+BCR(组2) +BCR(组3)的组合、对20份临床样本(其经过病理检测确诊，具体见下表）， 分别进行检测。两种探针组合的实验重复三次，检测结果相同，检测一致性佳。与市售商品 化试剂比较，检测结果完全一致，试剂的特异性和灵敏度高。图3和图4为组合试剂盒检测结 果，图3中所示，信号类型表现为1R2GA，与正常信号2R2GA比较，出现R信号缺失，所以，结果 判断为ABL基因缺失，未发生BCR/ABL基因融合；图4中所示，信号类型表现为1R1GA/1RG1RA， 与正常信号2R2GA比较，出现了GA信号断裂，R信号断裂，并同时发生了GR，AR信号融合，所 以，结果判断为BCR/ABL基因融合，且为主要断裂类型。图5中所示，信号类型表现为1R1GA/ 1RG1RGA，与正常信号2R2GA比较，出现了G信号断裂，R信号断裂，并同时发生了GR，GAR信号 融合，所以，结果判断为BCR/ABL基因融合，且为次要断裂类型。
[0102] 本发明中，针对ABL基因和BCR基因，分别使用三组探针实现了断裂点、融合类型的 检测。但相对探针组合使用而言，组合克隆探针的使用，检测信号会更好。理论上探针长度 越长，实际检测时获得的荧光信号亮度越明亮，但因为可能涉及到更多基因序列，所得到的 信号复杂性可能性增多，对检测实现的难度也增强。本发明所述针对ABL1基因的探针组1、 BCR基因的探针组2和BCR基因的探针组3的检测探针的BAC克隆其长度分别为:796Kb、318Kb 和495Kb。
[0103] 发明人在对本发明所述探针验证中发现，较长的检测探针确实获得更强的荧光信 号，并且在对临床样本的检测验证中也获得了相同的结果。因此，在荧光探针的设计中，可 以通过适当延长荧光探针长度增加信号亮度，但具体如何组合使用，存在的一定的技术困 难，要实现很好的检测结果，除了设计中的经验之外，还需通过临床样本验证评估信号类型 差异。
[0104]
[0106] 从上述实验检测结果知，在对这些样本进行分子标志物检测后，可以据检测结果 对样本进行分子分型，依据检测指标的意义，用于临床治疗方案制定、用药选择和疗效判 断。
[0107] 所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例 中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛 盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0108] 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并 不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来 说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护 范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
【主权项】
1. 一种BCR基因和ABL基因检测探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 选取针对 BCR 基因的 BAC 克隆为 RP11-1026A5、RP11-165G5、CTD-2079I4中至少一种， 和选取BAC克隆为CTD-2302P22、CTD-2037J11、CTD-2509L4中的至少一种;和选取针对ABL基 因的 BAC 克隆为 01)-20371^19、1^11-21610、01)-2526620中至少一种； (2) 对克隆分别提取质粒，得到质粒DNA，定量； (3) 用荧光素标记质粒DNA，针对BCR基因和针对ABL基因的质粒DNA标记的荧光素的颜 色不相同，且针对BCR基因中，来源于BAC克隆RP11-1026A5、RP11-165G5、CTD-2079I4的质粒 DNA与来源于BAC克隆CTD-2302P22、CTD-2037J11、CTD-2509L4的质粒DNA的荧光素的颜色不 相同，即得。2. 根据权利要求1所述的BCR基因和ABL基因检测探针的制备方法，其特征在于，针对 ABL 基因的所述 BAC 克隆为 CTD-2037L19、RP11-21G10JPCTD-2526G20。3. 根据权利要求1所述的BCR基因和ABL基因检测探针的制备方法，其特征在于，针对 BCR基因的 BAC 克隆为 RP11-1026A5、RP11-165G5、和CTD-2079I4，和为BAC克隆为CTD-2302P22、CTD-2037J11、和CTD-2509L4。4. 根据权利要求1所述的BCR基因和ABL基因检测探针的制备方法，其特征在于，所述荧 光素为 Alexa Flu〇r?488、F I T C、Alextl F丨U01'?555、Rhodamine、Texas Red、 pacific blue?.、或DEACο5. 根据权利要求1-4任一项所述BCR基因和ABL基因检测探针的制备方法，其特征在于， 步骤(3)采用随机引物法或切口平移法对质粒DNA进行荧光素标记，所述标记的温度为15 °C_18°C，标记的时间为8-12小时。6. 根据权利要求1-5任一项所述的制备方法得到的BCR基因和ABL基因检测探针。7. -种BCR基因和ABL基因检测试剂盒，其特征在于，包括有权利要求6所述的BCR基因 和ABL基因检测探针。8. 根据权利要求7所述的BCR基因和ABL基因检测试剂盒，其特征在于，还包括有用于封 闭重复序列的COT Human DNA，和DAPI复染剂。
【专利摘要】本发明涉及BCR基因和ABL基因检测探针及其制备方法，该方法包括以下步骤：选取针对BCR基因的BAC克隆为RP11-1026A5、RP11-165G5、CTD-2079I4中至少一种，和选取BAC克隆为CTD-2302P22、CTD-2037J11、CTD-2509L4中的至少一种；和选取针对ABL基因的BAC克隆为CTD-2037L19、RP11-21G10、CTD-2526G20中至少一种；得到质粒DNA；标记。本发明还公开了包含有BCR基因和ABL基因检测探针的试剂盒。本发明通过筛选到最优的BCR基因和ABL检测探针，信号计数行准确、快速，且结果的重复性好。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105483256
【申请号】CN201511033447
【发明人】何瑰, 陈绍宇, 张会清
【申请人】广州安必平医药科技股份有限公司
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2015年12月30日