一种基于leap-2基因判断云南地方鸡抗病能力强弱的方法
【技术领域】
[0001 ]本发明属于动物分子育种的基因工程技术领域，具体涉及一种基于LEAP-2基因判 断云南地方鸡抗病能力强弱的方法。
【背景技术】
[0002] 免疫抗病研究是现代家禽育种研究的一大热点。家禽的品种、养殖环境、饲料等都 会在实际生产过程中对禽类的抗病力产生影响，但禽类机体自身固有免疫代谢能力在机体 抗病效应中的表现中有着举足轻重的地位。所以，准确认识动物机体免疫器官在不同时间 阶段免疫相关基因的表达特性，是免疫抗病研究的基础。
[0003] 抗菌肽是生物体产生的一种具有抗菌活性的多肽，是机体先天免疫系统中防御病 菌入侵的重要成分。Π 型肝表达抗菌肽(Liver expressed antimicrobial peptide 2， LEAP-2)是近年来在脊椎动物中发现的一种新型抗菌肽，其氨基酸序列、二级结构及表达模 式等与已知肽类均不相同，并具有较强的抗微生物活性。LEAP-2基因编码94个氨基酸残基 组成的多肽;氨基端的信号肽由28个残基组成，成熟肽含有41个残基。人LEAP-2基因包含3 个外显子和2个内含子，只有1个拷贝。通过放射性杂交作图发现LEAP-2基因位于5号染色体 的长臂3区1带，编码77个氨基酸残基组成的前体蛋白质，多分布于肝脏。鼠类LEAP-2基因也 是由3个外显子和2个内含子组成的。Northern印迹分析确认肝和小肠是鼠表达LEAP-2的主 要器官。在鸡体内分离得到的LEAP-2是首次发现于非哺乳动物的LEAP-2，它含有76个氨基 酸残基，与人的LEAP-2序列有59%同源性，C端含有2对二硫键，该基因位于第13号染色体， 有3个外显子和2个内含子。LEAP-2作为抗菌肽的一种，对保护禽类免受微生物影响具有重 要作用，它能通过破坏细胞膜，干扰代谢等方式杀死细菌、真菌、寄生虫、病毒等，并在先天 性免疫中通过调节趋化因子和细胞因子的活性发挥作用。
【发明内容】
[0004] 本发明提供一种基于LEAP-2基因判断云南地方鸡抗病能力强弱的方法，采用分子 生物学技术和生物信息学分析方法，在对云南地方鸡LEAP-2基因 mRNA表达量的研究中发现 LEAP-2基因与免疫功能相关，通过云南地方鸡LEAP-2基因 mRNA在云南地方鸡的肝脏、脾脏、 胸腺、法氏囊四个组织中的表达量，判断云南地方鸡免疫机能的强弱，在肝脏、脾脏、胸腺、 法氏囊四个组织中的表达量高的云南地方鸡不容易遭受环境变化和被病原微生物感染，在 肝脏、脾脏、胸腺、法氏囊四个组织中的表达量高的云南地方鸡免疫机能较强。
[0005] 为了达到上述目的，本发明提出如下技术方案：
[0006] 所述的基于LEAP-2基因判断云南地方鸡抗病能力强弱的方法包括以下具体步骤 为：
[0007] 1)RNA 的提取
[0008] ①选取同一批次出壳的四个品种(武定鸡、盐津乌骨鸡、茶花鸡、大围山微型鸡)健 康鸡只120只进行隔离饲养，分别于4、8、12周龄屠宰，采集各个鸡只的肝脏、脾脏、胸腺、法 氏囊组织，将采集的组织进行低温冷冻，将低温冻结的组织样品称量后转移至用液氮预冷 的研钵中，用研件研磨组织，其间不断加入液氮，直至研磨成粉末状;加入lml RNAiso Plus (宝生物公司）。
[0009] ②将匀浆液转移至离心管中；
[0010] ③向匀浆裂解液中加入RNAiso Plus体积量1/5的氯仿，紧盖离心管盖，混合至溶 液乳化呈乳白色；
[0011] ④室温静置5分钟；
[0012]⑤在4°C条件下离心15分钟，从离心机中取出离心管，此时勾衆液分为三层，即：无 色的上清液(含RNA)、中间的白色蛋白层(大部分为DNA)及带有颜色的下层有机相；
[0013] ⑥吸取上清液转移至另一个离心管中，向上清液中加入0.5-1倍RNAiso Plus体积 的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，室温下静置10分钟；
[0014] ⑦4°C条件下离心10分钟；
[0015] 2)RNA沉淀的清洗
[0016]弃去上清，加入与RNAiso Plus等量的75%乙醇，轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁， 在4°C条件下离心5分钟后小心弃去上清；
[0017] 3)RNA 的溶解
[0018] 打开离心管盖，室温干燥沉淀，沉淀干燥后，加入RNase-free水溶解沉淀，最后将 RNA溶液贮存于-80°C;
[0019] 4)总RNA纯度、浓度及完整性检测
[0020] 取lyL总RNA溶于99yL无 RNase水中，用蛋白质核酸检测仪测总RNA在0D260nm、 0D280nm的吸光值，并求出两者的的比值；
[0021] 5)总RNA电泳检测
[0022]取3yL总RNA样品经1%琼脂糖凝胶电泳20min后，在凝胶紫外线投射仪下观察电泳 结果；
[0023] 6)PCR引物设计
[0024] 根据GenBanK中原鸡(Gallus gallus)的相关基因序列，使用引物设计软件primer 5.0设计引物，并合成，合成后用荧光定量PCR;
[0025] 7)检测LEAP-2基因的表达量
[0026] 检测云南地方鸡肝脏、脾脏、胸腺、法氏囊四个组织中LEAP-2基因的表达量。
[0027] 进一步，其特征在于:在步骤1)总RNA的提取①中加入lml RNAiso Plus(宝生物公 司）。
[0028] 进一步，在步骤1)总RNA的提取③中加入RNAiso Plus体积量1/5的氯仿。
[0029]进一步，在步骤1)总RNA的提取⑤中溶液分层为三层，三层分别为:无色含RNA的上 清液、白色的中间蛋白层及带有颜色的下层有机相。
[0030] 进一步，步骤6) PCR引物设计中用于荧光定量的LEAP-2基因的引物序列为：
[0031] F:5 '-GGCATTCCTTTTATTCTTCTCGC-3 '；
[0032] R:5 '-TGCATTCACTGTTATCCCTACA-3 '
[0033] 内参18S rRNA的引物序列为：
[0034] F:5 '-TGGACTCCTACAACCAACGG-3 '
[0035] R:5 '-CATCCTCCTTGAACTCGCAG-3 '
[0036] 荧光定量PCR的反应条件为:95°C预变性2min; 95°C变性15s，65°C退火30s、72°C延 伸30s，40个循环。
[0037] 进一步，所述的云南地方鸡包括武定鸡、盐津乌骨鸡、茶花鸡、大围山微型鸡。
[0038]本发明的有益效果：
[0039] 本发明对抗菌肽LEAP-2基因设计引物，进行PCR扩增，检测LEAP-2基因 mRNA在云南 地方鸡在肝脏、脾脏、胸腺和法式囊四个组织的表达量，在肝脏、脾脏、胸腺、法氏囊四个组 织中表达量高的云南地方鸡更容易遭受环境变化、病原微生物感染，在肝脏、脾脏、胸腺、法 氏囊四个组织中的表达量高的云南地方鸡免疫机能较强，对云南地方鸡优良品种的相关基 因进行研究，不但可以进一步了解云南地方鸡种抗病力强的原因，为揭示云南地方鸡抗病 力遗传特性提供理论依据，而且可以对云南地方鸡鸡种品质资源的保护、利用和创新起到 积极的作用，并指导地方鸡种的杂交改良、品种(系）的培育，为鸡抗逆生理机制和抗病育种 研究提供参考。
【附图说明】
[0040] 图1是本发明的LEAP-2基因在四个云南地方鸡种肝脏中的表达比较分析图；
[0041] 图2是本发明的LEAP-2基因在四个云南地方鸡种脾脏中的表达比较分析图；
[0042]图3是本发明的LEAP-2基因在四个云南地方鸡种胸腺中的表达比较分析图；
[0043]图4是本发明的LEAP-2基因在四个云南地方鸡种法氏囊中的表达比较分析图；
[0044]图5是本发明的LEAP-2基因在四个云南地方鸡种沙门氏菌病感染率比较分析图。
【具体实施方式】
[0045]如图1-5所示，下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清 楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例， 基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有 其它实施例，都属于本发明保护的范围。
[0046] 实施例1
[0047] 一种基于LEAP-2基因判断云南地方鸡抗病能力强弱的方法，包括以下具体步骤 为：
[0048] 1)RNA 的提取
[0049] ①选取同一批次出壳的武定鸡健康鸡只120只进行隔离饲养，分别于4、8、12周龄 屠宰，采集各个鸡只的肝脏、脾脏、胸腺、法氏囊组织，将采集的组织进行低温冷冻，将低温 冻结的组织样品称量后转移至用液氮预冷的研钵中，用研杵研磨组织，其间不断加入液氮， 直至研磨成粉末状;加入lml RNAiso Plus(宝生物公司）。
[0050] ②将匀浆液转移至离心管中；
[0051] ③向匀浆裂解液中加入氯仿，紧盖离心管盖，混合至溶液乳化呈乳白色；
[0052]④室温静置5分钟；
[0053]⑤在4°C条件下离心15分钟，从离心机中取出离心管，此时匀浆液分为三层，即：无 色的上清液(含RNA)、中间的白色蛋白层(大部分为DNA)及带有颜色的下层有机相；
[0054] ⑥吸取上清液转移至另一个离心管中，向上清液中加入1倍RNAiso Plus体积的异 丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，室温下静置10分钟；
[0055] ⑦4°C条件下离心10分钟；
[0056] 2)RNA沉淀的清洗
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