组织进行低温冷冻，将 低温冻结的组织样品称量后转移至用液氮预冷的研钵中，用研杵研磨组织，其间不断加入 液氮，直至研磨成粉末状;加入lml RNAiso Plus(宝生物公司）；
[0140] ②将匀浆液转移至离心管中；
[0141] ③向匀浆裂解液中加入氯仿，紧盖离心管盖，混合至溶液乳化呈乳白色；
[0142] ④室温静置5分钟；
[0143] ⑤在4°C条件下离心15分钟，从离心机中取出离心管，此时匀浆液分为三层，即：无 色的上清液(含RNA)、中间的白色蛋白层(大部分为DNA)及带有颜色的下层有机相；
[0144] ⑥吸取上清液转移至另一个离心管中，向上清液中加入0.5倍RNAiso Plus体积的 异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，室温下静置10分钟；
[0145] ⑦4°C条件下离心10分钟；
[0146] 2)RNA沉淀的清洗
[0147] 弃去上清，加入与RNAiso Plus等量的75%乙醇，轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁， 在4°C条件下离心5分钟后小心弃去上清；
[0148] 3)RNA 的溶解
[0149] 打开离心管盖，室温干燥沉淀，沉淀干燥后，加入RNase-free水溶解沉淀，最后将 RNA溶液贮存于_80°C;
[0150] 4)总RNA纯度、浓度及完整性检测
[0151] 取lyL总RNA溶于99yL无 RNase水中，用蛋白质核酸检测仪测总RNA在0D260nm、 0D280nm的吸光值，并求出两者的的比值；
[0152] 5)总RNA电泳检测
[0153] 取3yL总RNA样品经1%琼脂糖凝胶电泳20min后，在凝胶紫外线投射仪下观察电泳 结果；
[0154] 6)PCR引物设计
[0?55] 根据GenBanK中原鸡(Gallus gallus)的相关基因序列，使用引物设计软件primer 5.0设计引物，并合成，合成后用荧光定量PCR，PCR引物设计中用于荧光定量的LEAP-2基因 的引物序列为：
[0156] F:5 '-GGCATTCCTTTTATTCTTCTCGC-3 '；
[0157] R:5 '-TGCATTCACTGTTATCCCTACA-3 '
[0158] 内参18S rRNA的引物序列为：
[0159] F:TGGACTCCTACAACCAACGG
[0160] R：CATCCTCCTTGAACTCGCAG
[0161] 荧光定量PCR的反应条件为:95°C预变性2min; 95°C变性15s，65°C退火30s、72°C延 伸30s，40个循环；
[0162] 7)检测LEAP-2基因的表达量
[0163] 表4大围山微型鸡在4周龄、8周龄和12周龄LEAP-2基因在肝脏、脾脏、胸腺和法氏 囊中的表达
[0164]
[0165] 实施例5
[0166] 对武定鸡、盐津乌骨鸡、茶花鸡、大围山微型鸡四个鸡种在4周龄、8周龄和12周龄 的沙门氏菌感染率进行测定，结果如图5所示，四个品种在4周龄的感染率分别为:4.4%、 3.0%、1.54%、0.88% ;8周龄的感染率分别为：2.67%、1.76%、1.02%、0.64%;12周龄的 感染率分别为:2·56%、1·53%、0·74%、0·43%。
[0167] 本发明对抗菌肽LEAP-2基因设计引物，进行PCR扩增，检测LEAP-2基因 mRNA在云南 地方鸡在肝脏、脾脏、胸腺和法式囊四个组织的表达量，在肝脏、脾脏、胸腺、法氏囊四个组 织中表达量高的云南地方鸡不容易遭受环境变化、病原微生物感染，在肝脏、脾脏、胸腺、法 氏囊四个组织中的表达量低的云南地方鸡免疫机能较强，对云南地方鸡优良品种的相关基 因进行研究，不但可以进一步了解云南地方鸡种抗病力强的原因，为揭示云南地方鸡抗病 力遗传特性提供理论依据，而且可以对云南地方鸡鸡种品质资源的保护、利用和创新起到 积极的作用，并指导地方鸡种的杂交改良、品种(系）的培育，为鸡抗逆生理机制和抗病育种 研究提供参考。
[0168] 以上对本发明实施例所提供的进行了详细介绍基于LEAP-2基因判断云南地方鸡 抗病能力强弱的方法，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，但 不仅仅限定于上述四个鸡种，对云南地方鸡的抗病能力的强弱都能够判断，最后选择最优 的品种，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领 域的一般技术人员，依据本发明的思想，在【具体实施方式】及应用范围上均会有改变之处，综 上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
【主权项】
1. 一种基于LEAP-2基因判断云南地方鸡抗病能力强弱的方法，其特征在于：具体包括 以下步骤： 1)RNA的提取 ① 选取同一批次出壳的云南地方鸡的健康鸡只120只进行隔离饲养，分别于4、8、12周 龄屠宰，采集各个鸡只的肝脏、脾脏、胸腺、法氏囊组织，将采集的组织进行低温冷冻，将低 温冻结的组织样品称量后转移至用液氮预冷的研钵中，用研杵研磨组织，其间不断加入液 氮，直至研磨成粉末状;加入RNAisoPlus; ② 将匀浆液转移至离心管中； ③ 向匀浆裂解液中加入RNAisoPlus体积量1/5的氯仿，紧盖离心管盖，混合至溶液乳 化呈乳白色； ④ 室温静置5分钟； ⑤ 在4°C条件下离心15分钟，从离心机中取出离心管，此时匀浆液分为三层，S卩：无色的 含RNA上清液、中间的含DNA的白色蛋白层及带有颜色的下层有机相； ⑥ 吸取上清液转移至另一个离心管中，向上清液中加入0.5-1倍RNAisoPlus体积的异 丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，室温下静置10分钟； ⑦ 4°C条件下离心10分钟； 2)RNA沉淀的清洗 弃去上清液，加入与RNAisoPlus等量的75%乙醇，上下颠倒洗涤离心管管壁，在4°C条 件下离心5分钟后小心弃去上清液； 3)RNA的溶解 打开离心管盖，室温干燥沉淀，沉淀干燥后，加入RNase-free水溶解沉淀，最后将RNA溶 液贮存于_80°C; 4) 总RNA纯度、浓度及完整性检测 取lyL总RNA溶于99yL无RNase水中，用蛋白质核酸检测仪测总RNA在0D260nm、0D280nm的吸光值，并求出两者的的比值； 5) 总RNA电泳检测 取3yL总RNA样品经1%琼脂糖凝胶电泳20min后，在凝胶紫外线投射仪下观察电泳结 果； 6)PCR引物设计 根据GenBanK中原鸡(Gallusgallus)的相关基因序列，使用引物设计软件primer5.0 设计引物，并合成，合成后进行荧光定量PCR;引物序列为？:5'-660六17〇：1'1'1741'1'(：1'1'(：1^6(：-3 '；R:5 '-TGCATTCACTGTTATCCCTACA-3 '； 7) 检测LEAP-2基因的表达量 检测云南四个地方鸡种肝脏、脾脏、胸腺、法氏囊四个组织中LEAP-2基因的表达量，荧 光定量PCR的反应条件为:95°C预变性2min;95°C变性15s，65°C退火30s、72°C延伸30s，40个 循环。2. 根据权利1所述的一种基于LEAP-2基因判断云南地方鸡抗病能力强弱的方法，其特 征在于:在步骤1)总RNA的提取①中加入RNAisoPlus的量为lml。3. 根据权利1所述的一种基于LEAP-2基因判断云南地方鸡抗病能力强弱的方法，其特 征在于:在步骤1)总RNA的提取③中加入RNAisoPlus体积量1 /5的氯仿。4. 根据权利1所述的一种基于LEAP-2基因判断云南地方鸡抗病能力强弱的方法，其特 征在于：在步骤1)总RNA的提取⑤中溶液分层为三层，三层分别为:无色含RNA的上清液、白 色的中间蛋白层及带有颜色的下层有机相。5. 根据权利1所述的一种基于LEAP-2基因判断云南地方鸡抗病能力强弱的方法，其特 征在于:步骤6)PCR引物设计中用于荧光定量的LEAP-2基因的引物序列为： F:5 '-GGCATTCCTTTTATTCTTCTCGC-3 ' R:5 '-TGCATTCACTGTTATCCCTACA-3 ' 内参18SrRNA的引物序列为： F:5 '-TGGACTCCTACAACCAACGG-3 ' R:5 '-CATCCTCCTTGAACTCGCAG-3 ' 荧光定量PCR的反应条件为：95°C预变性2min; 95°C变性15s，65°C退火30s、72°C延伸 30s，40个循环。6. 根据权利1所述的一种基于LEAP-2基因判断云南地方鸡抗病能力强弱的方法，其特 征在于:所述的云南地方鸡包括武定鸡、盐津乌骨鸡、茶花鸡、大围山微型鸡。
【专利摘要】本发明涉及一种基于LEAP-2基因判断云南地方鸡抗病能力强弱的方法，属于动物分子育种的基因工程技术领域；所述的基于LEAP-2基因判断云南地方鸡抗病能力强弱的方法包括以下具体步骤为：1）总RNA的提取；2）RNA沉淀的清洗；3）RNA的溶解；4）总RNA纯度、浓度及完整性检测；5）总RNA电泳检测；6）PCR引物设计；7）检测LEAP-2基因的表达量来基于LEAP-2基因判断云南地方鸡抗病能力的强弱，在肝脏、脾脏、胸腺、法氏囊四个组织中的表达量高的云南地方鸡不容易遭受环境变化影响和被病原微生物感染，在脾脏、胸腺、法氏囊三个组织中的表达量高的云南地方鸡免疫机能较强。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105483247
【申请号】CN201511017340
【发明人】刘丽仙, 李琦华, 荣华, 赵筱, 李正田, 徐志强, 谷大海, 曹振辉, 豆腾飞, 佟荟全, 林秋叶, 贾俊静, 汪善荣, 葛长荣
【申请人】云南农业大学
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2015年12月29日