专利名称：植物广谱抗病基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物学领域，更具体地说，本发明涉及新的水稻广谱抗病基因以及该基因的用途。
背景技术：
植物病害一直是农林业生产面临的一个重要难题。现代农业由于往往种植一些基因背景比较一致的栽培品种，因此很容易遭受大面积的病害流行影响。传统的抗病育种或基因工程改良往往使用一些小种专化性的抗病基因(R gene)来改良作物的抗病性，但这种”gene-for-gene”的抗性往往随着病原菌小种的变异而失去效果。而采用植物防卫反应关键调控基因可以有效地解决传统抗病品种在生产应用中的容易抗性丧失的不足。
植物中存在着可诱导的抗病反应，这种可诱导的防卫反应主要有SAR(SystemAcquired Resistance系统获得性抗性)和ISR(Induced Systemic Resistance)。研究较多的主要是SAR途径在植物识别侵染的病原菌后，防御机制得以有效激活，将侵染限制在局部，并将抗病信号传递到没有受到病害侵染的远处组织，而对接续的同类和其他病害侵染产生抗性。植物的SAR抗性是一种广谱的抗性，它在诱导后可以针对细菌、真菌、病毒等各种病原体产生抗性。控制这种SAR的一个关键基因是NPR1(nonexpresser of PR genes(pathogene-related genes)。NPR1基因最早于1997年从模式植物拟南芥中克隆并报道，NPR1基因位于拟南芥可诱导性的抗病反应调控的信号网络SAR和ISR的中心调控部位，编码一个锚蛋白重复序列蛋白(ankyrin repeat)，正调拟南芥中的SAR反应；在拟南芥中过量表达NPR1后，可以明显的增加拟南芥对真菌和细菌的抗性(专利号JA2002537834等)。之后的研究表明，拟南芥的NPR1蛋白在病原菌未侵染时以多聚体形式存在；病原菌侵染后，侵染部位的细胞产生HR反应(hypersensitive response超敏反应)并伴随有氧爆发现象；为了消除氧爆发影响，细胞随后通过磷酸戊糖途径大量合成NADH等还原力，并使细胞的氧化还原状态转为还原态，在这个细胞内氧化还原态转化为还原态的过程中，原来在细胞质中以多聚体状态存在的NPR1蛋白解聚为单体，并进入到细胞核内，与细胞核内的TGA类转录调控因子互作，通过影响TGA类转录调控因子与PR基因的启动子区域的作用来调节PR基因的表达，从而增强了拟南芥对病原菌的抗性。因此植物的NPR1基因是迄今为止所发现的最有应用价值的广谱抗病调节基因。NPR1的同类基因在植物中可能广泛存在，玉米的NPR1基因也由先锋种子公司申请了专利(专利号US6504084)。然而，目前对于水稻中是否存在NPR1基因还没有报道。
发明内容
本发明一方面提供了一种分离的核酸序列，它具有选自下列的DNA序列或与其互补的序列(a)序列表中SEQ ID NO1或SEQ ID NO2所示的核酸序列；(b)相对于SEQ ID NO1或SEQ ID NO2所示的核酸序列有一个或多个保守性修饰的序列；或(c)编码具有SEQ ID NO3所示氨基酸序列的水稻广谱抗病蛋白OsNPR1或相对于SEQ ID NO3的氨基酸序列有一个或多个氨基酸缺失、替代或插入且具有水稻广谱抗病蛋白OsNPR1的生物活性的蛋白的核酸序列。
本发明还提供了包含上述核酸序列以及与该核酸序列操作性相连的表达调控序列的表达载体。在一个较佳的实施方案中，所述表达调控序列包括组成型高表达的调控序列。
本发明还提供了转化有上述表达载体的宿主细胞。在较佳的实施方案中，所述宿主细胞来自水稻。
本发明还提供了一种获得提高的广谱抗病性的植物品系的方法，该方法包括a)将本发明上述的表达载体导入所述植物的细胞内；b)培养所述植物细胞以产生再生的植物；和c)使上述核酸序列在宿主细胞内表达，从而获得广谱抗病性有所提高的植物品系。
在一个较佳的实施方案中，所述植物品系选自水稻。
本发明还涉及本发明的核酸序列在用PCR或文库筛选同源基因中的用途以及在提高植物品系广谱抗病性中的用途。
在使本发明的核酸序列在水稻中过量表达、RNA干扰(RNAi)、突变体转基因，并接种水稻最主要的细菌病害—白叶枯病的检测后，本发明者发现OsNPR1基因可以提供高度抗病性的功能。过量表达OsNPR1基因组DNA和cDNA的转基因水稻表现出了对白叶枯病菌的广谱抗性，而通过RNAi技术将OsNPR1基因表达剔除后，转基因水稻对白叶枯病变得更加敏感。因此，本发明涉及的OsNPR1基因在植物抗病性基因工程中有广泛的应用价值。
附图简述
图1显示了将本发明的OsNPR1基因导入水稻后获得的各转基因株系以及亲本对照对接种白叶枯病的抗性，其中图1的纵坐标为白叶枯病斑的长度。
图2显示了各水稻株系的经白叶枯病侵染后的情况，其中1为pCSN空质粒对照；2为TP309亲本对照；3为抗病品系106对照；4-10为转基因株系4G3；5G28；6G46；7G311；8G312；9G316；10G330。
图3显示了经RNA干扰以及导入OsNPR1点突变蛋白的水稻对白叶枯病的抗性，其中1为抗病品系106对照；2-6为导入了OsNPR1点突变基因(第76位氨基酸和216位氨基酸由Cys变为Gly)后的不同水稻株系；7为TP309亲本对照；8为OsNPR1基因通过RNAi去除后的转基因植株；9为转pCSN空质粒对照；10为其它抗病品系对照。
图4显示了实施例3中各水稻株系的经白叶枯病侵染后的情况，其中1为抗病品系106对照；2为TP309亲本对照；3-6为导入OsNPR1突变体(76位氨基酸和216位氨基酸由Cys变为Gly)的不同株系。
图5显示了用Northern检测转基因水稻和未转基因水稻的OsNPR1-1基因的表达变化。
图6显示了RT-PCR的检测结果，其中1OxOsNPR1-1 G316(对白叶枯病抗性较好的株系)；2OxOsNPR1-1 C47(对白叶枯病抗性略有增加的株系)；3OxOsNPR1-1-GFP；4OxOsNPR1-1-GFP(C76A)；5OxOsNPR1-1-GFP(C76A+C216)；6OsNPR1-1RNAi；7TP309；8阴性对照(以水为模板)。
图7显示了各株系接种白叶枯病的两种小种J18和99a后的病斑长度，其中1OxOsNR1-1-GFP line1接种J18；2OxOsNPR1-1-GFPLine1接种99a；3OxOsNR1-1-GFP line2接种J18；4OxOsNPR1-1-GFPLine2接种99a；5OxOsNR1-1-GFP line3接种J18；6OxOsNPR1-1-GFPLine3接种99a；7OxOsNR1-1-GFP(C76A+C216A)line1接种J18；8Ox OsNR1-1-GFP(C76A+C216A)line1接种99a；9OxOsNR1-1-GFP(C76A+C216A)line2接种J18；10OxOsNR1-1-GFP(C76A+C216A)line2接种99a；11OxOsNR1-1-GFP(C76A+C216A)line3接种J18；12OxOsNR1-1-GFP(C76A+C216A)line3接种J18；13106(TP309转化了Xa21基因对白叶枯病99a小种为gene-for-gene抗性)接种J18；14106接种99a；15TP309(转基因母本)接种J18；16TP309接种99a。
具体实施例方式
本发明第一方面提供了一种分离的核酸序列，它具有选自下列的DNA序列或与其互补的序列(a)序列表中SEQ ID NO1或SEQ ID NO2所示的核酸序列；(b)相对于SEQ ID NO1或SEQ ID NO2所示的核酸序列有一个或多个保守性修饰的序列；或(c)编码具有SEQ ID NO3所示氨基酸序列的水稻广谱抗病蛋白OsNPR1或相对于SEQ ID NO3的氨基酸序列有一个或多个氨基酸缺失、替代或插入且具有水稻广谱抗病蛋白OsNPR1的生物活性的蛋白的核酸序列。
本文所用的术语“分离的”在用于核酸或蛋白质时，表示核酸或蛋白质基本上不含其它在天然状态下相关的细胞成分，其最好呈均质状态，但也可以是干的或水溶液。纯度和均一性通常可用分析化学方法如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱法来测定。
在本发明中，术语“核酸”指脱氧核糖核酸或核糖核酸及其单链或双链形式的聚合物。除非另有特别限定，该术语包括含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，该核酸具有与参比核酸相似的结合性能，并以与天然存在的核苷酸相似的方式进行代谢。术语“核酸”可与基因、cDNA和基因编码的mRNA互换使用。另外，本发明的核酸序列可经过修饰以使用针对特别细胞类别而言较佳的密码子。本发明的核酸序列还涵盖了核酸片段或核酸亚序列，只要该核酸片段或核酸亚序列具有与本发明的核酸序列同样的生物活性。
而且，本发明的核酸序列也包括其保守性修饰的变体和互补序列。特定核酸序列的“保守性修饰”指那些核酸，它们编码相同或基本相同的氨基酸序列，或当核酸不编码氨基酸序列时，具有基本上相同的序列。由于遗传密码的简并性，许多功能相同的核酸编码了一给定多肽。例如，密码子CGU、CGC、CGA、CGG、AGA和AGG均编码氨基酸精氨酸。因此，在由密码子确定的每个精氨酸位置，密码子可以变成上述相应密码子的任一个而不改变编码的多肽。这种核酸变化是“沉默变化”，它是“保守性修饰变化”中的一种。本领域技术人员会认识到，核酸中的每个密码子(除AUG外，它通常是甲硫氨酸的唯一密码子)均可用标准技术修饰产生功能相同的分子。因此，每一序列意味着包括了编码某多肽的核酸的“沉默变化”。
另外，本领域技术人员也会认识到，当某改变导致一个氨基酸置换成化学相似的一个氨基酸时，个别置换、缺失或增加而使编码序列改变、增加或缺失单个氨基酸或少数氨基酸(通常低于5％，更通常地低于1％，例如有1-20个，更佳的有1-10个，还要佳的为1-5个、1-3个)是“保守性修饰变化”。提供功能相似氨基酸的保守性置换表是本领域所熟知的。下列5组各自含有能相互保守置换的氨基酸脂族甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)；芳族苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；含硫甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)；碱性精氨酸(R)、赖氨酸(K)、组氨酸(H)；酸性天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)。因此，本发明的核酸序列不仅包括编码具有SEQ ID NO3所示氨基酸序列的水稻广谱抗病蛋白OsNPR1，而且也包括相对于SEQ ID NO3的氨基酸序列有一个或多个氨基酸缺失、替代或插入且具有水稻广谱抗病蛋白OsNPR1的生物活性的蛋白的核酸序列。
术语“具有水稻广谱抗病蛋白OsNPR1的生物活性”指该蛋白或其类似物通过影响TGA类转录调控引子与PR基因的启动子区域作用来调节PR基因表达、从而增强植物广谱抗病性的能力。
本发明的核酸序列可用本领域技术人员熟知的常规手段来获得，例如，根据本发明已经公开的序列来合成合适引物进行PCR法扩增等。
本发明另一方面涉及一种表达载体，所述载体包含本发明所述的核酸序列以及与该核酸序列操作性相连的表达调控序列。本文所用的术语“表达调控序列”通常指参与控制核酸序列表达的序列。表达调控序列包括与目标核酸序列操作性相连的启动子和终止信号。它们通常还包括核酸序列适当翻译所需的序列。“操作性相连，，是指线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果启动子或增强子增加了编码序列的转录，则它与编码序列是操作性相连的。
在较佳的实施方案中，所述表达调控序列包括组成型高表达启动子。选择适合在靶植物中高度或过量表达的表达调控序列，如启动子(例如35S启动子)。另外，增强元件(增强子)的存在，联合上述启动子元件也通常会提高表达水平。
本发明另一方面还提供了一种被上述表达载体转化的宿主细胞。该“宿主细胞”可以是原核细胞如大肠杆菌、枯草杆菌等，也可以是植物细胞如水稻细胞。
可通过多种常规技术将本发明的核酸序列或含该核酸序列的构建物(表达载体)转化导入所需植物宿主细胞的基因组内。转化大量高等植物种类的技术是众所周知的，并已经记载在诸多技术与科技文献中。例如，可通过电穿孔或显微注射植物细胞原生质体等技术，将DNA构建物直接导入所需植物宿主的基因组，或者，可用轰击法(例如DNA粒子轰击)，将DNA构建物直接导入植物组织。或者，可将DNA构建物与合适的T-DNA两侧序列组合，然后导入常规的根瘤土壤杆菌宿主载体。当植物细胞宿主被根瘤土壤杆菌感染时，根瘤土壤杆菌的毒性将把构建物和邻近的标记插入植物细胞DNA。另外，还可使用显微注射以及聚乙二醇沉淀导入DNA构建物的方法。在一特别优选的实施方案中，采用农杆菌介导转化的方法。
本发明另一方面提供了一种获得提高的广谱抗病性的植物品系的方法，该方法包括a)将上述表达载体导入所述植物的细胞内；b)培养所述植物细胞以产生再生的植物；和c)使所述核酸序列在宿主细胞内表达，从而获得广谱抗病性有所提高的植物品系。
在通过植物转化技术衍生获得的转化的植物细胞后，可培育再生成具有转化基因型的全植物，从而具有所需的广谱抗病表型。这些再生技术例如包括从培养的原生质体再生植物的方法，或是从植物胼胝体、外植体、器官或其部分再生植物的方法。本发明所述的“广谱抗病”是指对一个病原菌的不同菌系或亚种有抗性(例如实验所证实的，转基因水稻对自叶枯病的两种小种J18和99a都产生了抗性(如图7所示))。
预计本发明的广谱抗病基因适用于各种植物品系，其包括但不局限于草莓属、莲属、苜蓿属、驴豆属、车轴草属、胡卢巴属、豇豆属、柑橘属、亚麻属、天竺葵属、木薯属、胡萝卜属、拟南芥属、芸苔属、萝卜属、欧白芥属、颠茄属、辣椒属、曼陀罗属、天仙子属、番茄属、烟草属、茄属、碧冬茄属、毛地黄属、菊苣属、向日葵属、莴苣属、雀麦属、天门冬属、金鱼草属、天竺葵属、黍属、狼尾草属、毛莨属、千里光属、香瓜属、大豆属、黑麦草属、玉蜀黍蜀、小麦属、高粱属、苹果属、芹属和曼陀罗属，包括甘蔗、甜菜、棉花、果树和豆荚。特别适合的是草科植物，如玉米、小麦、大麦、燕麦、苜蓿、水稻、小米、黑麦、大豆等。
本发明还有一个方面涉及将本发明的核酸序列用于PCR或文库筛选同源基因。
下面将结合实施例进一步详细地描述本发明。然而应当理解，列举这些实施例只是为了起说明作用，而并不是用来限制本发明。
实施例1 基因的克隆利用水稻测序计划的结果(https://portal.tmri.org/rice；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/；http://www.rice-research.org/；http://210.83.138.53/rice/)，本发明者使用了拟南芥中NPR1基因的保守区域锚蛋白重复序列(Ankrine Repeat)，从水稻基因组数据库中筛选出三个与拟南芥AtNPR1基因高度一致的基因，分别命名为OsNPR1-1，OsNPR1-2和OsNPR1-3。其中，OsNPR1-1与AtNPR1基因的蛋白质同源性最高，达到45.7％，而OsNPR1-2和OsNPR1-3与AtNPR1在蛋白水平的同源性分别达到37.3％和38.4％。
OsNPR1-1基因的克隆gDNA的克隆从水稻基因组计划(RGP)获得含有OsNPR1-1基因的BAC(P000B106)后，第一步使用FspI酶切回收10Kb左右的片断，再用XhoI酶切回收含有OsNPR1-1GDNA的4.4Kb的片断后，连接在pGEM7zf(SmaI+XhoI)载体(Promega公司)上，测序验证序列完全正确。再从含有OsNPR1-1 GDNA全长的pGEM7zf-OsNPR1-1载体上以BamHI+XhoI切下目的片段，连入PUC18(BamHI+XhoI)，再以KpnI+XbaI从PUC18-OsNPR1-1上切下目的片断，连入本实验室构建的含有35S启动子和NOS终止子的双元载体Pcambia 1301-35SN中(KpnI+XbaI)，构建完成含有OsNPR1-1 GDNA的转基因双元载体。本实验所采取的转基因双元载体都是pCambia1301-35SN，其中pCambia载体的序列或图谱见http://www.cambia.org/pCAMBIA vectors.html，pCambia1301-35SN是在pCambia1301的基础上增加了一个CaMV 35S启动子以启动目的基因的转录，使转入的目的基因组成性超表达)。
cDNA的克隆使用内含子预测软件(http://opal.biology.gatech.edu/GeneMark/，http://genes.mit.edu/GENSCAN.html和http://www.fruitfly.org/seq tools/splice.html)以拟南芥为模板预测出OsNPR1-1基因的CDNA序列后，采用PCR克隆的方法从日本晴成熟叶片的反转录产物中克隆得到。由于OsNPR1-1 CDNA在ATG之后500bp之内的GC含量都高于75％(达到了76.6％)，所以无法用普通的PCR方法或普通的反转录酶得到整个cDNA全长，在多次实验后，本发明者利用了OsNPR1-1 CDNA第451位的SalI酶切位点，先用高保真酶从日本晴成熟叶片mRNA的RT产物中PCR得到1.3Kb的含有SalI酶切位点的片断，而GC含量高的500bp则采用专用于高GC含量的高保真酶，设计引物(OsNPR1-15’CAG，TCC，TCG，TCGACG，GCC 3’和OsNPR1-15’TGC，GGG，TTAC，CGG，TGC，GCA，ATG 3’)从使用专用于高GC含量的RT试剂盒(Invitrogen公司，ThermoScripet RT-PCR System试剂盒)逆转录出的RT产物中PCR得到，将两个片断连接在一起连入SK，测序完全正确后，以KpnI+BamHI切入双元载体pCambial301-35SN中，并转入农杆菌EHA105中，准备转基因用。本发明者通过软件预测出的cDNA序列都可以从RT产物中克隆到，而且与2004年公布的RGP水稻全长CDNA库http://cdna01.dna.affrc.go.jp/cDNA/)的序列也完全一致。本说明书序列表中SEQ ID NO1显示了OsNPR1基因的DNA序列，SEQ ID NO2显示了OsNPR1基因的cDNA序列，SEQ ID NO3中显示了由mRNA翻译成的OsNPR1-1蛋白质序列。
实施例2 OsNPR1组成性高表达(35S启动子)增强水稻对白叶枯病的抗性用碱法从大肠杆菌DH5a提取表达载体后，用热击法导入农杆菌EHA105(见分子克隆第二版)，使用农杆菌介导的转基因方法将基因转入到水稻愈伤组织中，水稻转基因实验的过程可参见文献(植物学报，2000，42(11)1172-1178黄健秋等.根瘤农杆菌介导的水稻高效转化和转基因植株的高频再生)。用PCR和GUS染色的方法鉴定出转基因阳性的植株，进行白叶枯病的接种实验(PCR和GUS染色的原理和方法可以参见科学出版社，1998，王关林等植物基因工程原理与技术一书)。
水稻白叶枯病的接种方法和抗性统计方法如下将培养的白叶枯病菌用无菌水稀释到OD600值＝1.0后，用剪刀浸泡菌液后在距水稻叶片1cm处剪一刀接种；在14天后测量白叶枯病斑的长度，每一个单株接种三片叶子，每一个转基因株系接种12株，统计病斑长度后取平均值作为接种数据。结果显示在图1和图2中。
另外，用Northern检测转基因水稻和未转基因水稻的OsNPR1-1基因的表达变化(图5)使用OsNPR1-1基因的cDNA特异探针，对高表达OsNPR1-1的转基因水稻和未转基因的水稻中OsNPR1-1基因的表达量检测，结果发现在未转基因的母本TP309中OsNPR1-1基因的本底表达量很低，而在转基因的水稻中OsNPR1-1基因的表达量较高；对应接种数据，可以得知OsNPR1-1基因的表达量与转基因水稻对白叶枯病的抗性是正相关的。因此，可以得出结论，OsNPR1的组成型高表达增强了水稻对白叶枯病的抗性。
另外，用白叶枯病的两种小种J18和99a对各株系接种，其结果显示在图7中，如图7所示，各株系对接种的白叶枯病的两种小种J18和99a均有一定抗性，抗病品系106对照对于99a有基因对基因(gene for gene)的抗性，但是对于同属白叶枯病的另一小种J18却没有抗性。
实施例3 OsNPR1点突变蛋白转基因水稻增强对白叶枯病的抗性按照生产商说明书，使用STRATAGENE公司的Quickchange XL Site-DirectedMutagenesis试剂盒将OsNPR1-1蛋白的保守半胱氨酸残基变为甘氨酸，转基因过程和载体以及检测方法如实施例2所示。结果显示在图3和图4中。
另外采用如下方法进行RNA干扰使用OsNPR1-1基因3’端特异的核酸片断，构建出反向互补的“发夹”结构，转基因过程和载体以及检测方法如实施例2所示。
采用OsNPR1-1基因的特异引物(NPF5’TTCATGGCGCAGGTCCTCT3’；NPR5’TTCAGTGAGCAGCATCCTGA 3’)进行RT-PCR(ubiqutin引物作为上样量对照用)。结果显示在图6中。从该图可以看出，RNAi的转基因株系中内源的OsNPR1-1被完全抑制。
可以得出结论，OsNPR1点突变蛋白转基因水稻增强对白叶枯病的抗性，而RNAi降低了转基因植株内源的OsNPR1-1基因的表达。
尽管本发明描述了具体的例子，但是有一点对于本领域技术人员来说是明显的，即在不脱离本发明的精神和范围的前提下可对本发明作各种变化和改动。因此，所附权利要求覆盖了所有这些在本发明范围内的变动。
序列表<110>中国科学院上海生命科学研究院<120>植物广谱抗病基因及其应用<130>050297<160>3<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>4348<212>DNA<213>水稻(Oryza sativa)<400>1cctcctcgcc tcgcctcgcc acgccgcgcc gcgacgcgac gcgccgtggt cagctggtcg 60ccggtgcggg tgcgggtgcg caatggagcc gccgaccagc cacgtcacca acgcgttctc 120cgactcggac agcgcgtccg tggaggaggg gggcgccgac gcggacgccg acgtggaggc 180gctccgccgc ctctccgaca acctcgccgc ggcgttccgc tcgcccgagg acttcgcgtt 240cctcgccgac gcgcgcatcg ccgtcccggg cggcggcggc ggcggcggcg acctgctggt 300gcaccgctgc gtgctctccg cgcggagccc cttcctgcgc ggcgtcttcg cgcgccgcgc 360cgccgccgcc gcaggcggcg gcggcgagga tggcggcgag aggctggagc tccgggaact 420cctcggcggc ggcggcgagg aggtggaggt cgggtacgag gcgctgcggc tggtgctcga 480ctacctctac agcggccgcg tcggcgacct gcccaaggcg gcgtgcctct gcgtcgacga 540ggactgcgcc cacgtcgggt gccaccccgc cgtcgcgttc atggcgcagg tcctcttcgc 600cgcctccacc ttccaggtcg ccgagctcac caacctcttc caggtccgcc tcttcgcagc 660tgcctctcct tttccccttc cattcgcgat gctcatgtca tgccagttca tctcttccct 720gtgcttgctt ggatgcgtat tgctcataga agtgggggtt taaagatgca tttttttagt 780tgcgcgcgtg gagctttgct ttaggcggca aaatgaacta cttctgaagg agaggggaga 840tggtctgaac tgaatcactc ctaatcacgt taatcattgc aatttggatt actgcaattg 900gaggcctgtg ataattgcat tgtgattaac ttgctgtcat attggcgatg aacagtattc 960aggtttagtt gtttgcgatt ttggggattc acgtgtgctt ggtgctgtat gcattgcaga1020gaaaaacaaa agcttacagt tgtatgaacg tgtggatgcg actccctgct tcaattagaa1080atcgtccaaa aagctagtac atcttaagcc attaatcaac tcagatcatg cactgttaca1140tcggttatgt ttgatccaat cctcctaatc agtttattct aatgtctgaa tcgaactgcc1200tggctaactg tccttatcta acatgttgct gcttactgat cttgggggtg cttgccgttc1260tcgttgttat ttatcggatt cttcttggtc atgttgacgc gaaaatggaa gttaactgtg1320tttgatatcc agcaagagtg gtgctgatat agtaaaggtg tttcttaacc ttttcttttc1380ttgcaaaaga gcagttcctt attgaagtat cttcagataa ggcgattgga ctgtgcacca1440tcctattcta ggctgcttca agtacacatg tttcactcaa ttgtaccatg atagggacat1500actcacatac cgcacattat ccttccaaat ttgtcaatgc tgcattaatg tgacagtgat1560atttatgcac agaaagcaca atcatatgtt ttccacttaa acttgactgt atctcagtgt1620ttttaaattg aaatgtcaca catattcgaa gcaataataa acgaacaaca aaaaaaatat1680gcatgtatct tatggtaaaa tttgccttgg ctatattaca gggggaaaat gagtggctac1740actccaatca cagcatgttt atccaagaac acaaaaggaa atttcaaaat tttaaatgta1800aaagcctaag gtcactaatg tttatatata tatcaacttt tattctcttt acagtctttg1860gaagttgttt ttaggagtta tgggggttgt ttttcagtaa ttctgtctca aaattatatt1920gcttgcgtgg ctgcgccata cgtgccaatc tgacaagaac caaacatgat tgtactaatt1980gtatatatag cctagcttcc tttggtccaa ttgatggccc tcagccttgt atttatattt2040ataaatcttc tggcgttaac attactctac attgaacttg ctatttcaag tattatgttg2100gtgtttggct tgtaatattt tggtttctaa aaagaattaa aaccaggaag tttccttttc2160taataaaaaa tgggccttga tgctacttgc ttttgttgac ctttgtttta gaacgtggta2220ctgttttttt cagataaggc tgttccatac tgaatccatt aattattgct agcccaatgc2280atgtcagtcg gttatcgttt gtaatgtttc actattttaa gaagccagaa ccaaagcaat2340gatatattct tctttttcat gcagcggcgt ctccttgatg tccttgataa ggttgaggta2400gataaccttc tattgatctt atctgttgcc aacttatgca acaaatcttg catgaaactg2460
cttgaaagat gccttgatat ggtagtccgg tcaaaccttg acatgattac tcttgagaag 2520tcattgcctc cagatgttat caagcagatt attgatgcac gcctaagcct cggattaatt 2580tcaccagaaa acaagggatt tcctaacaaa catgtgagga ggatacacag agcccttgac 2640tctgacgatg tagagctagt caggatgctg ctcactgaag gacagacaaa tcttgatgat 2700gcgtttgcac tgcactacgc cgtcgaacat tgtgactcca aaattacaac cgagcttttg 2760gatctcgcac ttgcagatgt taatcataga aacccaagag gttatactgt tcttcacatt 2820gctgcgaggc gaagagagcc taaaatcatt gtctcccttt taaccaaggg ggctcggcca 2880gcagatgtta cattcgatgg gagaaaagcg gttcaaatct caaaaagact aacaaaacaa 2940ggggattact ttggggttac cgaagaagga aaaccttctc caaaagatag gttatgtatt 3000gaaatactgg agcaagctga aagaagggac ccacaactcg gagaagcatc agtttctctt 3060gcaatggcag gtgagagtct acgaggaagg ttgctgtatc ttgaaaaccg aggtaacctt 3120cacatatatc ataatgggtt cataatgctg gtttctttgg aattaactgt ttttggtctt 3180ggcaacaaaa ggaaggttac atttcagttt agtgtgtttc atgcagagtg cagtttcaag 3240agtttcccag tgcccatttt ttagaacttc cattttgtta tgaagttgta tcttgatatt 3300atagtttttg tacgatgtag ttgctttggc gaggattatg tttccgatgg aggcaagagt 3360agcaatggat attgctcaag tggatggaac tttggaattt aacctgggtt ctggtgcaaa 3420tccacctcct gaaagacaac ggacaactgt tgatctaaat gaaagtcctt tcataatgaa 3480agaagaacac ttagctcgga tgacggcact ctccaaaaca ggtaatacac ggcactctgt 3640ttattcacac tgcctccaag cgatgtatat tttgaatcta atgctacaaa cttgtgtggc 3600acactgctac acatgcaaat atttttgatt tttcatattt tctgatggaa gctaaaacta 3660tagatgctcc cattttgact gataggttca ctgttgaata ccctgagagg tttatgcaat 3720gttgcatatc ttttagctct aacactgtca atgtgaacca tggacaattt tgctcttttt 3780tgttcattca gaatgatagt tcatactacc tgaagattaa ataattgaca aagatatgta 3840cactttactg tggtaatttc taattttaat ctggtcttga ataggtagcc tagttaatct 3900ttcttggggt gcatgtgttg tctatagact tttgtggttg aaaaatcttt gtacatcaag 3960agcacagaat atacttaggt atatctatag gaacaactgc ttgagattca tcacagaagt 4020tgcaaagaca ttacattctc ttaattggac atagactaat tgcaagctga atgtgtatac 4080cagtggagct cgggaaacgc tttttcccgc gatgttcgaa cgtgctcgac aagatcatgg 4140atgatgaaac tgatccggtt tccctcggaa gagacacgtc cgcggagaag aggaagaggt 4200ttcatgacct gcaggatgtt cttcagaagg cattccacga ggacaaggag gagaatgaca 4260ggtcggggct ctcgtcgtcg tcgtcatcga catcgatcgg ggccattcga ccaaggagat 4320gaacaccatt gctcccaaat agttgcca 4348<210>2<211>1800<212>DNA<213>水稻(Oryza sativa)<400>2tcgccggtgc gggtgcgggt gcgcaatgga gccgccgacc agccacgtca ccaacgcgtt60ctccgactcg gacagcgcgt ccgtggagga ggggggcgcc gacgcggacg ccgacgtgga 120ggcgctccgc cgcctctccg acaacctcgc cgcggcgttc cgctcgcccg aggacttcgc 180gttcctcgcc gacgcgcgca tcgccgtccc gggcggcggc ggcggcggcg gcgacctgct 240ggtgcaccgc tgcgtgctct ccgcgcggag ccccttcctg cgcggcgtct tcgcgcgccg 300cgccgccgcc gccgcaggcg gcggcggcga ggatggcggc gagaggctgg agctccggga 360actcctcggc ggcggcggcg aggaggtgga ggtcgggtac gaggcgctgc ggctggtgct 420cgactacctc tacagcggcc gcgtcggcga cctgcccaag gcggcgtgcc tctgcgtcga 480cgaggactgc gcccacgtcg ggtgccaccc cgccgtcgcg ttcatggcgc aggtcctctt 540cgccgcctcc accttccagg tcgccgagct caccaacctc ttccagcggc gtctccttga 600tgtccttgat aaggttgagg tagataacct tctattgatc ttatctgttg ccaacttatg 660caacaaatct tgcatgaaac tgcttgaaag atgccttgat atggtagtcc ggtcaaacct 720tgacatgatt actcttgaga agtcattgcc tccagatgtt atcaagcaga ttattgatgc 780acgcctaagc ctcggattaa tttcaccaga aaacaaggga tttcctaaca aacatgtgag 840gaggatacac agagcccttg actctgacga tgtagagcta gtcaggatgc tgctcactga 900aggacagaca aatcttgatg atgcgtttgc actgcactac gccgtcgaac attgtgactc 960caaaattaca accgagcttt tggatctcgc acttgcagat gttaatcata gaaacccaag 1020aggttatact gttcttcaca ttgctgcgag gcgaagagag cctaaaatca ttgtctccct 1080tttaaccaag ggggctcggc cagcagatgt tacattcgat gggagaaaag cggttcaaat 1140ctcaaaaaga ctaacaaaac aaggggatta ctttggggtt accgaagaag gaaaaccttc 1200
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Leu His Ile Ala Ala Arg Arg Arg Glu Pro Lys Ile Ile Val Ser Leu340 345 350Leu Thr Lys Gly Ala Arg Pro Ala Asp Val Thr Phe Asp Gly Arg Lys355 360 365Ala Val Gln Ile Ser Lys Arg Leu Thr Lys Gln Gly Asp Tyr Phe Gly370 375 380Val Thr Glu Glu Gly Lys Pro Ser Pro Lys Asp Arg Leu Cys Ile Glu385 390 395 400Ile Leu Glu Gln Ala Glu Arg Arg Asp Pro Gln Leu Gly Glu Ala Ser405 410 415Val Ser Leu Ala Met Ala Gly Glu Ser Leu Arg Gly Arg Leu Leu Tyr420 425 430Leu Glu Asn Arg Val Ala Leu Ala Arg Ile Met Phe Pro Met Glu Ala435 440 445Arg Val Ala Met Asp Ile Ala Gln Val Asp Gly Thr Leu Glu Phe Asn450 455 460Leu Gly Ser Gly Ala Asn Pro Pro Pro Glu Arg Gln Arg Thr Thr Val465 470 475 480Asp Leu Asn Glu Ser Pro Phe Ile Met Lys Glu Glu His Leu Ala Arg485 490 495Met Thr Ala Leu Ser Lys Thr Val Glu Leu Gly Lys Arg Phe Phe Pro500 505 510Arg Cys Ser Asn Val Leu Asp Lys Ile Met Asp Asp Glu Thr Asp Pro515 520 525Val Ser Leu Gly Arg Asp Thr Ser Ala Glu Lys Arg Lys Arg Phe His530 535 540Asp Leu Gln Asp Val Leu Gln Lys Ala Phe His Glu Asp Lys Glu Glu545 550 555 560Asn Asp Arg Ser Gly Leu Ser Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ser Ile Gly565 570 575Ala Ile Arg Pro Arg Arg580
权利要求
1.一种分离的核酸序列，其特征在于，它具有选自下列的DNA序列或与其互补的序列(a)序列表中SEQ ID NO1或SEQ ID NO2所示的核酸序列；(b)相对于SEQ ID NO1或SEQ ID NO2所示的核酸序列有一个或多个保守性修饰的序列；或(c)编码具有SEQ ID NO3所示氨基酸序列的水稻广谱抗病蛋白OsNPR1或相对于SEQ ID NO3的氨基酸序列有一个或多个氨基酸缺失、替代或插入且具有水稻广谱抗病蛋白OsNPR1的生物活性的蛋白的核酸序列。
2.一种表达载体，其特征在于，所述载体包含权利要求1所述的核酸序列以及与该核酸序列操作性相连的表达调控序列。
3.根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于，所述表达调控序列包括组成型高表达的调控序列。
4.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞被权利要求2所述的表达载体转化。
5.根据权利要求4所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞来自水稻。
6.一种获得提高的广谱抗病性的植物品系的方法，该方法包括a)将权利要求2所述的表达载体导入所述植物的细胞内；b)培养所述植物细胞以产生再生的植物；和c)使权利要求1所述的核酸序列在宿主细胞内表达，从而获得广谱抗病性有所提高的植物品系。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述植物品系选自水稻。
8.权利要求1所述的核酸序列在用PCR或文库筛选同源基因中的用途。
9.权利要求1所述的核酸序列在提高植物品系广谱抗病性中的用途。
全文摘要
本发明提供了编码水稻OsNPR1基因的核酸序列、含有该序列的表达载体和宿主细胞。本发明还提供了通过利用水稻OsNPR1基因来获得提高的广谱抗病性的植物品系的方法。
文档编号C12N15/63GK1869231SQ20051002606
公开日2006年11月29日 申请日期2005年5月23日 优先权日2005年5月23日
发明者何祖华, 袁月星, 李群 申请人:中国科学院上海生命科学研究院