一种利用基因工程技术改良植物营养品质的方法

专利名称：一种利用基因工程技术改良植物营养品质的方法
技术领域：
本发明涉及基因工程和转基因植物领域。具体地，本发明涉及一种外源基因(如人乳铁蛋白基因)在植物种子、果实或其它组织中高效表达的载体，以及在植物种子、果实或其它组织中高效表达外源基因的方法。
背景技术：
植物果实或种子中具有较强的蛋白合成功能，如能利用转基因技术将外源基因特别是具有重要医疗价值的基因如人促红细胞生成素基因、人生长激素基因转入植物中，就有可能产生出大量的药用蛋白。人体内的许多蛋白的生理活性与翻译后的修饰有关，通过原核生物表达的蛋白通常因为缺少翻译后修饰而不具有生物活性。以酵母或动物细胞培养来表达这些蛋白不仅成本高而且条件要求高，以转基因植物来表达这些蛋白，其产物接近天然即具有较高的生物活性、表达量高、成本低而且简单易行。
利用农杆菌介导法技术转化进植物体内的基因，其在植物体内的基因组的整合及表达是随机的，如果外源基因具有较强的活性，如果随机表达或异位表达有可能造成对转基因植物的伤害，甚至死亡。
因此本领域迫切需要在植物的种子(如水稻种子)、果实(如番茄果实)及其它可食用组织(如叶片)中特异且高效表达外源基因的载体和技术。
乳铁蛋白是乳汁中主要的铁结合蛋白，主要分布在哺乳动物的乳汁、血液、泪液、胆汁、精液、羊水、和小肠液等分泌物中，在哺乳动物中以人乳汁中含量最高。人乳铁蛋白(Human lactoferrin，hLF)因对胰蛋白酶及类似的蛋白酶具有抗降解能力，特别是结合铁离子后抗降解能力增强，因此，在肠道内能以完整分子的形式被吸收，有利于婴儿在发育中对铁的摄入，是人体非特异性免疫系统中的重要成员之一，人乳铁蛋白对某些人体致病菌与病毒有很强的抑制作用(Harmsen等1995)；除此之外，乳铁蛋白还具有多种生物学功能。目前，已克隆了多种动物的乳铁蛋白基因及cDNA序列，并在乳腺、昆虫、曲霉等系统中表达了重组的乳铁蛋白。荷兰PHP公司20世纪90年代在牛乳腺中表达了以牛αs1-酪蛋白基因5’调控序列为启动子的人乳铁蛋白基因，按当时的物价，年产值可达50亿美元，由此可以看出人乳铁蛋白的生产具有巨大的经济效益。

发明内容
本发明的第一目的就是提供一种适合在植物种子、果实或其它组织中高效表达人乳铁蛋白的融合基因及载体。
本发明的第二目的是提供一种利用转基因植物的种子、果实或其它组织高效表达人乳铁蛋白的方法，从而在植物种子、果实或其它组织中高效表达人乳铁蛋白。
本发明的第三目的是提供一种利用基因重组技术生产上述新的人乳铁蛋白的方法。
本发明还提供了这种新的人乳铁蛋白及其编码序列在植物营养品质改良中的应用。
本发明的第一方面，提供了在植物果实、种子或其它组织中高效表达融合基因hLFSEKDEL的载体，该载体从5’至3’依次包含以下元件胚乳特异表达启动子或果实特异表达启动子或组成型表达启动子、人乳铁蛋白全长编码cDNA序列(hLF)、植物内质网滞留信号肽(SEKDEL)序列、终止子序列。较佳地，在启动子与人乳铁蛋白全长编码cDNA序列有一接头序列，植物内质网滞留信号肽的编码序列的末段还有一接头序列。
在本发明的一个实施例中，在启动子与人乳铁蛋白全长编码cDNA序列有一接头序列带有一BamHI位点；植物内质网滞留信号肽的编码序列的末段还有一接头序列带有一SacI位点。
更佳地，人乳铁蛋白融合基因hLFSEKDEL具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；以及由SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列；植物内质网滞留信号肽的编码序列具有SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列，以及其它相应的编码的核苷酸序列(见表1)。
乳铁蛋白是一种多功能的糖蛋白，具有抗菌和抗病毒等作用，是一种具有重要价值的药用蛋白。在本发明的一个实施例中，选用人的乳铁蛋白作为研究的外源基因。
本发明首先提供了一种调控外源基因在植物种子、果实和其它组织中特异高效表达的载体，为使外源基因(人乳铁蛋白)在植物种子、果实及其它组织中高效表达，本发明利用了植物种子或果实特异表达调控元件，或植物组成型表达调控元件构建了植物果实、种子或其它组织如叶片中高效表达的载体。
在本发明的一个实施例中，所构建的载体包括如下序列元件胚乳特异表达启动子或果实特异表达启动子或植物组成型表达启动子、终止子序列。
在本发明的一个实施例中，为了使人乳铁蛋白在植物的特定组织中积累，在人乳铁蛋白的全长编码序列后加上了植物内质网滞留信号肽的编码序列，从而构建了融合基因hLFSEKDEL。
本发明还提出了通过在植物中表达所述融合基因从而实现提高植物营养品质的方法。其步骤如下上述方法中所说的植物为高等植物，在后面的实施例中使用番茄、水稻。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步的阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不是用于限制本发明的范围。下面具体实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规的条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或者按照制造厂商所建议的条件。
实施例1 在植物种子或果实或其它组织中高效表达融合基因hLFSEKDEL的载体的构建该实施例的载体构建过程如下所示，该基因构建物即为在果实或胚乳或其它组织如叶片中表达的融合基因(hLFSEKDEL)的载体。其中在果实中特异表达的调控序列来源于番茄果实特异表达启动子PG、在胚乳中特异表达的调控序列来源于玉米醇溶蛋白启动子19Z、在植物其它组织中高效表达的启动子来源于花椰菜病毒的35S启动子CaMV35S，编码序列来源于人乳铁蛋白cDNA基因序列。
含融合蛋白hLFSEKDEL的载体的构建过程1)融合基因hLFSEKDEL的序列根据hLF的编码序列设计并合成如下引物hLFFPCGGATCCATGAAACTTGTCTTCCTCG(SEQ ID NO.1)hLFRPTTTGAGCTC GGACTTCCTGAGGAATTCACAG(SEQ ID NO.2)其中hLFFP引物序列有BamHI酶切位点(下画横线)、hLFRP有SacI酶切位点(下画横线)和SEKDEL编码序列的互补序列(加框序列)。
以人血细胞总RNA为模板，采用如上所述的引物通过RT-PCR获得hLFSEKDEL融合基因全长序列(SEQ ID NO.3)，该融合基因全长长度为2189bp，编码717个氨基酸残基，分子量为79,073道尔顿，等电点(pI)为8.43。
2)酶切将含有克隆出的序列的质粒载体用BamHI及SacI双酶切，切下融合基因hLFSEKDEL。
3)连接将切下的基因连入已经用BamHI及SacI酶切好的经过改造的含有植物果实、种子特异启动子的基因质粒pCAMBIA2300植物表达载体大片段中，用蓝白斑筛选检测转化的大肠杆菌阳性克隆。
实施例2获得含融合基因hLFSEKDEL的农杆菌及转基因水稻和番茄植株的获得该实施例的转化过程如下所述，该步骤的结果是获得带有目的基因的转基因水稻和番茄植株。
1.含目的基因(融合基因hLFSEKDEL)表达载体的农杆菌菌株的获得在成功地构建了含hLFSEKDEL融合基因的植物表达载体p2300-hLF-SEKDEL的基础上，通过冻融法将p2300-hLF-SEKDEL导入农杆菌(如EHA105或LBA4404)中，利用农杆菌介导法技术转化模式植物水稻或番茄。
2.转基因水稻植株的获得1)愈伤组织的诱导与继代在无菌器皿中，将去壳的水稻(如品种1826)种子成熟胚或幼胚经过以下洗涤75％酒精浸1-2分钟，再用无菌水洗2次后，25％的次氯酸钠浸30分钟(期间要摇动几次，或放在摇床上摇动)，用无菌水洗4-5次，将种子移到无菌滤纸上，吸干水分，接到MS2(MS0+2，4-D 2ppm)上，每皿25粒，然后在25℃暗培养。3-4周后，将水稻长出的黄色愈伤转到新鲜的MS2上继续培养，以后每2周继代一次。经2-4次继代后即可选择嫩黄、颗粒状的胚性愈伤准备与菌共培养。
2)菌的活化取用甘油保存于-20℃的农杆菌50-100μl于2ml的LB液体培养基中(酵母粉5g；蛋白胨10g；NaCl10g；PH7.0；总体积1升。需要高压灭菌)，并加入相应的抗生素[如利福平20-50ppm；链霉素50-100ppm；卡那霉素50ppm；壮观霉素50-100ppm；氯霉素20-50ppm]，在摇床上以250rpm左右、25℃摇菌24-36小时至OD600＝1.0。再取新摇菌100-200μl于30ml的LB液体培养基中，并加入相应的抗生素(浓度、条件同上)，经12小时左右，菌液达到OD600＝0.8-1.0时，即可用来转化。
3)共培养菌液在无菌的50ml的离心管中以5000rpm×5min离心，去上清，再用30ml的MSCO(MS2+乙酰丁香酮AS 100μmol/l)液体培养基重悬。将预先挑好的愈伤浸在菌液中15-30分钟后，再用无菌滤纸或吸水纸吸去多余的菌液(无须进一步吸干)，置于MSCO固体培养基(可覆盖一层无菌滤纸)上，25℃暗培养2-3天。
4)洗菌与筛选共培养的愈伤先用无菌水冲洗3次，再浸于含头孢霉素(250mg/l)的MSCO液体培养基中20-30分钟，将愈伤组织用无菌滤纸或吸水纸吸干后，接种于选择培养基S1(MS2+卡那霉素50ppm+Cef(头孢霉素)250ppm)上筛选2-3周。然后挑选新长出的愈伤接种于新鲜的选择培养基S1上筛选2-3周。
5)植株再生与生根将经过2次选择得到的抗性愈伤接种到预分化培养基上暗培养10天左右，再转到分化培养基上进行光照培养。约1-2个月，将2cm左右高的幼苗转到生根培养基(1/2MS0+卡那霉素50ppm+NAA 0.2ppm+植物凝胶phytagel 2.5g/l+蔗糖15g/l)上生根。当苗长至10cm高且根系发达后，将植株取出，用无菌水洗净附着的固体培养基，移入土壤中，刚开始用玻璃罩罩几天，待植株健壮后再取下玻璃罩，温室中培养。
3.利用叶盘法转化番茄1)番茄种子灭菌后播于1/2MS培养基上，约10天左右长出子叶；2)取用甘油保存于-20℃的农杆菌50-100μl于2ml的LB液体培养基中(酵母粉5g；蛋白胨10g；NaCl 10g；PH7.0；总体积1升。需要高压灭菌)，并加入相应的抗生素[如利福平20-50ppm；链霉素50-100ppm；卡那霉素50ppm；壮观霉素50-10ppm；氯霉素20-50ppm]，在摇床上以250rpm左右、25℃摇菌24-36小时至OD600＝1.0。再取新摇菌100-200μl于30ml的LB液体培养基中，并加入相应的抗生素(浓度、条件同上)，经12小时左右，菌液达到OD600＝0.8-1.0时，即可用来转化。
3)室温下4000g离心10min；4)弃上清，菌体用1/2MS液体培养基悬浮，加入子叶浸泡10分钟；5)在无菌滤纸上吸干菌液；将子叶放在MS培养基上，共培养两天；6)将叶片转到含Kan的愈伤和分化培养基(MS+ZT 1.0mg/L+IAA 1.0mg/L+Kan50mg/L+cb 250mg/L)上，25-28℃光照下培养，7-15天可见抗性愈伤组织的形成和植株再生；7)待芽长大后约1-2厘米的时将幼芽移植在生根培养基中(1/2 MS)上进行生根培养，2-7天左右生根；8)根系发达后，将植株取出，用无菌水洗净附着的固体培养基，在珍珠岩中驯化一周，用1％的MS浇灌，移入土中。
实施例3 融合基因hLFSEKDEL在转基因水稻和番茄中的检测本实验用于检测转基因植株中的融合基因。
1.样品处理非转基因的水稻和番茄，及转基因的水稻和番茄，按常规操作取叶片，-20℃保存备用。
2.检测方法1)基因组DNA的快速抽提将保存的叶片按照改良的CTAB法进行总DNA的抽提；2)酶切及电泳取基因组总DNA约10微克采用限制性内切酶BamHI和SacI进行酶切，酶切产物在1％的琼脂糖凝胶，1-2V/cm，电泳12小时以上；3)变性及中和加入变性液(1.5M NaCl、0.5M NaOH)使胶变性45分钟(轻摇)，加入中和液(1.5M NaCl、0.5M Tris-HCl(pH8.0))轻摇中和45分钟。
4)转膜将尼龙膜均匀铺在胶上，上面铺3MM Waterman吸水纸三张，再铺纸塔(5-10厘米)压上重物18小时；用5×SSC冲洗膜以除去膜表面的凝胶碎片，在室温下凉干，80℃固定2小时。
5)探针制备用BamHI和SacI酶切质粒，回收含融合基因hLFSEDKEL的片段，采用随机引物标记试剂盒标记探针。
6)预杂交及杂交转运膜在预杂交液(5×SSPE，5×Denhardt’s Solution，0.1％SDS，100ug/ml nonhomologus Salman Sperm blocking DNA，50％Formamide)中42℃预杂交4小时。将探针加入到预杂交液中42℃中杂交16小时。
7)洗膜压片洗片采用Washing Solution(1×SSC，0.1％SDS)65℃洗涤1小时，重复此步骤后，将洗涤后的杂交膜用保鲜膜固定，暗室中放入X光片，-70℃保存两天。暗室中取出X光片，显影5分钟，定影15分钟，检查光片上显示的结果。
实施例4 融合基因hLFSEKDEL在转基因水稻和番茄植株中的表达检测本实验用于转基因植株中的人乳铁蛋白的表达检测。
1.蛋白的提取取50mg转基因水稻去壳种子或番茄成熟果实，加入100ul PBS(KH2PO40.2g/l，Na2HPO41.15g/l，KCl 0.2g/l，NaCl 8g/l)缓冲液，于1.5ml离心管中研磨；13000，4℃离心10分钟；取上清，备用。
2.蛋白质的定量参考Bradford法(Bradford，1976)。取2ul蛋白质样品，加入1ml Bradford试剂，混匀后，分光光度计测OD595值。
3.SDS-PAGE分离蛋白质SDS-PAGE的制备参考《分子克隆》(Sambrook等，1989)1)加样前，将样品(包括提取的植物蛋白样品(30ug/样品)和市售的人乳铁蛋白50ng)置于含50mmol/L DTT的加样缓冲液(2×加样缓冲液甘油2.4g，1M Tris-HCl pH6.81ml；溴酚兰0.01％，H2O定容至20ml)，煮沸10分钟；2)室温，100V电压下电泳，直到指示剂(溴酚兰)前沿达到凝胶底部。
4.蛋白质向硝酸纤维膜上转移1)转移之前，用转移缓冲液(39mmol甘氨酸，48mmol Tris Base，0.037％SDS，20％甲醇)平衡凝胶和硝酸纤维膜30分钟；2)室温下用半干式电转仪转移1小时，凝胶两侧各垫3层Whatman滤纸；5.硝酸纤维膜上蛋白质的检测1)将硝酸纤维膜浸在封闭液中，37℃缓慢摇动、封闭60分钟(封闭液取5g脱脂奶粉溶于100ml 1×PBS(含0.5g叠氮钠))；
2)将滤膜浸泡在洗涤缓冲液中，37℃洗涤两次，每次15分钟；3)加入第一抗体(抗人乳铁蛋白的抗体)，37℃温育30分钟；同步骤b)，洗涤三次；4)加入第二抗体(亲和素-碱性磷酸酶复合物)，37℃温育30分钟；5)同步骤2)，洗涤两次；6)加入底物显色观察到人乳铁蛋白的蛋白特异条带；7)通过比较植物样品中的人乳铁蛋白的特异条带同市售的人乳铁蛋白的特异条带的强弱，计算出人乳铁蛋白在转基因水稻种子和番茄果实中的表达量。在本研究中，我们获得了在转基因水稻种子和番茄果实中人乳铁蛋白表达量占总可溶性蛋白的0.5％的转基因水稻和番茄。这些所培育出的表达人乳铁蛋白的转基因水稻和番茄可以作为具特殊营养价值的食品加以利用。
在本发明所提及到的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了上述所讲授的内容以后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
本发明涉及的序列及记号分列如下1.SEQ ID NO.1的信息(1)序列特征(A)长度26bp(B)类型寡核苷酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性
(2)分子类型寡核苷酸(3)序列描述SEQ ID NO.1CGGATCCATGAAACTTGTCTTCCTCG2.SEQ ID NO.2的信息(1)序列特征(A)长度49bp(B)类型寡核苷酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(2)分子类型寡核苷酸(3)序列描述SEQ ID NO.2TTTGAGCTCTTATAGCTCGTCTTTCTCGGACTTCCTGAGGAATTCACAG3.SEQ ID NO.3的信息(1)序列特征(A)长度2189bp(B)类型核苷酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(2)分子类型核苷酸(3)序列描述SEQ ID NO.31 tcct gctgttcctc ggggccctcg gactgtgtct
61 ggctggccgt aggagaagga gtgttcagtg gtgcgccgta tcccaacccg aggccacaaa121 atgcttccaa tggcaaagga atatgagaaa agtgcgtggc cctcctgtca gctgcataaa181 gagagactcc cccatccagt gtatccaggc cattgcggaa aacagggccg atgctgtgac241 ccttgatggt ggtttcatat acgaggcagg cctggccccc tacaaactgc gacctgtagc301 ggcggaagtc tacgggaccg aaagacagcc acgaactcac tattatgccg tggctgtggt361 gaagaagggc ggcagctttc agctgaacga actgcaaggt ctgaagtcct gccacacagg421 ccttcgcagg accgctggat ggaatgtccc tacagggaca cttcgtccat tcttgaattg481 gacgggtcca cctgagccca ttgaggcagc tgtggccagg ttcttctcag ccagctgtgt541 tcccggtgca gataaaggac agttccccaa cctgtgtcgc ctgtgtgcgg ggacagggga601 aaacaaatgt gccttctcct cccaggaacc gtacttcagc tactctggtg ccttcaagtg661 tctgagagac ggggctggag acgtggcttt tatcagagag agcacagtgt ttgaggacct721 gtcagacgag gctgaaaggg acgagtatga gttactctgc ccagacaaca ctcggaagcc781 agtggacaag ttcaaagact gccatctggc ccgggtccct tctcatgccg ttgtggcacg841 aagtgtgaat ggcaaggagg atgccatctg gaatcttctc cgccaggcac aggaaaagtt901 tggaaaggac aagtcaccga aattccagct ctttggctcc cctagtgggc agaaagatct961 gctgttcaag gactctgcca ttgggttttc gagggtgccc ccgaggatag attctgggct1021 gtaccttggc tccggctact tcactgccat ccagaacttg aggaaaagtg aggaggaagt1081 ggctgcccgg cgtgcgcggg tcgtgtggtg tgcggtgggc gagcaggagc tgcgcaagtg1141 taaccagtgg agtggcttga gcgaaggcag cgtgacctgc tcctcggcct ccaccacaga1201 ggactgcatc gccctggtgc tgaaaggaga agctgatgcc atgagtttgg atggaggata1261 tgtgtacact gcatgcaaat gtggtttggt gcctgtcctg gcagagaact acaaatccca1321 acaaagcagt gaccctgatc ctaactgtgt ggatagacct gtggaaggat atcttgctgt1381 ggcggtggtt aggagatcag acactagcct tacctggaac tctgtgaaag gcaagaagtc
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MKLVFLVLLF LGALGLCLAG RRRRSVQWCA VSQPEATKCF QWQRNMRKVRGPPVSCIKRD SPIQCIQAIA ENRADAVTLD GGFIYEAGLA PYKLRPVAAEVYGTERQPRT HYYAVAVVKK GGSFQLNELQ GLKSCHTGLR RTAGWNVPTGTLRPFLNWTG PPEPIEAAVA RFFSASCVPG ADKGQFPNLC RLCAGTGENKCAFSSQEPYF SYSGAFKCLR DGAGDVAFIR ESTVFEDLSD EAERDEYELLCPDNTRKPVD KFKDCHLARV PSHAVVARSV NGKEDAIWNL LRQAQEKFGKDKSPKFQLFG SPSGQKDLLF KDSAIGFSRV PPRIDSGLYL GSGYFTAIQNLRKSEEEVAA RRARVVWCAV GEQELRKCNQ WSGLSEGSVT CSSASTTEDCIALVLKGEAD AMSLDGGYVY TACKCGLVPV LAENYKSQQS SDPDPNCVDRPVEGYLAVAV VRRSDTSLTW NSVKGKKSCH TAVDRTAGWN IPMGLLFNQTGSCKFDEYFS QSCAPGSDPR SNLCALCIGD EQGENKCVPN SNERYYGYTGAFRCLAENAG DVAFVKDVTV LQNTDGNNNE AWAKDLKLAD FALLCLDGKRKPVTEARSCH LAMAPNHAVV SRMDKVERLK QVLLHQQAKF GRNGSDCPDKFCLFQSETKN LLFNDNTECL ARLHGKTTYE KYLGPQYVAG ITNLKKCSTSPLLEACEFLR KSEKDEL5.SEQ ID NO.5的信息(1)序列特征(A)长度18bp(B)类型寡核苷酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(2)分子类型寡核苷酸
(3)序列描述SEQ ID NO.5TCCGAGAAAGACGAGCTA(4)序列SEKDEL所对应的编码序列及其所组成的序列(表1)

权利要求
1.一种在植物种子、果实或其它组织中高效表达融合基因的载体，其特征在于该载体以5’至3’依次包含以下元件胚乳特异表达启动子或果实特异表达启动子或组成型表达启动子、人乳铁蛋白全长编码cDNA序列和植物内质网滞留信号肽序列组成的融合基因(hLFSEKDEL)、终止子序列。
2.根据权利要求1所述的载体，其特征在于在启动子侧翼序列和人乳铁蛋白全长编码cDNA序列之间有一接头序列；植物内质网滞留信号肽的编码序列与终止子序列之间还有一接头序列。
3.一种如权利要求1所述的融合基因，其特征在于融合基因hLFSEKDEL具有SEQ IDNO.3所示的核苷酸序列，以及由SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。
4.根据权利要求3所述的融合基因，其特征在于其中的植物内质网滞留信号肽编码序列具有SEQ ID NO.5序列及其它相应的编码的核苷酸序列。
5.根据权利要求3所述的融合基因，其特征在于构建该融合基因的编码序列所采用的引物，分别具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
6.一种通过在植物中表达权利要求1所述的融合基因从而实现提高植物营养品质的方法，其特征在于，它包括步骤(1)将所述的含融合基因hLFSEKDEL的载体利用农杆菌介导法转化植物，获得基因组中整合有融合基因hLFSEKDEL的愈伤组织；(2)将步骤(1)中所获得的愈伤组织进行分化培养，筛选出表达该融合基因的转基因植株及其后代，包括植物种子、果实及其它组织如叶；(3)所获得的转基因植物因其种子、果实及其它组织中含有表达的人乳铁蛋白而具有附加的营养价值，可以直接食用或加工成其它营养食品或作为其它食品的添加原料使用。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述植物为高等植物。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述植物为番茄和水稻。
全文摘要
本发明为人乳铁蛋白(hLF)全长cDNA编码序列以及植物内质网滞留信号肽(SEKDEL)序列组成的融合基因hLFSEKDEL。其中涉及包含所说该融合基因构建的利用胚乳特异表达启动子或果实特异表达启动子或组成型表达启动子启动表达的植物高效表达载体。还涉及被所说的表达载体转化的植物细胞，以及由所说的转化细胞产生的表达人乳铁蛋白的转基因植株及其后代，包括植物种子及植物组织。本发明还提供了在样品中检测人乳铁蛋白核酸序列和多肽的方法。
文档编号C12N15/12GK1544641SQ20031010884
公开日2004年11月10日 申请日期2003年11月25日 优先权日2003年11月25日
发明者张健, 刘晓军, 李柱刚, 孙小芬, 庞永珍, 张 健 申请人:复旦大学