转pis基因改变植物抗逆性的应用的制作方法

专利名称：转pis基因改变植物抗逆性的应用的制作方法
技术领域：
本发明属农作物的生物工程育种领域，具体说，涉及一种通过转反义或正义PIS基因改变植物抗逆性的方案及用途。
背景技术：
磷脂酰肌醇信号途径中部分酶的研究进展近年来关于植物信号传导的研究取得了一定的进展，其中磷脂酰肌醇代谢途径在动物和高等植物的信号传导中发挥重要作用。磷脂酰肌醇合成酶(PIS)催化myo-inosiol和CDP-甘油生成磷脂酰肌醇(PI)，PI的D3、D4、D5位置有顺序的磷酸化产生了重要的信号分子PI(3.4)P2、PI(3.4.5)P3和PI(4.5)P2。PI(4.5)P2被PI-PLC分解成为IP3和DG，其中IP3刺激细胞内钙离子的释放，DG激活PKC。目前动物中许多PI系统中的组分已被克隆出来，而从植物细胞中分离出来的相对较少。
早在1985年已有人报道PI参与植物与环境间的相互作用，现在有明确的报道表明植物中PI除了在钙信号中发挥作用外，还在一系列环境胁迫信号如渗透胁迫、光胁迫、病原体感染和调节植物发育中起重要作用，另外PI4P和PI(4.5)P2还影响质膜H+-ATPase和PLD等酶的活性。总之，磷脂酰肌醇代谢途径在细胞与外界因子的相互作用、激素的作用以及外界信号至细胞内的传递方面发挥着重要的功能。
最近，编码植物磷脂酰肌醇系统中部分酶的cDNA已被越来越多的克隆出来。有关磷脂酰肌醇合成酶(PIS)克隆及功能鉴定的工作很少。
1999年Collin等从拟南芥中分离到编码PIS的cDNA，对其功能进行鉴定并将其定位在2号染色体上。
2000年Xue等克隆从拟南芥中到AtPIS1基因并将其在酵母中表达，初步鉴定了其功能。另外Xue等已从水稻中已克隆到编码PIS的cDNA序列。
2002年，申请人从玉米cDNA文库中筛选出一个编码磷脂酰肌醇合成酶的全长cDNA序列(ZmPIS)。序列分析表明，ZmPIS在核苷酸水平上与从其它生物中已经克隆出的PIS具有很高的相似性，在氨基酸水平上ZmPIS与来自水稻、拟南芥、小鼠、酵母及人的PIS的相似性分别为85％、63％、30％、38％和29％，且ZmPIS具有CDP-alcohol磷酸转移酶的特征性保守结构DG(X)2AR(X)8G(X)3D(X)3D。对ZmPIS基因表达分析表明，在正常生长条件下，该基因在玉米的根、茎、叶中都有表达。而玉米叶中ZmPIS的转录水平受干旱、盐胁迫及低温胁迫诱导。为了验证ZmPIS的功能，ZmPIS的编码区被重组入酵母表达载体pYES2/NT，转化pis酵母突变体YPR113W。对转化子进行随机孢子分析表明ZmPIS功能性互补pis突变体。通过转基因技术分别获得了转该基因的正义及其反义形式的烟草植株和玉米。对转基因植株的生理分析得出，转ZmPIS基因的表达使烟草植株的耐盐性和耐旱性有显著提高。
根据申请人的工作得出，植物细胞膜中PI的积累有利于胁迫条件下传导信号的加强和膜的流动性增加，从而提高植物细胞适应逆境的能力。即PI产物在受到环境的高等植物的信号传导中发挥功能性作用。

发明内容
针对目前的研究现状，本发明的目的是提供一种转PIS基因改变植物抗逆性的应用。
本发明所述的转PIS基因改变植物抗逆性的应用方法是，将从植物中克隆的PIS基因以反义或正义形式重组到植物表达载体中，采用转基因技术将重组基因导入植物细胞，获得转基因植株；通过检测转基因表达和对植株进行抗逆性鉴定，从中筛选出抗逆性明显提高或降低的转基因植株及其后代，创造出在植物育种中具有应用前景的新种质和新品种。
其中，所述PIS基因来自各种植物，有cDNA形式或基因组基因形式，其编码序列以反义形式或正义形式构建成融合基因，并转入植物体内。
其中，所述用于构建融合基因的PIS基因的反义形式可为基因的全长序列，也可以为部分序列，也可以为根据部分序列人工合成的脱氧多核苷酸。
其中，所述应用方法是通过转PIS反义基因或依据PIS基因序列设计的多核苷酸序列获得的抗逆性提高或降低的转基因植株。
其中，所述应用方法还可以是通过转PIS基因获得对逆境抗性提高或降低的转基因植株及后代。
本发明所说的PIS基因主要克隆于植物，以玉米PIS基因(ZmPIS)为代表。该基因一般以cDNA形式克隆，以正向或反向形式重组到植物表达载体中，也可根据该基因序列构建用于抑制PIS基因表达的RNAi基因。在植物表达载体中，该基因转录由植物特异的启动子启动，编码区后为植物基因的3′尾巴区。因此该融合基因能在植物细胞中有效表达。
本发明所说的基因正向形式插入是指在植物的启动子序列后面正确连接上PIS基因的完整编码框，即第一个密码子紧靠启动子，转录产物为正义mRNA。本发明所说的基因反向形式插入是指在植物的启动子与PIS基因编码框的3′端相连，转录产物为与正义mRNA序列相反的mRNA，因此，可抑制内源PIS基因的表达。以反向形式插入的PIS基因并不要求编码区完整，但要求转录产物在细胞内基本稳定。
本发明所说的植物抗逆性是指植物在整株、器官和/或细胞水平上表现出的耐(抗)旱性、耐(抗)盐性、耐冷性、抗寒性、耐涝性、耐热性、抗(耐)辐射性、抗病性、抗虫性、抗除草剂等特性及其组合。这种抗(耐)性在植株水平上可表现在某些发育阶段或全生育期，可通过多种指标衡量或评价。
本发明所说的植物包括高等植物、低等植物和藻类。
其中，包括各类作物和经济植物、观赏植物、生态植物、杂草等；包括被子植物、裸子植物、藻类等；包括草本植物、木本植物和单细胞藻类等。
ZmPIS序列的基本特征从玉米cDNA筛选出的序列全长1164bp，包含一个648个核苷酸的编码框。推测其编码一个由215个氨基酸组成的蛋白质，计算得其分子量和等电点分别为24kDa和8.79。其起始密码子上游第122-124核苷酸编码一个终止密码子，显示该cDNA序列包含全长ZmPIS编码区。用Clustal W软件将ZmPIS序列与来自其它物种的PIS序列进行对比分析发现，ZmPIS与其它PIS在核苷酸及氨基酸水平上有很高的相似性，在氨基酸水平上与来自水稻、拟南芥、小鼠、酵母和人的PIS的相似性分别为85％、63％、30％、38％、29％。而且，ZmPIS含有CDP-alcohol转移酶的特征性保守结构D-G-x(2)-A-R-x(8)-G-x(3)-D-x(3)-D。依据Kyte和Doolittle(1982)的方法对PIS蛋白进行疏水性分析得出PIS是疏水性蛋白，保守结构位于亲水性区域，暗示此结构域是该酶的活性位点。另外，在ZmPIS蛋白质序列中发现有4个潜在的PKC磷酸化位点29-31(SNK)、69-71(TDR)、112-114(SGK)、116-118(SHK)；两个潜在的Casein kinase II磷酸化位点116-119(SHKD)和201-204(TAAD)。
ZmPIS基因的重组采用常规的分子克隆技术将ZmPIS的全长cDNA序列重组入植物双元表达载体pROK2或pCam系列等植物表达载体中获得正向和反向插入ZmPIS重组质粒。可根据受体植物和所需的ZmPIS基因的表达强度及可调控程度，融合基因可选用分别适合于单、双子叶植物和不同低等生物的组成性启动子，可选择植物器官或发育阶段特异性的启动子，或对特异信号(包括逆境信号、化学信号、物理信号等)发生反应的诱导型启动子等。融合基因可选择不同3′尾巴区，也可插入增强子序列，也可在编码区插入不同内含子。重组质粒可分别导入大肠杆菌或农杆菌中增殖或/和保存。
用含有ZmPIS基因的植物表达载体转化植物根据转基因受体材料选用不同转基因方法获得转基因植物。
常用的转化方法有3类1)直接转化法，即提取重组质粒DNA，采用基因枪轰击法、聚乙二醇诱导法、电融合法、硅碳纤维法等直接将质粒DNA导入细胞。2)农杆菌介导的遗传化方法。3)种系转化法，包括花粉管通道法、子房注射法等。此外，还有将不同类方法组合使用的转化程序，如将基因枪轰击法和农杆菌结合使用以提高转化效率。以下以玉米自交系胚性愈伤组织为材料采用基因枪轰击法和以烟草叶盘为材料采用农杆菌介导法进行遗传转化。
A.玉米自交系胚性愈伤组织遗传转化玉米(Zea mays L.)自交系植株在自交授粉后9-12天，取果穗剥去苞叶后于70％酒精中浸泡5min，无菌条件下挑取约1.0-1.2mm大小的幼胚接种于诱导培养基上，培养4-6周得到松脆、淡黄色的II型愈伤组织，然后继代培养基每10-15天继代培养一次。所得到的II型愈伤组织作为遗传转化的受体材料。
采用常规方法制备基因枪弹丸。即称取1.0μm大小的金粉，经70％乙醇洗涤后静置15分钟，离心去除上清液；再用无菌水彻底清洗3次，然后50％灭菌甘油(终浓度为60mg/ml微弹)贮存备用。使用时涡旋5分钟打破金粉凝集，依次加入5μl质粒DNA(1μg/μl)、50μl 12.5M CaCl2、20μl 0.1M亚精胺，边加样边旋涡。然后，继续旋涡2～3分钟，静置1分钟。离心弃上清液后，加70％乙醇静置。然后离心弃上清液，再用无水乙醇重悬，取样加在微弹载体上。微弹用量为每弹0.5mg。
在直径9cm的培养皿中倒入0.4cm厚的培养基，然后将愈伤组织高密度放入培养皿中每皿轰击一次。轰击参数取可裂圆片与载体的距离为2.5cm，载体与阻挡网的距离为0.8cm，微弹飞行距离6-9cm。其它参数按使用说明书取值。轰击后材料在暗中恢复培养3天，然后将材料转入成分不变的新培养基中培养3周，使转入的目标基因充分表达。将材料转入加有选择剂(如1-5ppm除草剂绿黄隆)的培养基上进行筛选。连续筛选三代，每代15天。继代时淘汰变褐死亡的组织块。经过筛选的抗性愈伤组织转入不加筛选剂的培养基上在光照16小时/天下恢复培养1代后，转入分化培养基上分化小苗。愈伤组织产生的小苗在生根培养基中生根，壮苗后移入花盆，长至约10cm高时栽到大田中，自交结实。转基因植株采用PCR检测法筛选，Southern blotting验证。通过数代分子检测和自交结实产生纯系，在通过抗性鉴定和田间选择获得转基因优异材料。
B.烟草叶盘遗传转化取烟草无菌苗为材料，利用叶盘法进行转化。农杆菌菌株为LBA4404，携带含有ZmPIS基因和植物筛选标记基因新霉素磷酸转移霉基因nptII的Mini-Ti质粒。采用常规转化方法进行转化，转基因小芽在含有选择剂卡那霉素(Kan)150μg/ml的诱导培养基上筛选，在生根培养基上生根。采用PCR和Southern杂交分析法确定转基因植株。通过PCR方法检测出分别含正义和反义ZmPIS基因的阳性植株，不含目的基因的空载体转化植株。Northern杂交分析表明异源ZmPIS基因在转基因烟草中有很高的表达水平，而未转基因植株和不含目的基因的空载体转化植株几乎没有杂交信号。
转基因植株抗逆性测定为检测ZmPIS基因的生理功能，将其在烟草中进行正义和反义表达。在正常生长条件下转基因烟草植株没有表型差异。然而，通过检测转基因烟草叶盘的盐耐受性，我们发现转正义ZmPIS基因的烟草与对照植株相比，其耐盐性和耐旱性明显提高。用不含目的基因的空载体转化烟草不会影响再生植株的生理指标。所以转基因烟草耐盐性及耐旱性的改变是由于ZmPIS基因表达促成的。
转基因烟草植株的耐盐性检测转基因小苗在生根培养基上生长1个月后，分别检测其耐盐性和耐旱性。将转基因和对照植株的叶片切成0.5cm2的叶盘，分别在含0.5％、1.0％、1.5％、2.0％和2.5％NaCl的培养基上进行培养，并测定其相对生长量。在含有0.5％和1.0％NaCl的培养基上，各种叶盘生长旺盛，产生愈伤组织继而分化成芽，彼此之间的相对生长量没有显著差别。在加有1.5％NaCl的培养基上，转正义ZmPIS基因的烟草叶盘呈绿色，边缘有愈伤组织生成。在加有2.0％NaCl的培养基上，各种叶盘间的生长状况差异明显，来自转反义基因植株的叶盘多数(70％)死亡；来自对照植株的叶盘约半数死亡，其余生长较差；而90％来自转正义ZmPIS基因的叶盘依然存活，生长较好。相对生长量的统计得出相同结论转正义基因的植株叶盘的相对生长量明显高于来自转反义基因和对照植株的叶盘的相对生长量。这说明正义ZmPIS在烟草中的异源表达能提高烟草的耐盐性。
转基因烟草植株的耐旱性检测 为了了解ZmPIS基因能否影响转基因烟草植株对干旱胁迫的反应，将转基因烟草小苗置于含10％(W/V)PEG 6000的MS无机盐溶液中进行渗透胁迫处理，检测叶片相对含水量的变化。烟草植株在渗透胁迫过程中叶片相对含水量逐渐降低，转基因植株相对含水量比对照植株降低速率低。18h后转正义ZmPIS基因植株得叶片相对含水量从渗透胁迫处理前的94％-99％降低为62％-66％，而非转基因植株叶片相对含水量从96％-98％降低为56％-60％。这说明转正义ZmPIS基因的烟草植株耐旱性有一定增强。
转基因玉米植株的耐盐性检测及利用采用PCR方法检测出分别含正义和反义ZmPIS基因的玉米阳性植株，套袋自交或姊妹交结实。收获的种子播种在砂盆中，浇灌0.8％NaCl水溶液，并以未转基因自交系种子为对照。转基因植株的不同株系在盐水浇灌下表现出不同的耐盐性，多数转正义ZmPIS基因的株系表现出比对照明显提高的耐盐性。在转正义ZmPIS基因的株系中，半数以上株系的5叶期成活率在70％以上，而对照自交系植株出苗后很快死亡，5叶期的成活率不到20％，且植株严重受害。Northern杂交分析表明ZmPIS基因在这些转基因植株中过表达，在未转基因植株和不含目的基因的空载体转化植株中，ZmPIS基因的表达水平无明显差别。选出耐盐性优异的转基因植株套袋自交纯合，并进行配合力测定，选择配合力与供体自交系相同或有提高的转基因自交系，并用于耐盐玉米杂交种培育。
转基因玉米植株的耐旱性检测及利用将转ZmPIS正义基因的玉米种子和未转基因的对照自交系的种子播在的花盆中，分别在苗期(3-7叶期)、雌雄穗发育期(9-13叶期)、开花授粉期进行干旱胁迫处理，检测干旱处理对玉米生长发育的影响、细胞膜受损程度、植株单株产量及其它经济性状和生理指标的差异等。综合多方面的测试结果，转ZmPIS正义基因的玉米比对照植株表现出明显提高的耐旱性。选出耐旱性优异的转基因植株套袋自交纯合，并进行配合力测定，选择配合力与供体自交系相同或有提高的转基因自交系用于玉米单交种选育。
具体实施例方式
实例1转ZmPIS正义基因创造玉米耐盐自交系及应用1)受体系统的建立 以我国农业生产上所用的骨干自交系为材料，如郑58、掖478、掖515等的自交种子。离体培养诱导茎尖产生丛生芽块，以丛生芽块为受体进行遗传转化。所用培养基有种子萌发培养基KNO31900mg/l，NH4NO31650mg/l，CaCl2·2H2O440mg/l，MgSO4·7H2O 370mg/l，KH2PO4·H2O 170mg/l，FeSO4·7H2O 27.8mg/l，ZnSO4·7H2O10mg/l，MnSO4·4H2O 22.3mg/l，H3BO310mg/l，KI0.83mg/l，Na2MoO4·2H2O 0.5mg/l，CuSO4·5H2O 0.025mg/l，CoCl2·6H2O 0.025mg/l，盐酸硫胺素10.0mg/l，盐酸吡哆醇1.0mg/l，烟酸1.0mg/l，甘氨酸2.0mg/l，肌醇100.0mg/l，生物素0.05mg/l，酪蛋白水解物500mg/l，蔗糖30g/l，琼脂粉7g/l，pH5.8-6.0。用于种子萌发。液体培养基则去掉琼脂粉。
A培养基种子萌发培养基附加6-BA4.5-9.0μmol/l和2，4-D 1.0-3.0μmol/l，用于诱导离体培养芽尖产生丛生芽组织块和丛生芽组织块继代培养。
B培养基种子萌发培养基附加6-BA4.5μmol/l和IBA(吲哚丁酸)1.8μmol/l，用于丛生芽组织块分化小苗。
成苗培养基种子萌发培养基附加6-BA 2.25μmol/l和IBA 3.6μmol/l，用于丛生小芽发育成小苗。
生根培养基种子萌发培养基附加IBA 2.8-3.6μmol/l，用于无根小苗生根。
基本培养基及植物生长调节物质热压灭菌；抗生素和除草剂等活性成分过滤灭菌，在培养基灭菌后加入。
种子灭菌和萌发玉米种子用70％乙醇浸泡10分钟，再用0.1％氯化汞浸泡10-15分钟，然后用无菌水洗涤3-5遍。灭菌后种子放在无菌三角瓶内萌发，瓶内放入少量(30-40毫升/250毫升三角瓶)无菌水，封口后放在黑暗条件(23-30℃)下1-2天。萌动(露白)后种子放在基本培养基上于黑暗条件下继续萌发。
茎尖培养和丛生芽组织块诱导、继代、分化萌发种子的胚芽伸长止3-5厘米时，剥离胚芽鞘及幼叶，切取长约5毫米左右的上胚轴及茎尖，接种到A培养基上于黑暗下(24-27℃)培养，并及时切去伸长的胚轴和剥去幼叶。培养6-10天后，茎尖开始不规则膨大生长，在膨大的分生组织上出现数个瘤状或指状突起。20天后，在瘤状或指状突起的表面开始形成不定芽及胚状体。一般每4周继代培养一次。在继代培养中，若丛生芽组织块丛生小芽偏多，2，4-D浓度取3.0μmol/l；若丛生芽组织块愈伤组织化较重，虽有大量的分生细胞团，但表面很少出现不定芽，可将2，4-D浓度降为1.0μmol/l，继续培养则重新产生大量瘤状或指状突起。A培养基上的丛生芽组织块，少数有不定根的产生。与幼叶存在一样，不定根也影响组织块的膨大生长及胚状体和丛生小芽的产生，需要及早去掉。丛生芽组织块在转移到B培养基上2-3天后，色泽逐渐变黄，质地较柔韧，5-6天后表面出现微小突起。扫描电镜下观察可见各期胚状体及不定芽。胚状体及不定芽迅速发育，在组织块表面形成丛生小芽。
2)以丛生芽组织块为受体的转化和植株再生将带有双元载体(Mini-Ti质粒带有选择剂抗性基因和ZmPIS正义基因)的根瘤农杆菌(如AGL0和LBA4404)在附加抗生素的LB培养基(每升培养基含胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，pH7.0，热压灭菌)中28℃下震荡培养，震荡速率为110rpm(转/分)，使细菌处于对数生长期。然后在3000rpm下离心10分钟，弃上清液。菌体用1/2浓度的液体种子萌发培养基(即种子萌发培养基成分减半，去掉琼脂粉)洗涤，再离心收集。再将菌体用添加乙酰丁香酮(acetosyringone，As)100μmol/l的1/2浓度的液体丛生芽诱导培养基悬浮，稀释5-20倍用于转化。
取继代后培养13-20天的丛生芽组织块为转基因受体。用农杆菌介导法进行转化，转化后材料在暗中进行恢复培养。农杆菌感染的丛生小芽或丛生芽组织块在加有头孢霉素(Cefotaxime)250mg/l或羧苄青霉素(Carb)500mg/l的培养基上于黑暗中培养7-12天，抑制细菌生长。恢复培养后或抑菌培养后的丛生小芽或丛生芽组织块在加有选择剂的培养基上连续筛选3-4代，获得转基因细胞及小芽。在筛选培养中绝大数丛生芽组织块逐渐死亡。将存活的组织块转移到无选择剂的去掉2，4-D的A培养基上恢复培养后产生小芽。
将小芽放在成苗培养基上照光下生长，光强2000-3000lx，光照14-15小时/天。小苗长到3-4片叶时转入生根培养基中生根。培养15天左右，约40％的小苗产生新根。对于未生根苗，切伤其基部，转移到新的生根培养基上培养，10天后大多数植株产生根系。生根苗洗去培养基后，移栽到以蛭石为栽培介质的花盆中生长。植株在自然光照下生长，日温22-28℃，夜温15-21℃，隔天浇灌1/2浓度的种子萌发培养基的无机盐成分。生长2周左右，移植苗产生发达根系，然后定植于田间。
3)转基因植株的抗性检测和选择利用取移栽成活植株的叶片进行分子生物学检测确定转基因植株。将转基因植株套袋自交结实。取种子播种在砂盆中，用0.7％NaCl水溶液进行连续浇灌30天，将存活小苗移栽到大田，待植株长大后套袋自交结实。对其下一代继续进行分子生物学鉴定和耐盐性检测，并套袋自交纯合，获得了耐盐自交系。该自交系可用于配制玉米耐盐杂交种。
实例2转ZmPIS正义基因创造小麦优良抗逆育种材料1.小麦无菌苗获得小麦优良品种的种子，用70％乙醇浸泡1-3分钟，再用0.1％氯化汞浸泡8-12分钟，然后用无菌水洗涤3-5遍。灭菌期间不断晃动种子，以保证表面灭菌彻底。灭菌后种子放在无菌三角瓶内萌发，瓶内放入少量无菌水于黑暗条件(20-25℃)下1-2天。待种子萌动(露白)后，将其放在改良MS培养基上于黑暗条件下萌发。待胚芽伸长止3-4厘米时，剥离胚芽鞘及2-3片幼叶，露出茎尖顶端生长锥。
2.农杆菌培养及活化将带有双元载体(Mini-Ti质粒带有除草剂抗性基因bar和ZmPIS基因)的根瘤农杆菌(AGL1或LBA4404)在附加抗生素的LB培养基中28℃下震荡培养，震荡速率为110r/min，使细菌处于对数生长期。然后在3000r/min下离心10分钟，弃上清液。菌体用1/2MS液体培养基洗涤，离心收集。再将菌体用添加100mg/l乙酰丁香酮的1/2MS液体培养基悬浮，稀释5-20倍用于转化。
3.小麦无菌苗转化(1)将菌液倒在4.5厘米直径的培养皿中，倾斜培养皿，使露出茎尖生长锥的无菌苗浸泡在菌液中，在0.5×105Pa大气压下处理3-6分钟。
(2)浸染后的芽尖用无菌滤纸吸干，萌发种子放在附加200mg/l谷氨酰胺的改良MS培养基上于黑暗中培养2-3天，培养温度为22-24℃。然后将无菌苗放在散射光下培养2天。
(3)将照光培养后的无菌苗移栽到铺有上层蛭石下层壤土的花盆中，并用蛭石覆盖植株顶部。然后让植株在自然光照下生长，日温22-28℃，夜温15-21℃，隔天浇灌1/2改良MS培养基无机盐。
4.转化植株筛选与定植转化植株长出3片叶后，喷洒除草剂Finale(Hoechst Schering AgrEvo GmbH，含有除草剂glufosinate ammonium)水溶液，浓度为9.6ml-10.8ml Finale/L，以植株掉液滴为宜。未转化对照植株在喷洒后5天后停止生长，15天左右死亡。转化植株在喷洒后，一些个体变化同对照植株相似，另一些个体持续生长，变化不明显。待存活植株长到7-8叶时，将其定植到田间，并促进分蘖。
5.抗除草剂植株经春化处理后，在起身-拔节期取叶片提取DNA，采用PCR技术检测转化植株。PCR阳性植株进行Soudthern blotting检测，在获得的抗除草剂植株中，约20％左右(147/368)为转基因个体。
6.转基因植株子代分析通过春化阶段(低温处理条件因品种而异)的植株在长日照下起身、拔节、开花结实。转基因植株产生的种子，在浸水萌动后放冰箱(0-2℃)中进行春化处理30-65天。部分春化处理后的种子用10.8ml Finale/L水溶液处理，观察统计抗性和敏感性个体比例；另一部分春化处理后的种子播种在大田和砂盆，分别进行干旱胁迫处理和高盐胁迫处理，筛选耐旱和/或耐盐转基因植株。听取抗逆植株的叶片DNA，采用PCR技术检测外源基因，并统计外源基因在子代植株中的分离比例，获得纯系后用于小麦育种或直接进入安全性实验和区域实验。
实例3、转ZmPIS基因创造棉花优良抗逆育种材料1.棉花无菌苗获得取棉花自交系或优良品种的种子，用浓硫酸脱去表面绒毛，用70％乙醇浸泡1分钟，再用0.1％氯化汞浸泡10-12分钟，然后用无菌水洗涤3-5遍。灭菌期间不断晃动种子，以保证表面灭菌彻底。灭菌后种子放在无菌三角瓶内萌发，瓶内放入少量无菌水(30-40毫升水/250毫升三角瓶)，封口后放在黑暗条件(23-30℃)下1-2天。待种子萌动(露白)后，将其放在铵盐减半的改良MS培养基上于黑暗条件下萌发。待胚轴伸长至3-5厘米时，剥去一片子叶，露出茎端生长锥。
2.农杆菌培养及活化 同实例2。
3.棉花无菌苗转化(1)将菌液涂到用解刨针刺伤的茎尖生长锥上，并用农杆菌浸湿的棉花球覆盖在其上，然后在黑暗中培养2-3天，培养温度为24-26℃。再将无菌苗放在散射光下培养2天。
(2)将照光培养后的无菌苗移栽到上层蛭石下层壤土的花盆中，让植株在自然光照下生长，日温22-28℃，夜温18-23℃，隔天浇灌1/2改良MS培养基无机盐。
4.转化植株筛选与定植转化植株长出3片叶后，喷洒8mg/l绿黄隆(沈阳农药厂生产，有效成分25％)水溶液，以植株掉液滴为宜。未转化的对照植株在喷洒后3天停止生长，12天左右开始死亡。转化植株在喷洒后，一些个体变化同对照植株相似，另一些个体有很强抗性，持续生长。存活植株长到5叶期时，将其定植到田间。
5.抗除草剂植株的分子生物学鉴定抗除草剂植株长到7-8叶时，取叶片提取DNA，采用PCR技术检测外源基因。PCR阳性植株进行Southern blotting检测。在获得的186株抗除草剂PCR阳性植株中，约20％以上(42/200)的植株为转基因个体。
6.转基因植株子代的分子生物学鉴定转基因植株开花后自交或姊妹交结实。种子播种在大田或温室，在植株4-6叶期时取叶片提取DNA，采用PCR技术检测子代植株是否带有外源基因，并统计外源基因在子代分离比例，结果表明，在30％左右(12/38)的转基因株系中，外源基因在子代植株中的分离比例符合孟德尔定律。
7.转基因植株的抗性鉴定和利用取纯合的转基因植株的种子，播种在花盆中，植物2叶期时进行低温处理，通过存活率统计和生理指标测定，筛选出耐冷株系，用于生产。进行砂盆中，用0.7％NaCl水溶液进行连续浇灌30天，将存活小苗移栽到大田，待植株长大后套袋自交结实。对其下一代继续进行分子生物学鉴定和耐盐性检测，并套袋自交纯合，获得了耐盐自交系。该自交系可用于配制玉米耐盐杂交种。
实例4、转ZmPIS正义基因创造大豆耐冷耐旱育种材料1.大豆无菌苗获得取优良品种的种子，用70％乙醇浸泡2-3分钟，用0.1％氯化汞浸泡10-12分钟，然后用无菌水洗涤3-5遍。灭菌期间不断晃动种子，以保证表面灭菌彻底。灭菌后种子放在无菌三角瓶内萌发，瓶内放入少量无菌水(50-60毫升水/250毫升三角瓶)，封口后放在黑暗条件(23-30℃)下2-3天。待种子萌动(露白)后，将其放在改良B5培养基上于黑暗条件下萌发。待胚轴长至3-5厘米时，剥去一片子叶并露出茎端生长锥。
2.农杆菌培养及活化将带有双元载体(Mini-Ti质粒带有除草剂绿黄隆抗性基因als和ZmPIS基因)的根瘤农杆菌(AGL1或LBA4404)在附加抗生素的YEP培养基中28℃下震荡培养，使细菌处于对数生长期。然后3000r/min下离心10分钟，弃上清液。菌体用1/2改良B5液体培养基(即改良B5培养基基本成分减半)洗涤，再离心收集。再将菌体用添加100mg/l乙酰丁香酮的1/2改良B5液体培养基悬浮，稀释5-10倍用于转化。
3.大豆无菌苗转化(1)将菌液倒在4.5厘米直径的培养皿中，倾斜培养皿，使露出茎尖生长锥的无菌苗顶端浸泡在菌液中，在0.5×105Pa大气压下处理3-6分钟。
(2)浸染后的苗顶用无菌滤纸吸干，把小苗根端插入改良B5培养基上于黑暗中培养3-4天，培养温度为22-24℃。
(3)将无菌苗移栽到铺有上层蛭石下层壤土的花盆中，顶部覆盖蛭石，自然光照下生长，日温23-28℃，夜温20-25℃，隔天浇灌1/2改良B5培养基无机盐。
4.转化植株筛选与定植转化植株长出3片叶后，喷洒2.0mg/l(因基因型而不同)绿黄隆(沈阳农药厂生产，有效成分25％)水溶液，以植株掉液滴为宜，未转化的对照植株在喷洒后4天停止生长，15天左右开始死亡。转化植株在喷洒后，一些个体的变化与对照植株相似，另一些个体持续生长，变化不明显。存活植株长到5叶期，将其定植到田间。
5.抗除草剂植株生长到7-8叶时，取叶片提取DNA，采用PCR技术检测外源基因。PCR阳性植株进行Southern blotting检测。在获得的抗除草剂PCR阳性植株中，约20％以上(26/121)的植株为转基因个体。
6.转基因植株后代的分子生物学鉴定和抗逆性测定及利用将转基因植株产生的种子，播种在大田或温室。植株(T1代)3-4叶期时取叶片提取DNA，采用PCR技术检测外源基因，并统计外源基因在子代植株中的分离比例。结果表明，以无菌苗茎尖分生组织为转基因受体组织，能有效获得转基因植株。
将T1代植株产生的种子分别在15℃下萌发，统计出苗率并计算发芽势，筛选出耐冷好的株系。将3叶期植株在10℃下24小时，检测植株受伤害程度，选出耐冷性强的株系。结合萌发期和苗期测定结果，优选出耐冷性比对照显著提高的转基因株系用于育种。
将3叶期T2植株用不同浓度PEG溶液处理，观测植株萎蔫时间及程度，判断不同株系苗期耐渗透胁迫性。将T2植株播种在花盆，待植株开花初期进行干旱胁迫处理，收获时测量植株地上部分生物量和子粒产量，挑选出比未转基因对照植株产量显著提高的株系进行大田种植和综合性状分析。综合耐旱性测定的结果，选出耐旱性优异综合性状好大豆育种材料。
权利要求
1.一种转PIS基因改变植物抗逆性的应用，其特征是，将从植物中克隆的PIS基因以反义或正义形式重组到植物表达载体中，采用转基因技术将重组基因导入植物细胞，获得转基因植株；通过检测转基因表达和对植株进行抗逆性鉴定，从中筛选出抗逆性明显提高或降低的转基因植株及其后代，创造出在植物育种中具有应用前景的新种质和新品种。
2.如权利要求1所述转PIS基因改变植物抗逆性的应用，其特征是，所述PIS基因来自各种植物，有cDNA形式或基因组基因形式，其编码序列以反义形式或正义形式构建成融合基因，并转入植物体内。
3.如权利要求2所述转PIS基因改变植物抗逆性的应用，其特征是，所述用于构建融合基因的PIS基因的反义形式可为基因的全长序列，也可以为部分序列，也可以为根据部分序列人工合成的脱氧多核苷酸。
4.如权利要求1所述转PIS基因改变植物抗逆性的应用，其特征是，所述应用是通过转PIS反义基因或依据PIS基因序列设计的多核苷酸序列获得的抗逆性提高或降低的转基因植株。
5.如权利要求1所述转PIS基因改变植物抗逆性的应用，其特征是，所述应用是通过转PIS基因获得对逆境抗性提高或降低的转基因植株及后代。
6.如权利要求1、4或5所述转PIS基因改变植物抗逆性的应用，其特征是，所述植物抗逆性包括耐旱性、耐盐性、耐涝性、耐冷性、耐热性、耐辐射性、抗旱性、抗盐性、抗辐射性、抗病性、抗虫性、抗除草剂特性之一或组合。
7.如权利要求1所述转PIS基因改变植物抗逆性的应用，其特征是，所述植物包括高等植物、低等植物和藻类。
8.如权利要求7所述转PIS基因改变植物抗逆性的应用，其特征是，所述植物包括各类栽培的草本作物和木本作物、牧草和杂草。
全文摘要
本发明公开一种转PIS(磷脂酰肌醇合成酶)基因改变植物抗逆性的应用，其方法是，将从植物中克隆的PIS基因以反义或正义形式重组到植物表达载体中，采用转基因技术将重组基因导入植物细胞，获得转基因植株；通过检测转基因表达和对植株进行抗逆性鉴定，从中筛选出抗逆性明显提高或降低的转基因植株及其后代，创造出在植物育种中具有应用前景的新种质和新品种。
文档编号C12N15/29GK1769462SQ200510044789
公开日2006年5月10日 申请日期2005年9月22日 优先权日2005年9月22日
发明者张举仁, 杨爱芳, 张可炜, 尹小燕, 谷晓峰 申请人:山东大学