一种植物抗虫剂的制作方法

本发明涉及乙酰度大于或等于60％的几丁寡糖(chitinoligosaccharide,COS)在抵抗食叶类害虫引起的植物虫害中的用途。本发明还涉及一种用于抵抗和/或预防食叶类害虫引起的植物虫害的几丁寡糖组合物。
背景技术：
：在农业上传统使用的抗虫害制剂多为化学农药，存在药效低、毒性残留时间长且严重影响植物的生长环境和牲畜及人的身体健康等诸多缺陷。因此，对高效、低毒、低残留、无环境污染的新型农药存在需求。技术实现要素：一方面，本发明涉及乙酰度大于或等于60％的COS在抵抗和/或预防食叶类害虫引起的植物虫害中的用途。优选地，所述COS的乙酰度大于或等于80％。其中，本发明所述乙酰度大于或等于60％的COS的聚合度为2-30，优选为2-10。所述的食叶类害虫包括但不限于：夜蛾、棉铃虫、跳甲和玉米螟。本发明所述的“几丁寡糖”(chitinoligosaccharide,COS)是聚合度在2-30之间的寡糖混合物，所述寡糖由β-(1，4)-糖苷键连接的寡聚N-乙酰-D-氨基葡萄糖组成。其中，COS可通过将壳寡糖乙酰化、人工合成或任何本领域已知的方法获得。本发明所述的“聚合度”是一种衡量聚合物分子大小的指标，其意为聚合物的组成所包含的重复单元的数目。在本发明中，COS的聚合度为2-30意为所述COS是包含单糖数目为2-30的寡糖的混合物。例如，所述COS可以是包含单糖数目分别为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30的寡糖或其任意组合的混合物。优选地，本发明中使用的COS的聚合度为2-10，即所述COS包含单糖数目分别为2、3、4、5、6、7、8、9或10的寡糖或其任意组合的混合物。本发明所使用的COS具有大于或等于60％的乙酰度，也就是说，本发明中的COS中大于或等于60％的糖单元与乙酰基键合。具体地，本发明使用的COS的乙酰化程度为60％≤乙酰度≤100％，例如，本发明COS乙酰度的下限可以是60％、70％、80％、90％或100％，上限可以是60％、70％、80％、90％或100％，其中所述上限大于或等于所述下限。优选地，本发明使用的COS的乙酰化程度80％≤乙酰度≤100％。本发明乙酰度大于或等于60％的COS可通过下列方法制备并纯化：将壳寡糖溶于水，加入过量的乙酸酐，随后加入DMAP催化剂，在加热条件下进行C2位氨基的选择性乙酰化反应；反应完成后，对反应液离心，取上清液，随后喷雾干燥，进而获得本发明的COS。所述COS的乙酰度可通过VarianMercury400MHz质谱仪在70℃由核磁共振通过1HNMR谱进行鉴定。本发明所述的食叶类害虫是以植物的叶片为食的害虫。其通常取食叶片，常咬成缺口或仅留叶脉，甚至全吃光。具体地，本发明的食叶类害虫包括但不限于：夜蛾、棉铃虫、跳甲和/或玉米螟。在本发明的实施过程中，所述乙酰度大于或等于60％的COS可应用于任何遭受上述虫害的植物，例如：农作物、园林植物、药用植物、食用野生植物等。优选地，所述植物选自：苎麻、棉花、大麻和玉米。壳寡糖是一种与COS类似的寡糖组合物，区别在于其乙酰化程度低。此前的报导指出，将壳寡糖施用至植物后，其可通过抑制昆虫的几丁质酶活性发挥杀灭昆虫的作用。在本发明中，发明人惊讶地发现，与壳寡糖杀灭害虫不同的是，本发明的COS并不是通过杀死害虫，而是通过降低害虫对植物叶片的取食兴趣来实现抗虫效果。本发明的COS取得上述效果的机理可能是其靶向植物叶片上的几丁寡糖受体，进而激活下游的信号通路，诱导植物产生令害虫厌恶的物质，从而实现抗虫。但，本发明并不受上述机理的限定。另一方面，本发明涉及一种用于抵抗和/或预防食叶类害虫引起的植物虫害的几丁寡糖(COS)组合物，其包含：(1)乙酰度大于或等于60％的COS，(2)溶剂，和任选的(3)一种或多种其他农药，其中乙酰度大于或等于60％的COS在所述组合物中占全部COS的50％以上、优选60％以上、更优选70％以上、更优选80％以上、更优选85％以上、更优选90％以上、更优选95％以上、更优选99％以上。所述几丁寡糖组合物中乙酰度大于或等于60％的COS的重量百分比优选为0.0002％(2ppm)以上、更优选为0.001％(10ppm)以上、更优选为0.002％(20ppm)以上。对其上限没有特殊限定，本领域技术人员可以根据需要来选择，例如可以是1％(10000ppm)以下、优选0.1％(1000ppm)以下、更优选0.02％以下(200ppm)。所述溶剂优选为水。所述一种或多种其他农药包括但不限于：除草剂、抗虫剂、杀虫剂、抗菌剂、杀菌剂和/或植物生长调节剂。在具体的实施过程中，本发明提供的组合物可通过本领域已知的任何方法配制。举例来说，本发明所述的组合物可通过将一定量的经制备的乙酰度大于或等于60％的COS溶于一定量的水中获得。本发明还涉及一种植物食叶类害虫的抵抗和/或预防方法，其包括对所述植物施用本发明的COS组合物。在具体的实施过程中，本发明提供的组合物可通过任何多种本领域已知的方法施用至植物。优选地，所述组合物可使用喷雾法向植物进行施用。此外，本发明的组合物还可与其他本领域已知的农药或肥料联合使用。具体地，本文所述组合物在施用过程中可与一种或多种本领域已知的农药或肥料以任意比例混合进而共同或顺序向植物进行施用。即，本发明至少包括下述技术方案：1.乙酰度大于或等于60％的几丁寡糖在抵抗和/或预防食叶类害虫引起的植物虫害中的用途。2.项1的用途，其中所述几丁寡糖的乙酰度大于或等于80％。3.项1或2的用途，其中所述几丁寡糖的聚合度为2-30。4.项1-3任一项的用途，其中所述几丁寡糖的聚合度为2-10。5.项1-4任一项的用途，其中所述食叶类害虫选自：夜蛾、棉铃虫、跳甲和玉米螟。6.项1-5任一项的用途，其中所述植物选自：苎麻、棉花、大麻和玉米。7.一种用于抵抗和/或预防食叶类害虫引起的植物虫害的几丁寡糖组合物，其包含：(1)乙酰度大于或等于60％的几丁寡糖，(2)溶剂，和(3)任选的一种或多种其他农药，所述组合物中,乙酰度大于或等于60％的几丁寡糖占全部几丁寡糖的95重量％以上。8.项7的几丁寡糖组合物，其中，所述溶剂为水。9.项7或8的几丁寡糖组合物，其中，所述一种或多种其他农药包括：除草剂、抗虫剂、杀虫剂、抗菌剂、杀菌剂和/或植物生长调节剂。10.项7～9中任一项所述的几丁寡糖组合物，其中，所述几丁寡糖组合物中，所述乙酰度大于或等于60％的几丁寡糖的含量为0.002重量％以上。11.项7～10中任一项所述的几丁寡糖组合物，其中，所述几丁寡糖的乙酰度大于或等于80％。12.项7～11中任一项所述的几丁寡糖组合物，其中，所述几丁寡糖的聚合度为2-30，优选2-10。13.项7～12中任一项所述的几丁寡糖组合物，其中，所述食叶类害虫选自：夜蛾、棉铃虫、跳甲和玉米螟。14.项7～13中任一项所述的几丁寡糖组合物，其中，所述植物选自：苎麻、棉花、大麻和玉米。15.一种食叶类害虫引起的植物虫害的抵抗和/或预防方法，其包括对植物施用项7-14中任一项所述的几丁寡糖组合物的步骤。16.根据项15所述的抵抗和/或预防方法，其中，所述植物选自：苎麻、棉花、大麻和玉米。还需要说明的是，在本说明书中，“％”如无特殊提及是指重量％。附图说明图1.5小时后苎麻夜蛾对苎麻叶片的取食程度。具体实施方式实施例1乙酰度大于或等于60％的COS抵抗虫害的室内试验(1)苎麻夜蛾的抵抗壳寡糖是一种寡糖组合物，其乙酰化程度低。COS是将壳寡糖乙酰化后得到的聚合度在2-30之间、具有高乙酰度的寡糖。在本实施例中，使用壳寡糖(乙酰度30％以下)作为对照，对不同乙酰度的COS对苎麻夜蛾虫害的抵抗进行了研究。具体实施如下：苎麻夜蛾采自中国农业科学院麻类研究所沅江试验站，为1-2龄幼虫。取回后将其放入养虫缸，用栽培品种“中苎1号”饲喂，选生长一致的4龄幼虫，饥饿5h后用于试验。在实验过程中，使用川苎8号叶片，其中每组剪取直径为1cm的圆形叶片。分别制备壳寡糖(乙酰度小于等于30％)、乙酰度为60-90％聚合度为2-30的COS、乙酰度为80-100％聚合度为2-30的COS以及乙酰度为60-90％聚合度为2-10的COS用于本研究。将上述样品以100ppm的浓度溶于水中，并分别喷洒至不同组的川苎8号叶片上，对照组喷洒相同量的水，每组四叶片。喷洒15天后，分别将4龄苎麻夜蛾幼虫(10只)与各组叶片放入相同的养虫缸，12小时后记录苎麻夜蛾取食情况。随后对各叶片吞食程度进行计算。结果发现，相比壳寡糖和对照，乙酰度为60-90％、80-100％聚合度2-30的COS以及乙酰度为60-90％聚合度为2-10的COS显著降低了苎麻夜蛾啃食苎麻叶片的程度(p≤0.05)，具体结果参见下表1。表1.不同乙酰度的COS抗苎麻夜蛾的效果组叶片平均啃食程度(％)对照组(水)100±4.0壳寡糖(乙酰度为30％以下)55±4.16乙酰度60-90％、聚合度2-30的COS30±4.04乙酰度80-100％、聚合度2-30的COS9.7±5.13乙酰度60-90％、聚合度2-10的COS15.7±3.21之前的报导指出，将壳寡糖施用至植物后，其可通过抑制昆虫的几丁质酶活性发挥杀灭昆虫的作用。在本申请中，申请人惊讶地发现，与壳寡糖杀灭害虫不同的是，本发明的COS并不直接杀死害虫，而是通过降低害虫对植物叶片的取食兴趣来实现抗虫效果，如图1所示，将喷洒相同量的水、乙酰度30％以下的壳寡糖和乙酰度60-90％、聚合度2-30的COS的叶片放入同一培养皿后，虫子更倾向于啃食水和壳寡糖组的叶片。此外，与壳寡糖不同的是，本发明的COS并未杀死害虫，表2显示了100ppm的不同乙酰度的壳寡糖和COS对害虫的致死效果。本发明的COS取得上述效果的机理可能是其靶向植物叶片上的几丁寡糖受体，进而激活下游的信号通路，诱导植物产生令害虫厌恶的物质，从而实现抗虫。表2.施用壳寡糖和本发明的COS后苎麻夜蛾的平均致死率(％)(2)棉铃虫和甘蓝夜蛾的抵抗在本实施例中，研究了100ppm的乙酰度为60-90％聚合度为2-30的COS对棉花虫害棉铃虫和甘蓝虫害甘蓝夜蛾的抵抗效果。结果显示，乙酰度60-90％的COS降低了棉铃虫和甘蓝夜蛾的危害程度，具体结果如表3和4所示。表3.本发明的COS抗棉铃虫的效果组叶片平均啃食程度(％)对照组(水)100乙酰度60-90％、聚合度2-30的COS4.3±1.32表4.本发明的COS抗甘蓝夜蛾的效果组叶片平均啃食程度(％)对照组(水)100乙酰度60-90％、聚合度2-30的COS20.3±6.11实施例2乙酰度大于或等于60％的COS抵抗虫害的田间效果(1)苎麻夜蛾的田间效果本研究中，以清水为无处理对照、田间实验选择中苎1号，待苎麻生长至15-25cm高时，将清水、20ppm、100ppm和200ppm的乙酰度大于或等于60％的COS水溶液喷洒至苎麻田，每个处理面积为9m2，每个处理重复3次。苎麻夜蛾采用半人工释放：取同一天化蛹的苎麻夜蛾按照每4个处理放2对蛹，待苎麻夜蛾羽化后自行选择产卵，苎麻夜蛾幼虫危害2周后调查记录危害情况。危害程度为取食面积占总叶面积的比率。实验结果表明，本发明的COS组合物可以显著降低苎麻夜蛾在田间危害程度(p≤0.05)，具体结果如下表5：表5.不同浓度的本发明的COS对苎麻夜蛾抵抗的田间效果组危害程度(％)对照组(水)55.42±6.5720ppm乙酰度60-90％、聚合度2-30的COS31.62±4.66100ppm乙酰度60-90％、聚合度2-30的COS8.38±5.34200ppm乙酰度60-90％、聚合度2-30的COS19.05±7.2(2)跳甲、玉米螟的田间效果本研究中，以清水为无处理对照、田间实验选择肇州大麻和玉米，将200ppm的COS水溶液喷洒至上述植物，每个处理重复3次，常规管理，保证植物的正常生长。待大麻跳甲、玉米螟发生期，大麻跳甲、玉米螟的防治效果调查采用五点取样，每点在施药前后定点调查2株，共10株，记录并计算防治效果。实验结果表明，本发明的COS组合物可显著降低大麻跳甲、玉米螟在田间危害程度(p≤0.05)。表5.本发明的COS对大麻跳甲抵抗的田间效果组危害程度(％)对照组(水)56.54±7200ppm乙酰度60-90％、聚合度2-30的COS19.01±8.55表6.本发明的COS对玉米螟抵抗的田间效果组危害程度(％)对照组(水)61.43±7.11200ppm乙酰度60-90％、聚合度2-30的COS24.81±10.32当前第1页1 2 3