一种培育转基因高铜积累植物的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及一种培育转基因高铜积累及强铜抗性植物的方 法。
【背景技术】
[0002] 人类文明高度发展的今天，环境问题越来越受到人们的关注，其中重金属引起的 土壤污染也日益成为科学家们研究的热点问题。土壤被重金属污染后，不仅直接影响作物 产量和品质，还会通过食物链进入人体，严重影响人体健康和安全。
[0003] 随着现代工农业的发展，铜已经成为了我国重金属污染土壤中主要的污染元素之 一。环境中的铜主要来源于两个方面，一是自然本身，二是人类活动。地壳运动、火山喷发以 及岩石风化等自然活动使大量的铜进入土壤和水体环境中，成为可被生物利用的形式。人 类活动主要包括铜矿的大规模开采、冶炼产生的工业"三废"，含铜农药和化肥的过量使用 以及城市生活垃圾的不当处理等。铜矿蕴藏丰富，人类开采铜矿的历史悠久，并且铜的化学 性质不活泼，被广泛应用于现代工业，制造业和生活的许多方面。铜矿在开采和冶炼过程中 会对当地的土壤和水体造成严重的污染。
[0004] 在清除铜污染的实践中，传统的物理化学方法主要是通过土壤本身的物理化学性 质，通过电动修复、改土法、淋洗法等清除土壤中的铜，或者向土壤中投入改良剂如羟基磷 灰石等来降低土壤中的有效铜含量。这些方法有的费用高，易破坏土壤结构，不易操作，没 有从根本上将铜从被污染环境中清除。这些缺点阻碍了上述方法的大规模应用。
[0005] 与传统的环境修复技术相比，植物修复具有成本低，环境友好，效果永久，一般无 二次污染等优点，是从根本上解决重金属污染问题的重要手段。近年来，植物修复技术以其 自身的优势成为重金属污染修复的研究热点，但其实施依赖于理想的超富集植物。通过基 因工程等技术发现和鉴定超富集相关基因并研发新型超富集植物是植物修复技术发展的 关键环节。
【发明内容】
[0006] 本发明的第一个目的是提供一种来自大肠杆菌的CusF蛋白，或其融合蛋白的新 用途。
[0007] 本发明所提供的新用途，具体为蛋白质、所述蛋白质的编码基因，或含有所述编码 基因的重组载体在如下al) _a4)任一中的应用：
[0008] al)调控植物的抗铜性；a2)调控植物对铜的积累；a3)选育抗铜性增强的植物品 种；a4)选育对铜的积累量增高的植物品种；
[0009] 所述蛋白质为如下（I) - (IV)中任一种：
[0010] (I)由序列表中序列1或序列1的第22-110位所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (11) 由序列表中序列2或序列2的第1-113位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（III)由 序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（IV)由序列表中序列4所示的氨基酸序 列组成的蛋白质，或由序列4缺失第116-354位后所形成的蛋白质。
[0011] 其中，由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质命名为CusF前体蛋白， 序列1的第1-21位为信号肽序列，第22-110位为CusF成熟蛋白的序列。由序列表中序列 2所示的氨基酸序列组成的蛋白质命名为SP-CusF-GFP蛋白，序列2的第1-24位为菜豆素 信号肽（SP)的序列，第25-113位为CusF成熟蛋白的序列，第116-354位为GFP蛋白的序 列。由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质命名为GFP-CusF蛋白，序列3的第 1-239位为GFP的序列，第242-330位为CusF成熟蛋白的序列。由序列表中序列4所示的 氨基酸序列组成的蛋白质命名为SP-CusF-GFP-AFVY蛋白，序列4的第1-24位为菜豆素信 号肽（SP)的序列，第25-113位为CusF成熟蛋白的序列，第116-354位为GFP蛋白的序列， 第355-358位为液泡分选序列AFVY。
[0012] 在本发明中，以上al)中的所述调控植物的抗铜性具体体现在：促进所述蛋白质 或其编码基因的表达，则所述植物的抗铜性增强。以上a2)中的所述调控植物对铜的积累具 体体现在：促进所述蛋白质或其编码基因的表达，则所述植物调控植物对铜的积累量增高。 以上a3)中的所述选育抗铜性增强的植物品种的方法，以及以上a4)中的所述选育对铜的 积累量增高的植物品种的方法，均具体可包括将所述蛋白质或其编码基因的表达量较高的 植株作为亲本进行杂交的步骤。
[0013] 本发明的第二个目的是提供一种培育抗铜性增强和/或对铜的积累量增高的转 基因植物的方法。
[0014] 本发明所提供的培育抗铜性增强和/或对铜的积累量增高的转基因植物的方法， 包括如下步骤：
[0015] a)向目的植物中导入蛋白质的编码基因，得到表达所述编码基因的转基因植物； [0016] b)从步骤a)所得转基因植物中得到与所述目的植物相比，抗铜性增强和/或对铜 的积累量增高的转基因植物；
[0017] 所述蛋白质为如下（I) - (IV)中任一种：
[0018] (I)由序列表中序列1或序列1的第22-110位所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (II)由序列表中序列2或序列2的第1-113位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（III)由 序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（IV)由序列表中序列4所示的氨基酸序 列组成的蛋白质，或由序列4缺失第116-354位后所形成的蛋白质。
[0019] 在上述的应用或方法中，所述蛋白质的编码基因，是如下1)至6)中任一所述的 DNA分子：
[0020] 1)序列表中序列5或序列5的第64-333位所示的DNA分子；2)序列表中序列6 或序列6的第1-339位所不的DNA分子；3)序列表中序列7所不的DNA分子；4)序列表中 序列8所示的DNA分子，或由序列8缺失第346-1062位后所形成的DNA分子。5)在严格条 件下与1) -4)任一限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质的DNA分子；6)与1) -5)任一 限定的DNA分子具有90%以上同源性且编码所述蛋白质的DNA分子。
[0021] 上述严格条件可为用6XSSC，0. 5%SDS的溶液，在65°C下杂交，然后用2XSSC， 0· 1%SDS 和 I X SSC，(λ 1%SDS 各洗膜一次。
[0022] 其中，序列5由333个核苷酸组成，编码所述CusF前体蛋白，序列5的第1-63位编 码信号肽，第64-333位为所述CusF成熟蛋白的编码序列。序列6由1065个核苷酸组成，编 码所述SP-CusF-GFP蛋白，序列6的第1-72位编码所述菜豆素信号肽（SP)，第73-339位为 所述CusF成熟蛋白的编码序列，第346-1065位为所述GFP蛋白的编码序列。序列7由993 个核苷酸组成，编码所述GFP-CusF蛋白，序列7的第1-717位为所述GFP蛋白的编码序列， 第724-993位为所述CusF成熟蛋白的编码序列。序列8由1077个核苷酸组成，编码所述 SP-CusF-GFP-AFVY蛋白，序列8的第1-72位编码所述菜豆素信号肽（SP)，第73-339位为 所述CusF成熟蛋白的编码序列，第346-1062位为所述GFP蛋白的编码序列，第1063-1077 位为所述液泡分选序列AFVY的编码序列。
[0023] 在所述方法中，所述编码基因是通过含有所述蛋白质的编码基因的重组表达载体 导入所述目的植物中的。
[0024] 所述重组表达载体可用现有的植物表达载体构建。所述植物表达载体包括双元农 杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如PCAMBIA3301、pCAMBIA2300、pCAMBIA2301、 pCAMBIA1300、pCAMBIA1301、pWM101、pGreen0029、pBI121、pBinl9、pCAMBIA1301-UbiN 等或 其它衍生植物表达载体。所述植物表达载体还可包含外源基因的3'端非翻译区域，即包含 聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引 导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3'端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始 核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，例如花椰菜花叶病 毒（CAMV) 35S启动子、泛素基因 Ubiquitin启动子（pUbi)、胁迫诱导型启动子Rd29A等，它 们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载 体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密 码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确 翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。 翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行 鉴定及筛选，可对所用重组表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色 变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。也 可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
[0025] 在本发明中，所述重组表达载体中启动所述编码基因转录的启动子为35S启动 子，具体为花椰菜花叶病毒（CAMV) 35S启动子。
[0026] 更为具体的，所述重组表达载体为将所述编码基因插入到PCAMBIA1301-N-GFP载 体或PCAMBIA2300-C-GFP载体的多克隆位点后得到的重组质粒。在该重组表达载体中，启 动所述编码基因转录的启动子为所述花椰菜花叶病毒（CAMV) 35S启动子。
[0027] 在上述方法的步骤a)中，所述"向目的植物中导入蛋白质的编码基因，得到表达所 述编码基因的转基因植物"，其中，所述编码基因可为特异性表达于所述转基因植物的细胞 壁、液泡或细胞质。
[0028] 在本发明中，所述重组表达载体具体为如下中的任一个：
[0029] (al)将序列6的第1-339位所示的DNA片段插入到pCAMBIA1301-N-GFP载体的酶 切位点Xba I和Kpn I之间后得到的重组质粒(命名为CusFew-GFP,细胞壁特异性表达)。
[0030] (a2)将序列7的第724-993位所示的DNA片段插入到pCAMBIA2300-C-GFP载体 的酶切位点BamHI和Pst I之间后得到的重组质粒(命名为GFP-CusFeyt。，细胞质特异性表 达)。
[0031] (a3)将序列8的第346-1077位所示的DNA片段插入到所述CusFew-GFP载体的酶 切位点Kpn I和Sac I之间后得到的重组质粒(命名为CusFvac;-GFP，液泡特异性表达)。
[0032] 其中，所述pCAMBIA1301-N-GFP载体按照如下方法制备得到：用Hind III和EcoRI 双酶切P221-GFP载体，回收大小为1460bp的目的条带(含GFP的表达框)，将其与经过同样 双酶切的PCAMBIA1301载体的骨架片段相连，得到的重组载体即为pCAMBIA1301-N-GFP载 体。
[0033] 所述PCAMBIA2300-C-GFP载体按照如下方法制备得到：以p221-GFP载体为模板， 用引物2300-GFP-F和引物2300-GFP-R进行PCR扩增，将所得PCR产物用限制性内切酶Kpn I和BamH I进行双酶切，回收大小为1460bp的目的条带(含GFP的表达框)，将其与经过同 样双酶切的PCAMBIA2300载体的骨架片段相连，得到的重组载体即为pCAMBIA2300-C-GFP 载体。
[0034] 2300-GFP-F :5, -TAggtaccATGGTGAGCAAGGGCGAGGA~3,；
[0035] 2300-GFP-R : 5 ' -GCGGATCCCTTGTACAGCTCGTCCATGC-3'。
[0036] 在上述方法中，将携带有所述编码基因的所述重组表达载体导入所述目的植物， 具体可为：通过农杆菌介导法、基因枪法、电击法、花粉管导入法、脂质体融合法以及其他任 意可将质粒导入的方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织