专利名称：一种修饰的山羊防御素基因及制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种修饰的山羊防御素基因，还涉及一种修饰的山羊防御素，还涉及一种修饰的山羊防御素的制备方法，还涉及一种修饰的山羊防御素在抑制细菌生长上的应用。
背景技术：
防御素是广泛存在于动物、植物和昆虫等生物体中的小肽，目前已经分离鉴定的生物防御素已经超过100种。防御素是一类小的阳离子抗菌肽，大约由21 45个氨基酸残基组成，分子量为3 6kD。大多数防御素分子内含有6 8个保守的半胱氨酸残基，形成三对或四对分子内二硫键，并通过分子内二硫键形成一个β_折叠片状结构。富含精氨酸，分子在中性溶液中带正电荷，具有高效、广谱抗菌活性，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌(念珠菌属、隐球菌属、曲霉)、被膜病毒(艾滋病病毒)等具有一定的杀灭效果，并且不会使微生物产生耐药性，对正常动物的细胞表现出非特异性的细胞毒害作用。山羊生殖道系统疾病对山羊生产具有较大的危害，目前普遍采用抗生素进行治疗。由于大量使用抗生素，在山羊机体内可能产生耐药菌株而使治疗失败；同时，大量抗生素还可能对羊肉、羊奶等羊产品造成污染而影响食品安全。防御素是小分子肽类，具有广谱抗菌活性，由于其特殊的抗菌机制，机体对其不产生耐药性，可以解决细菌耐药性问题，是新一代抗菌素。天然防御素在动植物体中含量很少，提取分离的成本费用也很高，这就制约了防御素工业化生产和在畜禽疾病中的应用，因此通过基因工程的方法大量生产防御素，获得足够的、有活性的防御素成了研究热点。目前许多实验通过基因工程的方法，成功地将防御素基因导入到各种生物体中并得到良好表达，比如人类防御素、猪防御素、牛防御素等都是将防御素基因导入到真核表达载体中并得到表达并申请专利，表达出的防御素具有较好的生物学活性。目前尚未有对山羊防御素进行基因工程方法大量制备的公开报道。
发明内容
本发明的一个目的是在于提供了一种修饰的山羊防御素基因，根据防御素序列(GenBank:DQ532360.1),针对毕赤酵母密码子偏好性对其进行修饰，获得了一种优化了的山羊防御素基因，其序列为SEQ ID N0.1所示。本发明还有一个目的是在于提供了一种修饰的山羊防御素，其氨基酸序列为SEQID N0.2所示，其活性优于天然防御素，成本低廉，价格实惠，性价比高。可替代传统的抗生素及一些化学性的防腐剂，对食品安全及临床治疗具有重要的意义。本发明还有一个目 的是在于提供了一种修饰的山羊防御素的制备方法，方法简单，易行，适于大规模生产。本发明最后一个目的是提供了一种修饰的山羊防御素在抑制细菌生长上的应用，通过对鲜肉进行防御素蛋白液的处理，极大的提高了肉类的保鲜时间。温度越低保鲜时间越长。为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施:1.修饰的山羊防御素基因的获得:根据山羊防御素基因(GenBank:DQ532360.1)，针对毕赤酵母密码子偏好性对其进行修饰，获得了一种优化了的山羊防御素基因，其序列为SEQ ID N0.1所示。设计含有部分互补序列的引物，在引物两端设计EcoR I和Not I两个限制性内酶切位点，通过重叠PCR的方法扩增得到完整的经过修饰的GBD-1基因。
权利要求
1.一种人工合成的修饰的山羊防御素基因，其序列为SEQ ID N0.1所示。
2.一种修饰的山羊防御素，其序列为SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列。
3.权利要求2所述的一种修饰的山羊防御素的制备方法，其步骤是: .1)GBD-1基因的PCR扩增:引物1、2、3互为模板和引物进行PCR，反应体系为:引物1、.2、3 分别加入 2 μ L> I μ L、2 μ L, 2.5 mM dNTPs 3.5 μ L, 10 Y^EasyTaq Buffer 5 μ L,EasyTaq DNA Polymerase I μ L,补无菌双蒸水至 50 μ L ； 扩增条件:94 °C预变性 4 min ；94 V 30 s，62 V 30 s，72 V 30 s，32个循环；72°C充分延伸10 min ； PCR产物经2 %质量体积比的琼脂糖凝胶电泳后，用DNA凝胶纯化回收试剂盒回收目的片段，编号为1-2-3 ； 引物1、1-2-3、4再互为模板和引物进行PCR，反应体系为:引物1、1-2-3、4分别加入.2 μ L> I μ L、2 μ L, 2.5 mM dNTPs 3.5 μ L, 10 Y^EasyTaq Buffer 5 μ L, EasyTaq DNAPolymerase I μ L,补无菌双蒸水至50 μ L ； 扩增条件:94 °C预变性 4 min ；94 V 30 s，62 V 30 s，72 V 30 s，32 个循环；72°C充分延伸10 min ； PCR产物经2.0 %质量体积比的琼脂糖凝胶电泳后，用DNA凝胶纯化回收试剂盒回收目的片段，该目的片段即为修饰的山羊防御素目的序列； 所述的引物为:1:ACTGAATTCATGAGTCGTCGAAGCTGCCATAGGAATAAAGGCGTCTGTGCT2: CTGTCTCATGTTTCTAGGGCATCTGGTCAGAGCACAGACGCCTTT3:AACTGGGGGACCGAAACAGGTGCCAATCTGTCTCATGTTTCT4:CAGGCGGCCGCCTTCTTTCTGCAGCATTTAACTGGGGGACCGAA ； 2)重组表达质粒的构建与鉴定: 将测序正确的目的片段和PPICZ a A表达载体分别用EcoR I和Not I进行双酶切，酶切之后用T4 DNA连接酶进行连接，构建重组表达质粒pPICZ a A/GBD-1 ;将重组表达质粒在含有Zeocin的LB培养基中培养、筛选，用小量提取试剂盒提取质粒，进行双酶切，并将重组表达质粒pPICZ a A/GBD-1测序，测序正确的，为重组表达质粒pPICZ a A/GBD-1 ； 3)重组质粒的转化: 将鉴定好的重组表达质粒pPICZ a A/GBD-1用Sac I线性化，转化感受态毕赤酵母中，利用电转仪进行电转，同时转化pPICZ a A空载体作为对照；电转后涂布于含有Zeocin的YPD平板中，30°C培养至有单菌落出现，将单菌落接种到含有Zeocin的YPD液体培养基中进一步培养，取部分菌落，提取酵母基因组DNA，并利用载体特异引物5’AOX和3’ AOX进行PCR鉴定，并测序；5’ AOX: GACTGGTTCCAATTGACAAGC3’ AOX: GCAAATGGCATTCTGACATCC ； .4)重组酵母的诱导表达: 将步骤3)中获得的阳性重组质粒接种到BMGY培养液中活化15h，离心，去上清，沉淀用BMMY培养液悬浮后诱导， 每24h加甲醇至终浓度为l%，84h后Iml菌液两管，离心留上清，-20°C保存。
4.权利要求2所述的山羊防御素在抑制大肠杆菌生长上的应用。
5.权利要求2所述的山羊防御素在抑制金黄色葡萄球菌生长上的应用。
6.权利要求2所述的山羊防御素在抑制肺炎链球菌生长上的应用。
7.权利要求2所述的山羊防御素`在猪肉保鲜上的应用。
全文摘要
本发明公开了一种修饰的山羊防御素基因及制备方法和应用，针对毕赤酵母密码子偏好性对其进行修饰，获得了一种优化了的山羊防御素基因，将目的基因连入pPICZαA表达载体，获得重组表达质粒pPICZαA/GBD-1，再将该质粒转入毕赤酵母，经诱导得到了一种优化了的山羊防御素，方法简单，易行，适于大规模生产，获得的山羊防御素其活性优于天然防御素，成本低廉，价格实惠，性价比高。可替代传统的抗生素及一些化学性的防腐剂，对食品安全及临床治疗具有重要的意义。
文档编号C12N15/12GK103103196SQ201310042508
公开日2013年5月15日 申请日期2013年2月4日 优先权日2013年2月4日
发明者刘桂琼, 姜勋平, 刘胜敏, 康建锋 申请人:华中农业大学