山羊IGFBP3基因cDNA编码序列克隆的方法
【专利摘要】本发明公开了一种山羊IGFBP3基因cDNA编码序列克隆的方法，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，包括以下步骤：A1、提取山羊背最长肌组织中的总RNA，然后将总RNA反转录成cDNA；A2、引物的设计和PCR扩增：以绵羊该基因的序列为模板在起始密码子上游区域和终止密码子的下游区域设计引物，设计的引物为：正向引物：5'AGCTCGCTGCCGCCCAGT3'，反向引物：5'GCTGATCATGTCCTTGGCAG3'；A3、PCR产物的纯化回收；A4、克隆。本发明提供了一种简捷的获取山羊IGFBP3基因cDNA编码序列的方法，为进一步研究该基因在山羊生长发育过程的作用奠定了基础。
【专利说明】山羊IGFBP3基因 cDNA编码序列克隆的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及动物基因工程【技术领域】，更具体地说涉及一种从山羊肌肉组织中克隆 IGFBP3 (Insulin-like growth factor binding protein 3)基因 cDNA 编码区序列的方 法。
【背景技术】
[0002] 胰岛素样生长因子结合蛋白（IGFBPs)作为胰岛素样生长因子系统的一员，其与 胰岛素样生长因子（IGFs)之间是一个复杂的生长调节轴=IGFBPs与IGFs和酸敏感亚单元 (ALS)结合形成三元复合物来运载IGFs，而且通过IGFBPs不同的亲和力与IGFs结合以调 节游离IGFs的生物学活性，IGFBP-3是血液中浓度最高的胰岛素样生长因子结合蛋白，同 时也是血清IGFs的主要载体，IGFBP-3主要和IGF- I结合，有助于维持IGF-I的生物利用 度，保证IGF-I的生物功效。因此IGFBP3基因在动物的生长、发育和代谢过程中起着重要 的作用。
[0003] RT-PCR克隆：是将RNA的反转录（RT)和CDNA的聚合酶链式反应以及分子克隆相 结合的一种技术。首先利用反转录酶将RNA反转录成cDNA，再以cDNA为模板，扩增我们需要 的目的基因片段，然后将此片段与载体连接转化到感受态细胞中进行克隆，获得的质粒PCR 产物进行测序。此技术利用PCR技术能在体外进行有效的基因扩增，而不需要内切酶消化 和连接酶处理，能够快速获得其它依靠限制性内切酶消化法难于得到的PCR产物；同时该 方法能克服普通PCR产物测序引物近端的十几个碱基无法测序获得的缺点。与RACE (cDNA 末端快速扩增）技术相比较而言，目的基因片段的长度明确，成本较低，工作量小。该技术 的关键是PCR引物的设计，在起始密码子的上游设计正向引物，在终止密码子的下游设计 反向引物，使得PCR产物能包含完整的基因编码区全序列。
[0004] 分段PCR克隆法：将目的基因分成几个片段来分别克隆，然后再通过亚克隆测序 将其拼接起来，此方法成本较高，耗时多且工作量大，一个基因分成几段就需要做几次克 隆，然后再进行序列拼接。
[0005] 获得目的基因编码区序列一般采用克隆或RACE技术，RACE技术是基于PCR技术 基础上由已知的一段cDNA片段，通过向两端延伸扩增从而获得完整的3'端和5'端。但该 技术与克隆技术相比，目的基因片段的长度不明确，试验成本高，工作量大，对于提取的RNA 质量要求较高，因此应用相对较少。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种山羊IGFBP3基因 cDNA编码序列克隆的方法。填补在山羊上该基因研究的空白，为进一步研究其在山羊上的 功能奠定基础。
[0007] 本发明采用以下技术方案： 山羊IGFBP3基因 cDNA编码序列克隆的方法，包括以下步骤： AU从山羊背最长肌组织中提取总RNA，然后将总RNA反转录成cDNA ; A2 :以绵羊该基因的序列为模板在起始密码子上游区域和终止密码子的下游区域设计 引物； A3 :以cDNA为模板进行PCR扩增； A4 :扩增产物的胶回收和纯化； A5 :纯化的产物进行克隆与测序，即能得到山羊IGFBP3基因 cDNA编码序列。
[0008] 所述的方法，步骤Al包括以下步骤：取用液氮研磨好的组织粉末约80mg，加入预 先盛有ImL Trizol的EP管中，振荡混匀后，室温静置5min ;加氯仿0. 2mL(必须按总体积 的1/5)，旋涡仪振荡混匀15s，室温静置5min ;4°C下12000rpm离心15min ;转移上层水相 45〇μ?于另一个新的I. 5mLEP管中，加入等体积异丙醇，颠倒混匀后室温静置IOmin ;4°C下 12000rpm离心IOmin ;弃去上层清液后，加入4°C预冷的75%乙醇(用DEPC处理水配制)lmL， 静置5min，4°C下7500g离心5min ;弃上清，用枪吸取多余的液体，空气干燥约3min ;加入 3〇μ? DEPC处理水，吹打混匀，充分溶解RNA，然后立即反转录成cDNA。
[0009] 所述的方法，步骤A2中引物为SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4。
【专利附图】
【附图说明】
[0010] 图1是山羊IGFBP3基因的PCR产物电泳图。
[0011] 图2是山羊IGFBP3基因编码区的核苷酸序列和对应的氨基酸序列。
【具体实施方式】
[0012] 以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
[0013] 具体实施步骤： 1、组织样的采集 选取出生后120d的南江黄羊进行宰杀，取其背最长肌组织样品后迅速置于液氮中保 存待用。
[0014] 2、总RNA的提取和cDNA的合成 (1) 取用液氮研磨好的组织粉末80mg，加入预先盛有ImL Trizol的EP管中，振荡混勻 后，室温静直5min ; (2) 加氯仿0. 2mL(必须按总体积的1/5)，旋涡仪振荡混匀15秒，室温静置5min ; (3) 4°C下 12000rpm 离心 15min ; (4) 转移上层水相45〇μ?于另一个新的I. 5mLEP管中，加入等体积异丙醇，颠倒混匀后 室温静置IOmin ; (5) 4?下 12000rpm 离心 IOmin ; (6) 弃去上层清液后，加入4°C预冷的75%乙醇(用DEPC处理水配制）lmL，静置5min， (7) 4°C下 7500g 离心 5min ; (8) 弃上清，用枪吸取多余的液体，空气干燥约3min ;加入3〇μ? DEPC处理水，吹打混 匀，充分溶解RNA。
[0015] (9)用1%的琼脂糖凝胶电泳法检测总RNA的质量，效果好的立即反转录成cDNA。
[0016] 3、目的基因片段的扩增 (1) 引物的设计：根据GenBank数据库中公布的绵羊（6￥i5· aries )的IGFBP3 (NM_001134302)基因序列，采用Primer Premier 5. O软件设计引物，设计的引物为： 正向引物：5' AGCTCGCTGCCGCCCAGT 3' 反向引物：5' GCTGATCATGTCCTTGGCAG 3' (2) PCR的反应体系和条件：反应体系（25μυ :0.25 μ?的TaKaRa Taq酶，12. 5 μ?的 2XGC Buffer I，4 μ? 的 dNTP Mixture，正反向引物各 0.5 μ?，6.25 μ? 的灭菌 CldH2O，模板 cDNA 1 μ?。反应条件为 95°C 预变性 4 min，35 个循环（94°C，45 s;53.4°C，30 s;72°C，90 s)，最后72°C 7 min ;PCR产物用I. 5%的琼脂糖凝胶进行电泳检测。
[0017] 4、PCR产物的回收和纯化 PCR产物用上海生工UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒纯化回收，具体步骤为： (1)通过1. 5%的琼脂糖凝胶电泳将目的DNA片段与其它DNA尽可能分开，然后用干净 的手术刀将含有目的DNA片段的琼脂糖凝胶块切下，放入I. 5 mL离心管中。
[0018] (2)称量凝胶的重量，根据胶块的重量和浓度，按每IOOmg琼脂糖加40〇μ?的比例 加入 Binding Buffer II。
[0019] (3)将离心管置于55 °C金属恒温浴中5~10 min，间或混匀，直至胶块完全溶化。
[0020] (4)(可选步骤)当目的片段<500bp时，加入所使用的Binding Buffer II 1/3体 积的异丙醇混匀。当目的片段>500bp时，此步骤可以省略，直接进行步骤（5)。
[0021] (5)将溶化的胶溶液转移到套放在2ml收集管内的UNIQ-10柱中，室温放置2 min。 8000 rpm室温离心I min。
[0022] (6)取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一个收集管中，力口 入 500 KL Wash Solution，10000 rpm 室温离心 I min。
[0023] (7)重复步骤（6) -次。
[0024] (8)取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一个收集管中， 12000 rpm 室温离心 2 min。
[0025] (9)将UNIQ-10柱放入一新的I. 5 mL离心管中，在吸附膜中央加30 μ? Elution Buffer,室温放置1?2 min。12000 rpm室温离心I min,离心管中的液体即为回收的DNA片 段。
[0026] (10)取收集的DNA 2μ?，1. 5%琼脂糖凝胶电泳，检测回收的DNA质量。
[0027] 4、产物的克隆 (1)目的片段与载体连接 将胶回收产物与PMD19-T载体连接。将载体在冰上融化，短暂离心装有载体的离心管， 以免液体挂在管壁上。在超净操作台上按照如下体系配置连接液：
【权利要求】
1. 山羊IGFBP3基因 cDNA编码序列克隆的方法，其特征在于，包括以下步骤： 步骤一：从山羊肌肉组织样品中提取总RNA，然后将总RNA反转录成cDNA ; 步骤二：扩增引物的设计及PCR反应：以绵羊该基因的序列为模板在起始密码子上游 区域和终止密码子的下游区域设计引物；设计的引物为： 正向引物：5' AGCTCGCTGCCGCCCAGT3' 反向引物：5' GCTGATCATGTCCTTGGCAG3' 用cDNA为模板先进行梯度PCR反应，退火温度范围选择50°C到60°C共8个温度点，优 化普通PCR的条件。 2. PCR反应体系为 25μ?体系：0.25 μ? 的 TaKaRa Taq酶，12.5 μ? 的 2XGC Bufferll， 4 μ? 的 dNTP Mixture，正反向引物各 0.5 μ?，6·25 μ? 的灭菌 ddH20，模板 cDNA 1 μ?。
3. 反应条件为 95°C预变性 4 min，35 个循环（94°C，45 s;53.4°C，30 s;72°C，90 s)， 最后 72°C 7 min ; 步骤三：扩增产物的回收和纯化； 步骤四：纯化的产物进行克隆与测序，得到882bp的核苷酸序列，如序列表SEQ ID NO: 1所示，即为山羊IGFBP3基因的编码区全序列。
【文档编号】C12N15/10GK104293766SQ201310294920
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2013年7月15日 优先权日:2013年7月15日
【发明者】占思远, 张红平, 李利, 王林杰, 仲涛 申请人:四川农业大学